CN111228486B - 一种羰基化聚己内酯基光动力治疗前药及制备方法与应用 - Google Patents

一种羰基化聚己内酯基光动力治疗前药及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羰基化聚己内酯基光动力治疗前药，结构如下所示：
Figure DDA0002362333340000011
式中，x＝10～40,y＝10～40。本发明的羰基化聚己内酯基光动力治疗前药为两亲性聚合物，可以制备成胶束，细胞实验证明，与纯5‑氨基酮戊酸相比较，该前药胶束转化为原卟啉的量更高，对肿瘤细胞的杀伤性更好，本发明采用化学接枝的方法将5‑氨基酮戊酸接入功能化聚己内酯中，实现了5‑氨基酮戊酸的酯化，提高了5‑氨基酮戊酸的脂溶性及稳定性，具有更好的靶向性，更高的转化率以及更好的光动力疗效。

Description

一种羰基化聚己内酯基光动力治疗前药及制备方法与应用
技术领域
本发明属于羰基化聚己内酯基光动力治疗前药，特别涉及一种羰基化聚己内酯基光动力治疗前药及制备方法与应用。
背景技术
光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)是利用光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种新技术。5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid，ALA)是近年来开发的第二代卟啉类光敏剂。ALA在细胞内被吸收并转换成具有强光敏作用的原卟啉IX(PpIX)，PpIX经特定波长的光照激活后发生光动力学反应，生成具有杀伤细胞作用的单态氧，从而杀死肿瘤细胞。作为首个被美国食品与药物管理局(FDA)批准用于局部PDT的光敏剂前体药物，ALA已在临床上得到了广泛的运用。但是ALA是一种亲水性的两性离子，脂溶性差，在生理pH下不稳定，不利于其进一步转化为PpIX，这些缺点极大地限制了其在光动力治疗方面的应用。
聚(ε-己内酯)(PCL)是一类具有良好生物相容性的可生物降解生物医用高分子材料，已通过了FDA认证，是重要的组织工程材料和药物控释载体。通过对ε-己内酯的官能团化，引入反应性活性官能团便于对聚酯进行进一步的化学和生物学修饰，有利于拓宽聚酯材料的生物医用领域。
综上，将PCL与ALA相结合，制备出羰基化聚己内酯基光动力治疗前药，有利于提高ALA的稳定性、提高其转化为PpIX的能力，有利于提高光动力治疗的效果。
发明内容
为了克服ALA脂溶性差、不稳定等缺陷，本发明的目的是提供一种羰基化聚己内酯基光动力治疗前药，可以提高ALA转化为PpIX的量，可以提高对肿瘤细胞的杀伤性，进而提高光动力治疗的效果。
本发明的第二个目的是提供一种所述羰基化聚己内酯基光动力治疗前药的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种所述羰基化聚己内酯基光动力治疗前药在制备抗癌药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面提供了一种羰基化聚己内酯基光动力治疗前药，结构如下所示：
Figure BDA0002362333320000021
x＝10～40,y＝10～40。
本发明的第二个方面提供了一种所述羰基化聚己内酯基光动力治疗前药的制备方法，包括以下步骤：
将摩尔比为1:(2～5)的聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)和羟乙肼加入到甲醇和氯仿的混合溶液中，室温下反应，所得的反应液透析，获得聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物；
在氩气保护下，将化合物CABALA溶于干燥的DMF中，然后加入五氟苯酚、二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下反应2h，加入聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物，聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物、化合物CABALA、五氟苯酚、DCC的摩尔比为1:(1.01～1.5):(1.01～1.5):(1.01～1.5)，室温下反应，反应液浓缩、沉降，得到聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)；
在氩气保护下，将聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)用干燥的二氯甲烷溶解，加入钯碳、通入氢气，钯碳与聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)的质量比为1：(5～10)，在室温下反应，得到羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)。
所述甲醇和氯仿的混合溶液中，氯仿和甲醇的体积比为1：(2～3)。
所述聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)的制备方法包括以下步骤：
在氩气保护下，将摩尔比为1:(10～40):(10～40)的聚乙二醇单甲醚2000(mPEG2000)、4-羰基-ε-己内酯(OPD)和ε-己内酯(ε-CL)混合，抽真空，加入干燥的甲苯作为溶剂，加入催化剂异辛酸亚锡，异辛酸亚锡与单体4-羰基-ε-己内酯(OPD)和ε-己内酯(ε-CL)之和的摩尔比为1:(100～200)，温度为80～100℃的条件下持续反应1～48h，得到聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)。
所述聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)中，以摩尔数计，己内酯单元(ε-CL)占40％-80％，4-羰基-ε-己内酯(OPD)单元(OPD)占20％-60％。
所述化合物CABALA的制备方法包括以下步骤：
将5-氨基酮戊酸盐酸盐溶于饱和的碳酸氢钠水溶液中，在冰水浴条件下滴加氯甲酸苄酯，5-氨基酮戊酸盐酸盐与氯甲酸苄酯的摩尔比为1:(1.1～1.5)，常温反应过夜，反应液浓缩、过滤、用***洗后干燥获得化合物CABALA。
本发明的第三个方面提供了一种所述羰基化聚己内酯基光动力治疗前药在制备抗癌药物中的应用。
所述癌指的是皮肤癌(尤其是皮肤鳞癌)。
所述羰基化聚己内酯基光动力治疗前药为两亲性聚合物，可制备为羰基化聚己内酯基光动力治疗前药胶束；羰基化聚己内酯基光动力治疗前药胶束以聚乙二醇单甲醚(mPEG2000)段为亲水外壳，以4-羰基-ε-己内酯(OPD)和ε-己内酯(ε-CL)无规共聚的链段为疏水性内核；所述羰基化聚己内酯基光动力治疗前药胶束与相同浓度的纯光敏剂前躯体5-氨基酮戊酸(ALA)相比，其转化为原卟啉的量有所提高；所述羰基化聚己内酯基光动力治疗前药胶束与相同浓度的纯光敏剂前躯体5-氨基酮戊酸(ALA)相比，其对癌细胞的杀伤性提高。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明的羰基化聚己内酯基光动力治疗前药为两亲性聚合物，可以制备成胶束，细胞实验证明，与纯5-氨基酮戊酸(ALA)相比较，该前药胶束转化为原卟啉的量更高，对肿瘤细胞的杀伤性更好，本发明采用化学接枝的方法将5-氨基酮戊酸接入功能化聚己内酯中，实现了5-氨基酮戊酸的酯化，提高了5-氨基酮戊酸的脂溶性及稳定性，具有更好的靶向性，更高的转化率以及更好的光动力疗效。
附图说明
图1是化合物CABALA的1H NMR谱图。
图2是聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)的1H NMR谱图。
图3是聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物的1H NMR谱图。
图4是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的1H NMR谱图。
图5是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的DLS图。
图6是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的TEM图。
图7是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的细胞内原卟啉PpIX测试结果示意图。
图8是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的细胞内单态氧ROS测试结果示意图。
图9是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的细胞暗毒性测试结果示意图。
图10是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的杀伤性测试结果示意图。
图11是小鼠肿瘤生长情况示意图。
图12是小鼠瘤体曲线示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
CABALA的制备：
Figure BDA0002362333320000041
在50mL两口烧瓶中依次加入1.68g 5-氨基酮戊酸盐酸盐、0.84g碳酸氢钠和20ml去离子水，待上述原料完全溶解后，在冰水浴条件下滴加1.7g氯甲酸苄酯，常温反应过夜，浓缩过滤除去未反应的氯甲酸苄酯及溶剂，所得的白色固体用甲醇冲洗后干燥至恒重，获得化合物CABALA。图1是化合物CABALA的1H NMR谱图。
实施例2
聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)的合成
Figure BDA0002362333320000042
x＝20，y＝30。
将25mL反应茄瓶抽真空烤管三次，在氩气保护下，加入1g聚乙二醇单甲醚2000(mPEG 2000)、1.28g 4-羰基-ε-己内酯(OPD)和1.71gε-己内酯(ε-CL)，抽真空2h，加入10ml干燥的甲苯和催化剂异辛酸亚锡Sn(Oct)2 0.101g，90℃下反应24h。反应产物在冰***中沉降，沉降物用砂芯漏斗抽滤，真空干燥至恒重，得到聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)。图2是聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)的1H NMR谱图。
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的制备方法包括以下步骤：
Figure BDA0002362333320000051
x＝20，y＝30。
羟乙肼的接入：称取2g聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)和0.32g羟乙肼，加入到20ml甲醇和氯仿(体积比为9:4)的混合溶液中，室温下反应24h。所得的反应液用截留分子量为3500的透析袋在甲醇中透析12h，每4h换一次甲醇，最后用***沉降回收，干燥得白色固体。图3是聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物的1H NMR谱图。
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的制备：
在氩气保护下，将0.837g CABALA溶于10mL干燥的DMF中，然后加入0.581g五氟苯酚、0.651g二环己基碳二亚胺DCC，室温下反应2h后，加入1g聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物，室温下反应12h，反应液浓缩，在大量冰无水***中沉降，得到聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)。
脱保护的方法：在通满氩气的聚合瓶中，加入0.5g聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)，用2mL干燥的二氯甲烷溶解，加入0.1g钯碳，通入氢气，在室温下反应4h，过滤除去钯碳，在冰无水***中沉降，干燥后得到羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)。图4是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的1HNMR谱图。
实施例3
聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)的合成
Figure BDA0002362333320000061
x＝30，y＝20。
将25mL反应茄瓶抽真空烤管三次，在氩气保护下，加入1g聚乙二醇单甲醚2000(mPEG 2000)、1.92g 4-羰基-ε-己内酯(OPD)和1.14gε-己内酯(ε-CL)，抽真空2h，加入10ml干燥的甲苯和催化剂异辛酸亚锡Sn(Oct)2 0.101g，90℃下反应24h。反应产物在冰***中沉降，沉降物用砂芯漏斗抽滤，真空干燥至恒重，得到聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)。
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的制备方法包括以下步骤：
Figure BDA0002362333320000071
x＝30，y＝20。
羟乙肼的接入：称取1g聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)和0.438g羟乙肼加入到20ml甲醇和氯仿(体积比为9:4)的混合溶液中，室温下反应24h。所得的反应液用截留分子量为3500的透析袋在甲醇中透析12h，每4h换一次甲醇，最后用***沉降回收，干燥得白色固体。
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的制备：
在氩气保护下，将1.147g CABALA溶于10mL干燥的DMF中，然后加入0.796g五氟苯酚、0.891g二环己基碳二亚胺DCC，室温下反应2h后，加入1g聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物，室温下反应12h，反应液浓缩，在大量冰无水***中沉降，得到聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)。
脱保护的方法：在通满氩气的聚合瓶中，加入0.5g聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)，用2mL干燥的二氯甲烷溶解，加入0.1g钯碳，通入氢气，在室温下反应4h，过滤除去钯碳，在冰无水***中沉降，干燥后得到羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)。
实施例4
聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)的合成
Figure BDA0002362333320000081
x＝10，y＝40。
将25mL反应茄瓶抽真空烤管三次，在氩气保护下，加入1g聚乙二醇单甲醚2000(mPEG 2000)、0.64g 4-羰基-ε-己内酯(OPD)和2.28gε-己内酯(ε-CL)，抽真空2h，加入10ml干燥的甲苯和催化剂异辛酸亚锡Sn(Oct)2 0.101g，90℃下反应24h。反应产物在冰***中沉降，沉降物用砂芯漏斗抽滤，真空干燥至恒重，得到聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)。
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的制备方法包括以下步骤：
Figure BDA0002362333320000082
x＝10，y＝40。
羟乙肼的接入：称取1g聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)和0.177g羟乙肼加入到20ml甲醇和氯仿(体积比为9:4)的混合溶液中，室温下反应24h。所得的反应液用截留分子量为3500的透析袋在甲醇中透析12h，每4h换一次甲醇，最后用***沉降回收，干燥得白色固体。
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的制备：
在氩气保护下，将0.462g CABALA溶于10mL干燥的DMF中，然后加入0.321g五氟苯酚、0.359g二环己基碳二亚胺DCC，室温下反应2h后，加入1g聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物，室温下反应12h，反应液浓缩，在大量冰无水***中沉降，得到聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)。
脱保护的方法：在通满氩气的聚合瓶中，加入0.5g聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)，用2mL干燥的二氯甲烷溶解，加入0.1g钯碳，通入氢气，在室温下反应4h，过滤除去钯碳，在冰无水***中沉降，干燥后得到羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)。
实施例5
聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)的合成
Figure BDA0002362333320000091
x＝25，y＝25。
将25mL反应茄瓶抽真空烤管三次，在氩气保护下，加入1g聚乙二醇单甲醚2000(mPEG 2000)、1.6g 4-羰基-ε-己内酯(OPD)和1.425gε-己内酯(ε-CL)，抽真空2h，加入10ml干燥的甲苯和催化剂异辛酸亚锡Sn(Oct)2 0.101g，90℃下反应24h。反应产物在冰***中沉降，沉降物用砂芯漏斗抽滤，真空干燥至恒重，得到聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)。
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的制备方法包括以下步骤：
Figure BDA0002362333320000101
x＝25，y＝25。
羟乙肼的接入：称取1g聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)和0.382g羟乙肼加入到20ml甲醇和氯仿(体积比为9:4)的混合溶液中，室温下反应24h。所得的反应液用截留分子量为3500的透析袋在甲醇中透析12h，每4h换一次甲醇，最后用***沉降回收，干燥得白色固体。
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)的制备：
在氩气保护下，将0.776g CABALA溶于10mL干燥的DMF中，然后加入0.693g五氟苯酚、0.776g二环己基碳二亚胺DCC，室温下反应2h后，加入1g聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物，室温下反应12h，反应液浓缩，在大量冰无水***中沉降，得到聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)。
脱保护的方法：在通满氩气的聚合瓶中，加入0.5g聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)，用2mL干燥的二氯甲烷溶解，加入0.1g钯碳，通入氢气，在室温下反应4h，过滤除去钯碳，在冰无水***中沉降，干燥后得到羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)。
实施例6
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的制备：
将200mg羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)完全溶于2.5mL DMF溶液中，随后逐滴滴加到10ml双蒸水中，搅拌2h后转移至透析袋(截留分子量MWCO＝3500)中透析48h，每隔12h换一次水以除去有机溶剂，最后定容为20mL(胶束浓度为10mg/mL)。图5是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的DLS图，从图中可以看出，mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的粒径在160nm左右，大小均匀；图6是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的SEM图，从图中可以看出，胶束为棒状。
实施例7
羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的PPIX荧光动力学研究
将处于对数生长期的细胞，接种到6孔培养板中，培养至大约90％的细胞融合时，吸去含血清培养液，PBS冲洗两遍。空白对照组加入不含药的无血清培养基3mL；纯ALA组是加入新鲜配制的含5mM ALA的3mL无血清培养基；羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束组是加入将mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束用无血清培养基稀释至含ALA终浓度为5mM的混合溶液3mL，3组均用锡箔纸包裹避光培养24h。用流式细胞仪检测细胞内PpIX的相对含量。结果如图7所示，图7是羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的细胞内原卟啉PpIX测试结果示意图，加入纯ALA及前药胶束的细胞内PpIX的量较正常细胞均有上升，且前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束组较ALA组高，即前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束能产生更多PpIX。
实施例8
细胞内ROS测试
将处于对数生长期的细胞，接种到6孔培养板中，培养至大约90％的细胞融合时，吸去含血清培养液，PBS冲洗两遍。空白对照组是加入不含药的无血清培养基3mL；纯ALA组是加入新鲜配制的含5mM ALA的3mL无血清培养基；mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束组是加入将mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束用无血清培养基稀释至ALA终浓度为5mM的混合培养基3mL，3组均用锡箔纸包裹避光培养24h，然后于635nm红光照射5min。照射后各组继续培养4h。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA试剂，终浓度为10umol/L。去除三组细胞培养液，加入3mL稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20min。用无血清培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞后用流式细胞仪检测。结果如图8所示，图8是前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的细胞内单态氧ROS测试结果示意图，从图中可以看出，加入纯ALA及mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的细胞内ROS的量较正常细胞均有上升，且前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束组较ALA组略高，即前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束能产生更多ROS。
实施例9
细胞暗毒性及杀伤性测试
将处于对数生长期的细胞，接种到96孔培养板中，培养至大约90％的细胞融合时，吸去含血清培养液，PBS冲洗两遍。
细胞暗毒性中，将处于对数生长期的细胞，接种到96孔培养板中，培养至大约90％的细胞融合时，吸去含血清培养液，PBS冲洗两遍。空白对照组加入不含药的无血清培养基100μL箔纸包裹避光培养；0.1mM ALA避光组、1mM ALA避光组、10mM ALA避光组分别加入100μL 0.1mM ALA、1mM、10mM的无血清培养基；0.1mM mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束避光组、1mM mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束避光组、10mM mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束避光组：各自加入将mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束用无血清培养基稀释至溶液中ALA终浓度为0.1mM、1mM、10mM的混合溶液100μL。各组用锡箔纸包裹避光培养48h后，于CCK8检测细胞存活率。细胞暗毒性测试结果如图9所示，从图中可以看出，在避光的情况下，mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束没有细胞毒性，是安全的生物材料，作为光敏剂前药具有暗毒性小的优点。
将处于对数生长期的细胞，接种到96孔培养板中，培养至大约90％的细胞融合时，吸去含血清培养液，PBS冲洗两遍。ALA组分别加入100μL含有ALA0.1mM、1mM、2mM、5mM、10mM的无血清培养基；mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束组各自加入将mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束用无血清培养基稀释至溶液中ALA终浓度为0.1mM、1mM、2mM、5mM和10mM的混合溶液100μL。各组用锡箔纸包裹避光培养24h后，用635nm红光照射5min后继续培养24h，于CCK8检测细胞存活率。细胞杀伤性测试结果如图10所示，从图中可以看出，mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束具有细胞杀伤性，且在相同MLA浓度下，mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的细胞杀伤效果好于纯ALA。
实施例10
动物实验
小鼠肿瘤模型的建立：
鳞癌肿瘤模型的建立方法为：采购20只雌性，6w左右的裸鼠，适应性饲养1周后每只裸鼠皮下注射0.2mL含有2*106个鳞癌细胞的生理盐水。待肿瘤体积增长到15mm3进行抗肿瘤实验。
体内抗肿瘤研究：
将小鼠随机分为3组：
A组对照组，不做任何处理；
B组Free ALA组：局部注射无菌10mM的ALA溶液200μL；
C组前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束组:局部注射mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束200μL，其中胶束含ALA的量与纯药组相同。
加药后避光4h，麻醉小鼠后用635nm红光照射小鼠肿瘤部位，保证光斑覆盖整个肿瘤，并覆盖肿瘤四周边缘约3-5mm的正常组织，功率密度为75mW/cm2，照光时间各5min。每2天记录小鼠体重和皮下肿瘤尺寸包括长与宽，肿瘤体积按照如下公式计算：
V(mm3)＝1/2×length(mm)×width(mm)×width(mm)
同时拍照记录肿瘤生长情况及裸鼠健康状况，绘制生存曲线。
小鼠及肿瘤的生长情况如图11所示，其中A为对照组，B为ALA组，C为羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束组，实验中，在第六天、第12天A组小鼠背部肿瘤在增大，B、C组小鼠背部肿瘤有明显减小；图12是小鼠瘤体曲线示意图，在相同ALA浓度下，羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)胶束的抗肿瘤效果好于纯ALA。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (9)

1.一种羰基化聚己内酯基光动力治疗前药，其特征在于，结构如下所示：
Figure FDA0003481511880000011
x＝10～40，y＝10～40。
2.一种权利要求1所述的羰基化聚己内酯基光动力治疗前药的制备方法，包括以下步骤：
将摩尔比为1:(2～5)的聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)和羟乙肼加入到甲醇和氯仿的混合溶液中，室温下反应，所得的反应液透析，获得聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物；
在氩气保护下，将化合物CABALA溶于干燥的DMF中，然后加入五氟苯酚、二环己基碳二亚胺，室温下反应2h，加入聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物，聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)接入羟乙肼后的聚合物、化合物CABALA、五氟苯酚、DCC的摩尔比为1:(1.01～1.5):(1.01～1.5):(1.01～1.5)，室温下反应，反应液浓缩、沉降，得到聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)；
在氩气保护下，将聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)用干燥的二氯甲烷溶解，加入钯碳、通入氢气，钯碳与聚合物mPEG-b-P(CL-co-CABALAOPD)的质量比为1：(5～10)，在室温下反应，得到羰基化聚己内酯基光动力治疗前药mPEG-b-P(CL-co-ALAOPD)；
其中，所述CABALA的结构如下所示：
Figure FDA0003481511880000021
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述甲醇和氯仿的混合溶液中，氯仿和甲醇的体积比为1：(2～3)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)的制备方法包括以下步骤：
在氩气保护下，将摩尔比为1:(10～40):(10～40)的聚乙二醇单甲醚2000、4-羰基-ε-己内酯和ε-己内酯混合，抽真空，加入干燥的甲苯作为溶剂，加入催化剂异辛酸亚锡，异辛酸亚锡与单体4-羰基-ε-己内酯和ε-己内酯之和的摩尔比为1:(100～200)，温度为80℃～100℃的条件下持续反应1～48h，得到聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述聚己内酯基两亲性共聚物mPEG-b-P(CL-co-OPD)中，以摩尔数计，己内酯单元占40％～80％，4-羰基-ε-己内酯单元占20％～60％。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物CABALA的制备方法包括以下步骤：
将5-氨基酮戊酸盐酸盐溶于饱和的碳酸氢钠水溶液中，在冰水浴条件下滴加氯甲酸苄酯，5-氨基酮戊酸盐酸盐与氯甲酸苄酯的摩尔比为1:(1.1～1.5)，常温反应过夜，反应液浓缩、过滤、用***洗后干燥获得化合物CABALA。
7.一种权利要求1所述的羰基化聚己内酯基光动力治疗前药在制备抗癌药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌指的是皮肤癌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述皮肤癌指的是皮肤鳞癌。
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