CN110801432A - 一种多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***及制备方法 - Google Patents

一种多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于肿瘤靶向治疗纳米药物技术领域，具体公开了一种多功能负载两亲性喜树碱‑氟脲苷的靶向混合胶束载药***及制备方法，包括如下步骤：1)两亲性喜树碱‑氟脲苷化合物的制备和组装；2)靶向混合胶束的制备与组装；3)负载两亲性喜树碱‑氟脲苷的靶向混合胶束载药***的组装。本发明制备的多功能靶向纳米药物，喜树碱、氟脲苷的二者结合率高，***载药量高，载药后形成的纳米粒子粒度均匀，分散好，不团聚，稳定性和靶向性高，有利于提高喜树碱‑氟脲苷的协同治疗效果。

Description

一种多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药 ***及制备方法
技术领域
本发明涉及肿瘤靶向治疗纳米药物领域，特别是涉及一种多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***及制备方法。
背景技术
多功能纳米药物载体具有高效、精准***的优点，因此成为现今肿瘤治疗研究的热点方向。肿瘤组织血管通透性高，纳米药物易于在此处实现EPR效应，从而被动靶向。同时，由于肿瘤部位pH的改变，使得外接RGD肽的分子链伸展，RGD肽能够靶向识别肿瘤细胞，达到主动靶向的作用。当纳米药物被肿瘤细胞摄取后，混合胶束内部包裹的喜树碱-氟脲苷被释放。喜树碱为细胞毒性类药物，氟脲苷属于抗代谢类药物，二者协同作用，能进一步提高肿瘤治疗效果。
Lin Zhao等人公开了一种新型以富勒烯为载体的阿霉素药物递送***治疗潜在肺癌(详见“Journal of Nanoscience and Nanotechnology”,第17期5147-5154页,2017年)，开发了一种新型的方法来制备一种以阿霉素和RGD肽为基础的富勒烯药物输送***，用于治疗实体肿瘤、肺癌等，但是该方法制作出的纳米药物体系载药量低，且由于化疗药物在粒子外层，极易出现药物泄露。
Chunkai Huang等人研究了用于癌症细胞定位、分布成像和抗癌药物输送的多功能胶束(详见“Advanced Functional Materials”,第17期2291–2297页,(2007年)，该研究提出了一种封装了抗癌药物阿霉素多功能胶束，该胶束是由一个接枝共聚物、一个二嵌段共聚物和两个功能化的二嵌段共聚物进行制备。这种多功能胶束克服了离子电核递送***中的限制，但是靶向性弱，并且携带药物单一，未实现多种抗癌药物协同治疗的效果。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***及制备方法，用于解决现有技术中用于***的纳米载药***载药量低、稳定性差、靶向性弱、携带药物单一、不能实现多种抗癌药物协同治疗效果等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***及制备方法，包括如下步骤：
(1)两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子的制备和组装；
(2)靶向混合胶束的制备与组装：
a2)将EDC活化后的羧基聚乙二醇水溶液逐滴加入溶解有双硒化合物的DMF混合液中，搅拌反应，达稳定后向反应液中加入乙酸乙酯，萃取，静置，取下层液，透析，得化合物1：羧基聚乙二醇接联硒化合物；
b2)在无氧低温环境下，将正乙醇胺和三乙胺溶于四氢呋喃中，再加入溶于四氢呋喃的2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷，搅拌过夜后干燥，将所得化合物与双硒化合物溶于无水四氢呋喃中，在异辛酸亚锡催化下搅拌反应，将所得化合物经过无水***沉淀干燥后，再溶于含有三氟乙酸的二氯甲烷中，反应得到化合物2：PAEEG-PBSe；
c2)将RGD肽和化合物2溶于DMSO中，再加入过量EDC和过量N-羟基琥珀酰亚胺搅拌反应过夜，将反应物透析冻干，即得化合物3：多肽氨基乙基乙烯酸盐接联硒化合物；
(3)负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***的组装：
将两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子以及步骤(2)中制得的化合物1、化合物3溶于氯仿中，透析得到所述负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***。
可选地，步骤(1)中，所述两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子的制备和组装方法包括如下步骤：
a1)将戊二酸、EDC溶于氯仿中，再滴入喜树碱溶液，得第一反应液；
b1)将所述第一反应液加热，过滤过量喜树碱，加入EDC后，滴入溶于二甲基亚砜的氟脲苷溶液，反应得第二反应液；
c1)将所述第二反应液，透析后取上清液，得到所述两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子。
可选地，步骤a1)中，戊二酸、EDC、喜树碱的摩尔量比值为1:(1.1-1.2):(1.1-1.2)。
可选地，步骤b1)中，EDC与氟脲苷的摩尔量比值≤1，优选为0.7-0.9，更优选为0.75-0.8。
可选地，步骤a2)中，羧基聚乙二醇、EDC、双硒化合物的摩尔量比值0.1:(0.135-0.15):(1.0-1.15)。
可选地，步骤b2)中，正乙醇胺、三乙胺、2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷、双硒化合物的摩尔量比值为1:(1-1.5):(1-1.5):(2.5-2.8)。
可选地，步骤b2)中，所述三氟乙酸的浓度为5％。
可选地，步骤c2)中，RGD肽、化合物2、EDC、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量比值为(1-1.2):(1-1.2):0.074:0.074。
可选地，步骤(3)中，两亲性喜树碱-氟脲苷脂质体、化合物1、化合物3的摩尔量比值为1:(5-7):(1-1.5)。
本发明另一方面提供一种采用上述制备方法制得的多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***。
如上所述，本发明的多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***及制备方法，具有以下有益效果：
1、采用本方法制备的喜树碱-氟脲苷纳米粒子，喜树碱、氟脲苷均为肿瘤化疗药物，且二者结合率高，在提高***稳定性的同时，大大提高了载药量。
2、本发明的外接多肽氨基乙基乙烯酸盐接联硒化合物链，肿瘤细胞表面存在高表达的αvβ3、αvβ5等整合素可与该链的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)肽特异性结合，从而抑制肿瘤细胞的黏附、转移、侵袭及血管新生过程，增强抗肿瘤活性分子的治疗作用，为肿瘤的治疗提供了新的方向。
3、用本方法制备的多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***，载药后形成的纳米粒子粒度均匀，分散好，不团聚，稳定性和靶向性高，能够使得纳米载药***在体内稳定安全地将药物靶向递送到病灶部位，有利于提高喜树碱-氟脲苷的协同治疗效果。
4、本发明所述方法原料易于获取，操作简单，使用的设备为常规设备，便于工业化生产。
附图说明
图1显示为本发明实施例中喜树碱-氟脲苷纳米粒子的粒径分布图。
图2显示为本发明实施例中羧基聚乙二醇接联硒化合物的红外光谱图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供一种多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***及制备方法。
以下实施例中，DMF是指二甲基甲酰胺，EDC是指1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，DMSO是指二甲基亚砜，THF是指四氢呋喃，NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺。
以下各实施例中的透析均是采用去离子水，目的是去除小分子物质和其他杂质。
以下实施例中所涉及的化学反应如下：
实施例1
一、制备两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子
1.取41.8mg喜树碱避光加入20mL无水氯仿中，置于50℃油浴锅中，磁力搅拌助溶，直至溶液清亮；
2.将戊二酸13.21mg溶于5mL无水氯仿中，并向其中加入23mg EDC，活化15-30min后，向其中滴加步骤1所得到的喜树碱溶液，磁力搅拌并过夜，得第一反应液；
3.将第一反应液置于50℃油浴锅中，过滤过量喜树碱，旋蒸，得第一化合物；
4.将第一化合物溶于5mL无水氯仿中，加入23mg EDC活化15-30min，得第二反应液；
5.取36.93mg氟脲苷溶于5mL DMSO中，将其滴加入第二反应液中，磁力搅拌，过夜，得第三反应液；
6.第三反应液透析2h，取上清液，烘干，即得喜树碱-氟脲苷纳米粒子材料。
二、制备羧基聚乙二醇接联硒化合物
1.称取250mg羧基聚乙二醇(PEG5000)，溶于1mL水，磁力搅拌助溶，得第一反应液；
2.取14.4mg EDC溶于0.5mL水，振荡助溶，将其滴加入第一反应液，磁力搅拌，反应15-30min，得第二反应液；
3.称取186.1mg双硒化合物(PBSe)，加入2mL DMF中，振荡助溶，将第二反应液滴加入该溶液中，磁力搅拌，反应5h，得第三反应液；
4.向第三反应液中加入5mL乙酸乙酯萃取，摇晃均匀，静置0.5h，取下层液，透析2h，得到化合物1：羧基聚乙二醇接联硒化合物(PEG-PBSe)。
三、制备负载喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束
1.在无氧低温环境下，取正乙醇胺12.2mg、三乙胺20.2mg溶于10mL无水THF中，得第一反应液；
2.取2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(COP)28.5mg溶于10mL无水THF中，将其滴加入第一反应液，磁力搅拌，过夜，过滤，旋蒸，得第一化合物；
3.取第一化合物溶于10mL无水THF中，称取异辛酸亚锡20.25mg加入，磁力搅拌反应2h，得第二反应液；
4.取PBSe 197.8mg，溶于5mL无水THF中，将其滴加入第二反应液，油浴锅50℃，磁力搅拌3h，得第三反应液；
5.将第三反应液经无水***沉淀，真空干燥，过夜，再溶于10mL，浓度5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，反应2h，得到第二化合物(即化合物2：PAEEG-PBSe)；
6.取RGD肽200mg，第二化合物300mg，共同溶于5mL DMSO中，取EDC 7.67mg和NHS4.32mg加入该溶液中，磁力搅拌，过夜，透析48h，冻干，得到化合物3：多肽氨基乙基乙烯酸盐接联硒化合物(PAEEG-PBSe-RGD)；
7.将36.33mg喜树碱-氟脲苷纳米粒子材料、268.61mg PEG-PBSe和285.93mgPAEEG-PBSe-RGD溶于10mL无水氯仿中，透析2h，即得负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***。
图1显示为本实施例中喜树碱-氟脲苷纳米粒子的粒径分布图。
从图1的喜树碱-氟脲苷纳米粒子粒径分布图可以看出，该***的粒径大小在284.2纳米左右，粒径较小，分布较窄，有利于体内的靶向分布。
图2显示为本实例实施中羧基聚乙二醇接联硒化合物的红外光谱图；其中PEG为羧基聚乙醇胺，PBSe为双硒化合物，PEG-PBSe为羧基聚乙二醇接联硒化合物。
关于图2中红外光谱图的图解如下：通过对比羧基聚乙醇胺、双硒化合物、羧基聚乙二醇接联硒化合物，能够明显看出在羧基聚乙二醇接联硒化合物的谱图中出现了双硒化合物的特征峰，表明成功负载双硒化合物。
实施例2
一、制备两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子
1.取38.32mg喜树碱避光加入20mL无水氯仿中，置于55℃油浴锅中，磁力搅拌助溶，直至溶液清亮；
2.将戊二酸13.21mg溶于5mL无水氯仿中，并向其中加入23mg EDC，活化15-30min后，向其中滴加步骤1所得到的喜树碱溶液，磁力搅拌12h，得第一反应液；
3.将第一反应液置于55℃油浴锅中，过滤过量喜树碱，旋蒸，得第一化合物；
4.将第一化合物溶于5mL无水氯仿中，加入23mg EDC活化15-30min，得第二反应液；
5.取39.39mg氟脲苷溶于5mL DMSO中，将其滴加入第二反应液中，磁力搅拌6h，得第三反应液；
6.第三反应液透析4h，取上清液，烘干，即得喜树碱-氟脲苷纳米粒子材料。
二、制备羧基聚乙二醇接联硒化合物
1.称取250mg羧基聚乙二醇(PEG5000)，溶于2mL水，磁力搅拌助溶，得第一反应液；
2.取12.94mg EDC溶于1mL水，振荡助溶，将其滴加入第一反应液，磁力搅拌，反应0.5h，得第二反应液；
3.称取186.1mg双硒化合物(PBSe)，加入3mL DMF中，振荡助溶，将第二反应液滴加入该溶液中，磁力搅拌，反应8h，得第三反应液；
4.向第三反应液中加入5mL乙酸乙酯萃取，摇晃均匀，静置1h，取下层液，透析2h，得到化合物1：羧基聚乙二醇接联硒化合物(PEG-PBSe)。
三、制备负载喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束
1.在无氧低温环境下，取正乙醇胺12.2mg、三乙胺30.3mg溶于10mL无水THF中，得第一反应液；
2.取2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(COP)28.5mg溶于10mL无水THF中，将其滴加入第一反应液，磁力搅拌，6h，过滤，旋蒸，得第一化合物；
3.取第一化合物溶于10mL无水THF中，称取异辛酸亚锡20.25mg加入，磁力搅拌反应4h，得第二反应液；
4.取PBSe 186.1mg，溶于5mL无水THF中，将其滴加入第二反应液，油浴锅55℃，磁力搅拌2h，得第三反应液；
5.将第三反应液经无水***沉淀，真空干燥，过夜，再溶于10mL，浓度5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，反应4h，得到第二化合物(即化合物2：PAEEG-PBSe)；
6.取RGD肽200mg，第二化合物200mg，共同溶于5mL DMSO中，取EDC 7.67mg和NHS4.32mg加入该溶液中，磁力搅拌，过夜，透析24h，冻干，得到化合物3：多肽氨基乙基乙烯酸盐接联硒化合物(PAEEG-PBSe-RGD)；
7.将36.33mg喜树碱-氟脲苷纳米粒子材料、268.61mg PEG-PBSe和285.93mgPAEEG-PBSe-RGD溶于10mL无水氯仿中，透析4h，即得负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***。
实施例3
一、制备两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子
1.取41.8mg喜树碱避光加入20mL无水氯仿中，置于55℃油浴锅中，磁力搅拌助溶，直至溶液清亮；
2.将戊二酸13.21mg溶于5mL无水氯仿中，并向其中加入21.09mg EDC，活化0.5h后，向其中滴加步骤1所得到的喜树碱溶液，磁力搅拌并过夜，得第一反应液；
3.将第一反应液置于55℃油浴锅中，过滤过量喜树碱，旋蒸，得第一化合物；
4.将第一化合物溶于5mL无水氯仿中，加入21.09mg EDC活化0.5h，得第二反应液；
5.取36.93mg氟脲苷溶于5mL DMSO中，将其滴加入第二反应液中，磁力搅拌，6h，得第三反应液；
6.第三反应液透析2h，取上清液，烘干，即得喜树碱-氟脲苷纳米粒子材料。
二、制备羧基聚乙二醇接联硒化合物
1.称取250mg羧基聚乙二醇(PEG5000)，溶于1mL水，磁力搅拌助溶，得第一反应液；
2.取14.4mg EDC溶于0.5mL水，振荡助溶，将其滴加入第一反应液，磁力搅拌，反应0.5h，得第二反应液；
3.称取214mg双硒化合物(PBSe)，加入4mL DMF中，振荡助溶，将第二反应液滴加入该溶液中，磁力搅拌，反应5h，得第三反应液；
4.向第三反应液中加入20mL乙酸乙酯萃取，摇晃均匀，静置1h，取下层液，透析2h，得到化合物1：羧基聚乙二醇接联硒化合物(PEG-PBSe)。
三、制备负载喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束
1.在无氧低温环境下，取正乙醇胺12.2mg、三乙胺30.3mg溶于10mL无水THF中，得第一反应液；
2.取2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(COP)42.7mg溶于10mL无水THF中，将其滴加入第一反应液，磁力搅拌，过夜，过滤，旋蒸，得第一化合物；
3.取第一化合物溶于10mL无水THF中，称取异辛酸亚锡20.25mg加入，磁力搅拌反应4h，得第二反应液；
4.取PBSe 208.4mg，溶于10mL无水THF中，将其滴加入第二反应液，油浴锅55℃，磁力搅拌3h，得第三反应液；
5.将第三反应液经无水***沉淀，真空干燥，过夜，再溶于10mL，浓度5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，反应6h，得到第二化合物(即化合物2：PAEEG-PBSe)；
6.取RGD肽200mg，第二化合物300mg，共同溶于5mL DMSO中，取EDC 7.67mg和NHS4.32mg加入该溶液中，磁力搅拌，过夜，透析48h，冻干，得到化合物3：多肽氨基乙基乙烯酸盐接联硒化合物(PAEEG-PBSe-RGD)；
7.将36.33mg喜树碱-氟脲苷纳米粒子材料、268.61mg PEG-PBSe和285.93mgPAEEG-PBSe-RGD溶于10mL无水氯仿中，透析2h，即得负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***。
综上所述，本发明制备的多功能靶向纳米药物，大大提高***的载药量，同时具有高稳定性和高靶向性等优点，能够使得纳米载药***在体内稳定安全地将药物靶向递送到病灶部位，能够实现喜树碱-氟脲苷对肿瘤的联合给药和协同治疗。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子的制备和组装；
(2)靶向混合胶束的制备与组装：
a2)将EDC活化后的羧基聚乙二醇水溶液逐滴加入溶解有双硒化合物的DMF混合液中，搅拌反应，达稳定后向反应液中加入乙酸乙酯，萃取，静置，取下层液，透析，得化合物1：羧基聚乙二醇接联硒化合物；
b2)在无氧低温环境下，将正乙醇胺和三乙胺溶于四氢呋喃中，再加入溶于四氢呋喃的2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷，搅拌过夜后干燥，将所得化合物与双硒化合物溶于无水四氢呋喃中，在异辛酸亚锡催化下搅拌反应，将所得化合物经过无水***沉淀干燥后，再溶于含有三氟乙酸的二氯甲烷中，反应得到化合物2：PAEEG-PBSe；
c2)将RGD肽和化合物2溶于DMSO中，再加入过量EDC和过量N-羟基琥珀酰亚胺搅拌反应过夜，将反应物透析冻干，即得化合物3：多肽氨基乙基乙烯酸盐接联硒化合物；
(3)负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***的组装：
将两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子以及步骤(2)中制得的化合物1、化合物3溶于氯仿中，透析得到所述负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述两亲性喜树碱-氟脲苷纳米粒子的制备和组装方法包括如下步骤：
a1)将戊二酸、EDC溶于氯仿中，再滴入喜树碱溶液，得第一反应液；
b1)将所述第一反应液加热，过滤过量喜树碱，加入EDC后，滴入溶于二甲基亚砜的氟脲苷溶液，反应得第二反应液；
c1)将所述第二反应液，透析后取上清液，得到所述两亲性喜树碱-氟脲苷化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤a1)中，戊二酸、EDC、喜树碱的摩尔量比值为1:(1.1-1.2):(1.1-1.2)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b1)中，EDC与氟脲苷的摩尔量比值≤1，优选为0.7-0.9，更优选为0.75-0.8。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a2)中，羧基聚乙二醇、EDC、双硒化合物的摩尔量比值0.1:(0.135-0.15):(1.0-1.15)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b2)中，正乙醇胺、三乙胺、2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷、双硒化合物的摩尔量比值为1:(1-1.5):(1-1.5):(2.5-2.8)。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b2)中，所述三氟乙酸的浓度为5％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤c2)中，RGD肽、化合物2、EDC、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量比值为(1-1.2):(1-1.2):0.074:0.074。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，两亲性喜树碱-氟脲苷脂质体、化合物1、化合物3的摩尔量比值为1:(5-7)：(1-1.5)。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的多功能负载两亲性喜树碱-氟脲苷的靶向混合胶束载药***。
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