CN103055324A - 共担载顺铂和阿霉素的复合物、胶束及胶束的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种共担载顺铂和阿霉素的复合物，胶束及胶束的制备方法。所述复合物由顺铂、阿霉素与嵌段共聚物复合而成，顺铂与嵌段共聚物通过配位作用复合，阿霉素与嵌段共聚物通过静电作用复合，所述嵌段共聚物具有式（I）或式（II）结构。共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束，包括所述共担载顺铂和阿霉素的复合物和水性介质。所述复合物胶束的制备方法为将阿霉素、顺铂和具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物在水性介质中反应，得到共担载顺铂和阿霉素的胶束。所述复合物胶束在生理条件下可稳定担载顺铂及阿霉素，并且其释放具有pH值敏感性。

Description

共担载顺铂和阿霉素的复合物、胶束及胶束的制备方法

技术领域

本发明涉及高分子药物领域，特别涉及共担载顺铂和阿霉素的复合物、胶束及胶束的制备方法。

背景技术

由于肿瘤的耐药性，传统的单一药物化疗对肿瘤的疗效不佳，且肿瘤细胞对传统的单一的药物并不敏感。近年来，联合化疗已逐渐成为肿瘤化疗的主流方案。联合化疗指联合应用两种或两种以上无交叉性且有协同作用的药物***性疾病，其目的为增加疗效，减小毒副作用，减少耐药性或延缓耐药的出现，并达到最大药效能力。

联合化疗方案应遵循以下原则：1、联合化疗方案中的各种药物，在单独使用时对该癌症是有效的；2、尽量选择作用机制、作用时间不同的药物组成联合化疗方案，以便更好的发挥协同作用；3、尽量选择毒副作用不同的药物联合，以免毒性相加，使患者难以忍耐。

临床使用的联合化疗方案已经逐渐多样化，一些经典的联合方案如：晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的一线标准治疗，是以铂类(顺铂或卡铂)为基础，联合其他药物(多西他赛、泰素、吉西他滨、长春瑞滨)的两药方案；晚期卵巢上皮癌的一线化疗标准方案是紫杉醇联合卡铂的两药方案；小细胞肺癌(ED-SCLC)的一线化疗的标准方案是依托泊苷联合顺铂（EP）；宫内膜癌的一线联合化疗方案为环磷酰胺、阿霉素以及顺铂的三药方案；晚期胃癌的一线联合化疗方案以五氟尿嘧啶联合顺铂为主。上述多发性癌症的治疗方案中都含有铂类药物。

为了提高药效，降低小分子药物化疗时的毒性，高分子材料经常用来作为药物输送的载体。近期迅速发展起来的是微米和纳米尺度的高分子载体，如：胶束、囊泡和纳米颗粒等，这类高分子载体可有效的将药物分子分散到其中，利用载体的各种响应方式，实现药物的输送和控制释放。肿瘤部位血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有高通透性和滞留性。因而，纳米至微米尺寸的药物担载体系具有显著的“增强的渗透和滞留效应”，即EPR效应。利用EPR效应这种被动靶向方式，可使药物在肿瘤部位有效聚集，同时减小非病灶部位的毒副作用。

肿瘤细胞内环境主要表现为“三低一高”，即：低氧、低糖、低pH值和高谷胱甘肽浓度，其中尤为显著的是低pH值，晚期内涵体和溶酶体的pH值可低至5.0（Advanced Functional Materials19(22):3580-3589）。针对肿瘤细胞内环境的特点，以不同方式在载体中埋设刺激响应型的“开关”，可降低药物对正常组织的毒性，促进药物在靶点位置的释放，从而提高药物疗效。

近年来，抗癌药载体的设计和研究已经取得很大进展。然而，目前的高分子载体多为担载单一药物的载药体系，且多数载体可控性差，限制了其进一步应用。单一载体共担载两种药物不仅可以降低小分子药物联合化疗时的毒副作用，还可以促进药物在肿瘤部位的富集，同时减少给药次数，降低病人痛苦，提高病人生活质量。由于不同药物分子的亲疏水性、电荷性质及分子量等差异较大，因此现有抗癌药物的上市产品中，鲜有共担载两种药物的高分子载药体系，尤其是共担载顺铂与阿霉素的载药体系，远远不能满足市场的需要。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种共担载顺铂和阿霉素的高分子胶束及胶束的制备方法，所述胶束在生理条件下可稳定担载顺铂及阿霉素，并且其释放具有pH值敏感性。

本发明提供一种共担载顺铂和阿霉素的复合物，由顺铂、阿霉素与嵌段共聚物复合而成，顺铂与嵌段共聚物通过配位作用复合，阿霉素与嵌段共聚物通过静电作用复合，所述嵌段共聚物具有式（I）或式（II）结构；

式（I）中和式（II）中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60%以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

优选的，所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20，所述嵌段共聚物的羧基与顺铂中Pt的摩尔比的比值小于10。

优选的，所述保护基为C1～C6的烷基或苯甲基。

优选的，所述R₁独立地选自C1～C40烷基或由氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽、LHRH短肽或叶酸取代的烷基。

优选的，所述R4独立地选自C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基或脱氧胆酸基。

优选的，R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢和苯甲基，且氢占全部R₃基团的60%以上；R₄是氢。

本发明提供一种共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束，包括权利要求1~6任意一项所述的共担载顺铂和阿霉素的复合物和水性介质。

本发明提供一种共担载顺铂和阿霉素的胶束的制备方法，包括以下步骤：

将阿霉素、顺铂和具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物在水性介质中反应，得到共担载顺铂和阿霉素的胶束；

式（I）中和式（II）中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60%以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

优选的，所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20。

优选的，所述嵌段共聚物的羧基与顺铂中Pt的摩尔比的比值为小于10。

与现有技术相比，本发明提供的复合物由顺铂、阿霉素与具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物复合而成，顺铂与嵌段共聚物通过配位作用复合，阿霉素与嵌段共聚物通过静电作用复合。在水性介质中，所述复合物形成胶束，聚乙二醇链段处于胶束外核，聚谷氨酸链段处于胶束的内核，顺铂和阿霉素受到这两部分的保护，可以有效避免由于静脉注射后血液循环***的影响而发生的顺铂和阿霉素突然释放，因此本发明提供的复合物胶束稳定性好。而且，顺铂与嵌段共聚物通过配位作用复合时，具有交联作用，对胶束也具有稳定效果。避免了药物的快速释放。此外，嵌段共聚物是通过羧基与顺铂发生配位，与阿霉素的氨基通过静电作用结合的。由于所述羧基在水性介质中对pH值具有敏感性，因此，在肿瘤组织部位及其肿瘤细胞内较低的pH值环境中，本发明提供的复合物胶束容易解除所述嵌段共聚物的羧基与顺铂和阿霉素之间的作用，从而释放顺铂和阿霉素并提高药物的疗效。

附图说明

图1为实施例1制备的嵌段共聚物以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图；

图2为实施例17制备的复合物胶束的流体力学半径分布图；

图3为实施例17制备的复合物胶束的透射电镜图；

图4为实施例17制备的复合物胶束在pH5.5和pH7.4时顺铂和阿霉素的释放结果图；

图5为本发明实施例17制备的复合物胶束、阿霉素裸药和顺铂裸药对A549细胞的毒性考察结果图；

图6为实施例17制备的复合物胶束的联合用药指数图；

图7为阿霉素裸药、本发明实施例30的共载顺铂和阿霉素的复合物胶束及比较例1的担载阿霉素复合物胶束及担载顺铂复合物胶束共混物对A549细胞的毒性考察结果图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种共担载顺铂和阿霉素的复合物，由顺铂、阿霉素与嵌段共聚物复合而成，顺铂与嵌段共聚物通过配位作用复合，阿霉素与嵌段共聚物通过静电作用复合，所述嵌段共聚物具有式（I）或式（II）结构；

式（I）中和式（II）中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60%以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

本发明中，所述具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物为共担载顺铂和阿霉素的载体，顺铂与所述嵌段共聚物中的羧基发生配位作用，阿霉素的氨基与所述嵌段共聚物中的羧基发生静电复合作用，形成复合物。嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值优选大于0.3且小于20，更优选为大于0.5且小于10。嵌段共聚物的羧基与顺铂中Pt的摩尔比的比值优选大于0.3且小于10，更优选为大于0.5且小于8。

在本发明中，所述嵌段共聚物具有式（I）或式（II）结构，式（I）中和式（II）中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基，优选的，独立选自C1～C40烷基或由氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽、LHRH短肽或叶酸取代的烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，优选为-NH-；其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60%以上；由于所述嵌段共聚物是通过羧基与阿霉素的氨基结合的，并且羧基比较活泼，因此在制备所述嵌段共聚物时首先用保护基对羧基进行了保护，制备完成后再脱保护，得到完整的羧基，在这个过程中，可以通过控制反应时间和物料的投料比来调控脱保护的程度，部分R₃可以为所述保护基，所述保护基优选为C1～C6的烷基或苯甲基。

R₄独立地选自氢或疏水基团，优选为C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基或脱氧胆酸基。

在本发明中，所述具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物优选R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢和苯甲基，且氢占全部R₃基团的60%以上；R₄是氢；此时，具有式（I-a）或式（II-a）结构；

在式（I-a）或式（II-a）中，m为聚合度，20≤m≤250，优选为40≤m≤150；n为聚合度，5≤n≤200，优选为10≤n≤100。

本发明提供了一种共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束，包括上述技术方案中所述的复合物和水性介质。

在本发明中，上述技术方案中所述的共载胶束具有聚谷氨酸段和聚乙二醇段，聚（L-谷氨酸）段与药物作用和形成疏水核，处于胶束的内核，而聚乙二醇段为亲水链段。因此在水性介质中，所复合物胶束能够自组装为胶束粒子。

所述的复合物胶束在水性介质中的流体动力学半径优选为10nm~2000nm，更优选为10nm~600nm。

所述水性介质优选为水、生理盐水、葡萄糖溶液，缓冲溶液、细胞培养液、组织培养液或体液，更优选为葡萄糖溶液或缓冲溶液。

本发明还提供了一种共担载顺铂和阿霉素的胶束的制备方法，包括以下步骤：

将阿霉素、顺铂和具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物在水性介质中反应，得到共担载顺铂和阿霉素的胶束；

在本发明中，以阿霉素、顺铂和具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物为原料，本发明对阿霉素、顺铂和嵌段共聚物的加入顺序没有特殊限制，可以先将阿霉素与嵌段共聚物反应，然后加入顺铂反应；也可以先将顺铂与嵌段共聚物反应，然后加入阿霉素反应；还可以将阿霉素、顺铂和嵌段共聚物一起加入反应。所述反应过程优选在避光条件下进行。所述阿霉素与载体的静电复合时间优选2h~72h，更优选12h~48h。所述顺铂与载体配位时间优选48~72。在所述反应过程中，嵌段共聚物的羧基浓度优选为0.1mM~100mM，更优选为1mM~60mM，最优选为2mM~20mM。嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值优选大于0.3且小于20，更优选为大于0.5且小于10。嵌段共聚物的羧基与顺铂中Pt的摩尔比的比值优选大于0.3且小于10，更优选为大于0.5且小于8。

本发明对所述嵌段共聚物的形态没有特殊限制，优选为溶液或冻干粉，更优选为冻干粉；本发明对所述嵌段共聚物的来源也没有特殊限制，优选按照以下方法制备：

无水无氧条件下，γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与具有式（III）或式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚或者具有式（V）或式（VI）的聚乙二醇在有机溶剂中搅拌反应，得到带有保护基的化合物；将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物；

在式（III）、式（IV）、式（V）或式（VI）中，m为聚合度，20≤m≤250，优选为40≤m≤150；

在式（IV）或式（VI）中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10。

在本发明制备所述具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物过程中，所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环或三氯甲烷，所述反应优选在无水条件下进行。

所述具有式（III）或式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚或者具有式（V）或式（VI）结构的聚乙二醇含有伯胺基，因此可以引发γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐发生聚合，可以按照本领域技术人员熟知的常规方法制备。

所述具有式（III）或式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚或者具有式（V）或式（VI）结构的聚乙二醇与所述γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的摩尔比优选为1：5~200，更优选为1：10~100。所述搅拌反应的温度优选为20℃~30℃。所述搅拌反应的时间优选为60h~80h。

本发明对所述带有保护基的化合物脱保护的方法没有特殊限制，一般为溴化氢/乙酸溶液法。

本发明在制备具有式（I）或式（II）结构嵌段共聚物过程中，以γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐为原料，对γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的来源没有特殊限制，可以按照以下方法制备：

L-谷氨酸和苯甲醇在浓硫酸的作用下发生反应，经后处理得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯；

所述γ-苯甲基-L-谷氨酸酯与双（三氯甲基）碳酸酯反应，得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐。

本发明中，所述的复合物胶束还可以以冻干粉的形式存在，优选按照以下方法进行处理：

将所述复合物胶束避光透析、冻干得到所需的复合物冻干粉。

所述透析时间优选为24h~72h，更优选48h~72h，换水次数优选6~10次。

将具有式（I）或式（II）所示结构的嵌段共聚物担载阿霉素的胶束与具有式（I）或式（II）所示结构的嵌段共聚物担载顺铂的胶束联合使用，测定两者的混合物对于肿瘤细胞的毒性，结果表明，将具有式（I）或式（II）所示结构的嵌段共聚物担载阿霉素的胶束与具有式（I）或式（II）所示结构的嵌段共聚物担载顺铂的胶束联合使用时，其对于细胞的抑制效果低于本发明的共担载阿霉素和顺铂的复合物胶束。本发明的共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束的交联结构可以增强胶束稳定性，促进细胞的内吞，因此细胞抑制效果好。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的共担载顺铂和阿霉素的复合物、胶束及胶束的制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

向干燥的反应瓶内加入2.4454g数均分子量为5000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于25mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将6.4460gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于40mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用***进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取6.6330g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于60mL二氯乙酸中，加入18mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用***沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果参见图1，图1为实施例1制备的嵌段共聚物以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图，结果表明，实施例1得到的嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R₃中100%为氢；所述嵌段共聚物的产率为73%，其中，n=45，m=113，记为MPEG₁₁₃-b-PLG₄₅。

实施例2

向干燥的反应瓶内加入1.6251g数均分子量为4000的具有式（V）结构的聚乙二醇，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于15mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.2790gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于30mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用***进行沉降，抽滤，干燥后，得到中间产物。

取制备的中间产物4.4241g在25℃下溶解于40mL二氯乙酸中，搅拌条件下加入9mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应45min，将产物用***沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式（II-a）结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，所述嵌段共聚物具有式（II-a）结构，其中，R₃中92%为氢；所述嵌段共聚物的产率为77%，其中，n=16，m=90,记为PLG₁₆-b-PEG₉₀-b-PLG₁₆。

实施例3

向干燥的反应瓶内加入1.4868g数均分子量为2000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于15mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.9367gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于20mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用***进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取2.5526g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于25mL二氯乙酸中，加入7mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应45min，将产物用***沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R₃中96%为氢；产率为69%，n=10，m=45，记为MPEG₄₅-b-PLG₁₀。

实施例4

向干燥的反应瓶内加入1.2607g数均分子量为2000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.3149gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于30mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用***进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取3.4685g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于35mL二氯乙酸中，加入10mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用***沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R₃中100%为氢，产率为70%，n=20，m=45，记为MPEG₄₅-b-PLG₂₀。

实施例5

向干燥的反应瓶内加入3.0030g数均分子量为5000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与70mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于30mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.3800gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于16mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用***进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取3.5800g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于35mL二氯乙酸中，加入9mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用***沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R₃中100%为氢，产率为67%，n=11，m=113，记为MPEG₁₁₃-b-PLG₁₁。

实施例6

向干燥的反应瓶内加入2.5020g数均分子量为5000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于25mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将3.9740gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于30mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用***进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取3.5140g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于35mL二氯乙酸中，加入9mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用***沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R₃中100%为氢，产率为71%，n=20，m=113，记为MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀。

实施例7

向干燥的反应瓶内加入2.1249g数均分子量为10000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与70mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将3.6362gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于25mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用***进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取4.1340g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于40mL二氯乙酸中，加入12mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应50min，将产物用***沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R₃中98%为氢，产率为73%，n=53，m=227，记为MPEG₂₂₇-b-PLG₅₃。

实施例8

向干燥的反应瓶内加入1.0538g数均分子量为2000的具有式（V）结构的聚乙二醇，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于10mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.1630gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于30mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用***进行沉降，抽滤，干燥后，得到中间产物。

取制备的中间产物3.3529g在25℃下溶解于30mL二氯乙酸中，搅拌条件下加入10mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用***沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式（II-a）结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，所述嵌段共聚物具有式（II-a）结构，其中，R₃中100%为氢，产率为75%，n=10，m=45,记为PLG₁₀-b-PEG₄₅-b-PLG₁₀。

实施例9

向干燥的反应瓶内加入1.5289g数均分子量为10000的具有式（V）结构的聚乙二醇，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于15mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.8175gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于20mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用***进行沉降，抽滤，干燥后，得到中间产物。

取制备的中间产物3.1624g在25℃下溶解于30mL二氯乙酸中，搅拌条件下加入10mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用***沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式（II-a）结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，所述嵌段共聚物具有式（II-a）结构，其中，R₃中100%为氢，产率为70%，n=27，m=227,记为PLG₂₇-b-PEG₂₂₇-b-PLG₂₇。

实施例10

将100mg实施例9得到的PLG₂₇-b-PEG₂₂₇-b-PLG₂₇溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入26.2mg顺铂，37℃避光搅拌48h，而后加入10.1mg阿霉素，37℃避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例10得到的胶束中阿霉素的含量，通过以下公式计算阿霉素在共载胶束中的包埋量（DLC）：

其Pt含量利用电感耦合等离子体质谱测定，通过以下公式计算顺铂在胶束中的包埋量（DLC）：

实施例10得到的胶束中，阿霉素的包埋量为4.03%，顺铂的包埋量为0.6579mmol pt/g。

实施例11

将100mg实施例9得到的PLG₂₇-b-PEG₂₂₇-b-PLG₂₇溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入10.3mg阿霉素，37℃避光搅拌24h，而后加入26.0mg顺铂，37℃避光搅拌48h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为6.79%，顺铂的包埋量为0.6173mmol pt/g。

将得到的冻干粉复溶，对形成的载药胶束进行电位测试，其Zeta电位为-20.3±5.2mV。

复溶后，将载药胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定载药胶束的流体力学半径，其流体力学半径在40nm~210nm之间。

实施例12

将100mg实施例9得到的PLG₂₇-b-PEG₂₂₇-b-PLG₂₇溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入10.1mg阿霉素，26.0mg顺铂，37℃避光搅拌72h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为5.85%，顺铂的包埋量为0.6395mmol pt/g。

实施例13

将100mg实施例9得到的PLG₂₇-b-PEG₂₂₇-b-PLG₂₇溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入26.0mg顺铂，37℃避光搅拌48h，而后加入20.1mg阿霉素，37℃避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为6.41%，顺铂的包埋量为0.6358mmol pt/g。

实施例14

将100mg实施例9得到的PLG₂₇-b-PEG₂₂₇-b-PLG₂₇溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入20.0mg阿霉素，37℃避光搅拌24h，而后加入26.1mg顺铂，37℃避光搅拌48h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为12.61%，顺铂的包埋量为0.5637mmol pt/g。

将得到的冻干粉复溶，对形成的载药胶束进行电位测试，其Zeta电位为-13.6±4.3mV。

复溶后，将载药胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定载药胶束的流体力学半径，其流体力学半径在60nm~300nm之间。

实施例15

将100mg实施例9得到的PLG₂₇-b-PEG₂₂₇-b-PLG₂₇溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入20.2mg阿霉素，26.0mg顺铂，37℃避光搅拌72h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述共载胶束溶液冷冻干燥得到顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为11.39%，顺铂的包埋量为0.5811mmol pt/g。

实施例16

将120mg实施例5得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₁₁溶解于60mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入32.0mg顺铂，37℃避光搅拌48h，而后加入24.1mg阿霉素，37℃避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为6.2733%，顺铂的包埋量为0.6396mmol pt/g。

实施例17

将120mg实施例5得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₁₁溶解于60mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入24.0mg阿霉素，37℃避光搅拌24h，而后加入32.1mg顺铂，37℃避光搅拌48h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为11.11%，顺铂的包埋量为0.5256mmol pt/g。

将得到的冻干粉复溶，对形成的载药胶束进行电位测试，其Zeta电位为-8.7±3.4mV。

复溶后，将载药胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定载药胶束的流体力学半径，结果如图2所示，图2为实施例17制备的复合物胶束的流体力学半径分布图，其流体力学半径在20nm~100nm之间。图3为实施例17制备的复合物胶束的透射电镜图，如图3所示，复合物胶束分布均匀，其粒径大小与光散射结果相符。

实施例18

将120mg实施例5得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₁₁溶解于60mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入24.1mg阿霉素，32.0mg顺铂，37℃避光搅拌72h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为11.64%，顺铂的包埋量为0.5920mmol pt/g。

实施例19

将80mg实施例6得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入16.0mg顺铂，37℃避光搅拌48h，而后加入8.0mg阿霉素，37℃避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为3.1536%，顺铂的包埋量为0.5153mmol pt/g。

实施例20

将80mg实施例6得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入8.1mg阿霉素，37℃避光搅拌24h，而后加入16.0mg顺铂，37℃避光搅拌48h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为6.98%，顺铂的包埋量为0.4784mmol pt/g。

将得到的冻干粉复溶，对形成的载药胶束进行电位测试，其Zeta电位为-16.5±5.1mV。

复溶后，将载药胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定载药胶束的流体力学半径，其流体力学半径在20nm~350nm之间。

实施例21

将80mg实施例6得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入8.0mg阿霉素，16.0mg顺铂，37℃避光搅拌72h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为6.50%，顺铂的包埋量为0.4892mmol pt/g。

实施例22

将80mg实施例6得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入16.0mg顺铂，37℃避光搅拌48h，而后加入16.0mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为6.68%，顺铂的包埋量为0.4910mmol pt/g。

实施例23

将80mg实施例6得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入16.2mg阿霉素，室温避光搅拌24h，而后加入16.0mg顺铂，37℃避光搅拌48h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为13.07%，顺铂的包埋量为0.4419mmol pt/g。

将得到的冻干粉复溶，对形成的载药胶束进行电位测试，其Zeta电位为-10.8±3.7mV。

复溶后，将载药胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定载药胶束的流体力学半径，其流体力学半径在50nm~400nm之间。

实施例24

将80mg实施例6得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入16.0mg阿霉素，16.0mg顺铂，37℃避光搅拌72h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为12.33%，顺铂的包埋量为0.4509mmol pt/g。

实施例25

将80mg实施例2得到的PLG₁₆-b-MPEG₉₀-b-PLG₁₆溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入10.0mg顺铂，37℃避光搅拌48h，而后加入8.0mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为4.06%，顺铂的包埋量为0.3428mmol pt/g。

实施例26

将80mg实施例2得到的PLG₁₆-b-MPEG₉₀-b-PLG₁₆溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入8.1mg阿霉素，室温避光搅拌24h，而后加入10.1mg顺铂，37℃避光搅拌48h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为7.45%，顺铂的包埋量为0.3262mmol pt/g。

将得到的冻干粉复溶，对形成的载药胶束进行电位测试，其Zeta电位为-12.1±4.6mV。

复溶后，将载药胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定载药胶束的流体力学半径，其流体力学半径在30nm~300nm之间。

实施例27

将80mg实施例2得到的PLG₁₆-b-MPEG₉₀-b-PLG₁₆溶解于50mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入8.0mg阿霉素，10.0mg顺铂，37℃避光搅拌72h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到共载顺铂和阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到共载顺铂和阿霉素的复合物粉末剂。

将得到的冻干粉复溶，利用紫外-可见光谱和电感耦合等离子体质谱测定阿霉素和顺铂的含量，按照实施例10提供的公式计算得到阿霉素的包埋量为7.06%，顺铂的包埋量为0.3288mmol pt/g。

实施例28

取实施例17制备的阿霉素复合物溶解在5mL0.01M的pH值为5.5的磷酸盐缓冲溶液中，然后转移至透析袋，透析袋的截留分子量为3500，用40mL相应pH值的缓冲液进行透析，37℃恒温振荡，在特定时间取样3mL，并加入相应量的缓冲液；利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定释放液中阿霉素的浓度，利用电感耦合等离子体质谱测定释放液中顺铂的含量，得到累计释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图4所示。图4为实施例17制备的复合物胶束在pH5.5和pH7.4时顺铂和阿霉素的释放结果图，图4中，曲线A为顺铂在pH5.5时的释放曲线；曲线B为顺铂在pH7.4时的释放曲线；曲线C为阿霉素在pH5.5时的释放曲线；曲线4为阿霉素在pH7.4时的释放曲线。结果表明，复合物胶束具有缓释能力，且其释放受pH影响，在pH5.5环境下比pH7.4环境下，更有利于加速药物释放。

实施例29

收集对数期A549细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（~10⁴个）细胞；

在37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱中培养24h，弃培养液；

用培养基将顺铂和阿霉素裸药稀释为不同浓度梯度的样品，用培养基将实施例17制备的复合物胶束稀释为不同浓度梯度的样品；

阿霉素的浓度设置为：

20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL7个浓度的样品;

顺铂的浓度对应的浓度设置为：

28.4μg/mL、14.2μg/mL、7.1μg/mL、3.55μg/mL、1.775μg/mL、0.8875μg/mL、0.44375μg/mL;

共担载复合物胶束中，阿霉素和顺铂的载药质量百分含量分别为11.11%和15.77%；担载顺铂的质量为担载阿霉素质量的1.42倍；

将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱中培养48h；

48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的阿霉素、顺铂及复合物胶束的细胞存活率。

比较阿霉素、顺铂及复合物胶束的细胞抑制效果参见图5，图5为本发明实施例17制备的复合物胶束、阿霉素裸药和顺铂裸药对

A549细胞的毒性考察结果图。图5中，曲线A为不同浓度的顺铂裸药对细胞存活率的影响曲线；曲线B为不同浓度的阿霉素裸药对细胞存活率的影响曲线；曲线C为具有不同浓度顺铂的复合物胶束对细胞存活率的影响曲线；曲线D为具有不同浓度阿霉素的复合物胶束对细胞存活率的影响曲线。由图5可知，复合物胶束相对顺铂和阿霉素的裸药具有更强的细胞抑制效果，并呈现明显的计量与药效关系。

曲线C的作用不只是由于阿霉素，顺铂也对细胞产生抑制。但通过计算协同系数可以得知，共载胶束相对纯药而言具有协同作用（图7）。

为了定量计算小分子药物联合用药的效果，可通过计算联合用药指数（CI）来分析药物之间的相互作用。CI值计算方法如下：

$\mathrm{CI}=\frac{C^1}{{C_m}^1}+\frac{C^2}{{C_m}^2}$

C¹和C²是药物1和药物2组合使用以达到X%的药物效果的浓度。C_m ¹和C_m ²是单独使用以达到同样效果的浓度。当CI的数值分别低于，等于或超过1表示协同，相加，和拮抗作用。

图6为实施例17制备的复合物胶束的联合用药指数图，结果证实，CI值均小于1，表明上述联合用药具有协同作用。

实施例30

收集对数期A549细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（~10⁴个）细胞；

在37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱中培养24h，弃培养液；

用培养基将实施例17制备的复合物胶束稀释为不同浓度梯度的样品；

阿霉素的浓度设置为：

2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL4个浓度的样品;

顺铂的浓度对应的浓度设置为：

3.55μg/mL、1.775μg/mL、0.8875μg/mL、0.44375μg/mL;

共担载复合物胶束中，阿霉素和顺铂的载药质量百分含量分别为11.11%和15.77%；担载顺铂的质量为担载阿霉素质量的1.42倍；

将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱中培养48h；

48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的共载顺铂和阿霉素的复合物胶束的细胞存活率。

将担载阿霉素复合物胶束及担载顺铂复合物胶束共混物与共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束对于A549细胞的毒性进行比较，结果参见图7。图7为阿霉素裸药、本发明实施例30的共载顺铂和阿霉素的复合物胶束及比较例1的担载阿霉素复合物胶束及担载顺铂复合物胶束共混物对A549细胞的毒性考察结果图。图7中，由左至右分别为阿霉素浓度为2.5μg/mL、顺铂浓度为3.55μg/mL的共载顺铂和阿霉素的复合物胶束，阿霉素浓度为1.25μg/mL、顺铂浓度为1.775μg/mL共载顺铂和阿霉素的复合物胶束，阿霉素浓度为0.625μg/mL、顺铂浓度为0.8875μg/mL的共载顺铂和阿霉素的复合物胶束及阿霉素浓度为0.3125μg/mL、顺铂浓度为0.44375μg/mL的共载顺铂和阿霉素的复合物胶束对A549细胞存活率的影响；

由左至右分别为阿霉素浓度为2.5μg/mL的担载阿霉素的复合物胶束与顺铂浓度为3.55μg/mL的担载顺铂的复合物胶束的共混物，阿霉素浓度为1.25μg/mL的担载阿霉素的复合物胶束与顺铂浓度为1.775μg/mL的担载顺铂的复合物胶束的共混物，阿霉素浓度为0.625μg/mL的担载阿霉素的复合物胶束与顺铂浓度为0.8875μg/mL的担载顺铂的复合物胶束的共混物及阿霉素浓度为0.3125μg/mL的担载阿霉素的复合物胶束与顺铂浓度为0.44375μg/mL的担载顺铂的复合物胶束的共混物对A549细胞存活率的影响；

由左至右分别为浓度为2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL的阿霉素对A549细胞存活率的影响。

比较例1

将120mg实施例5得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₁₁溶解于60mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入24.0mg阿霉素，37℃避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到担载阿霉素的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到担载阿霉素的复合物粉末剂。

将120mg实施例5得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₁₁溶解于60mL去离子水中，调节pH值7.5~8.0，加入32.1mg顺铂，37℃避光搅拌48h，纯水透析48h，换水6次以除去游离药物，得到担载顺铂的复合物胶束。将所述胶束溶液冷冻干燥得到担载顺铂的复合物粉末剂。

收集对数期A549细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（~10⁴个）细胞；

在37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱中培养24h，弃培养液；

用培养基将阿霉素裸药稀释为不同浓度梯度的样品，用培养基将所述担载阿霉素的复合物胶束及担载顺铂的复合物胶束稀释为不同浓度梯度的样品；

阿霉素的浓度设置为：

2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL;

顺铂的浓度对应的浓度设置为：

3.55μg/mL、1.775μg/mL、0.8875μg/mL、0.44375μg/mL;

担载阿霉素的复合物胶束中，阿霉素的载药质量百分数为11.11%；担载顺铂的复合物胶束中，顺铂的载药质量百分数为15.77%。

将阿霉素浓度为2.5μg/mL的担载阿霉素的复合物胶束与顺铂浓度为3.55μg/mL的担载顺铂的复合物胶束等体积混合做为样品1；

将阿霉素浓度为1.25μg/mL的担载阿霉素的复合物胶束与顺铂浓度为1.775μg/mL的担载顺铂的复合物胶束等体积混合做为样品2；

将阿霉素浓度为0.625μg/mL的担载阿霉素的复合物胶束与顺铂浓度为0.8875μg/mL的担载顺铂的复合物胶束等体积混合做为样品3；

将阿霉素浓度为0.3125μg/mL的担载阿霉素的复合物胶束与顺铂浓度为0.44375μg/mL的担载顺铂的复合物胶束等体积混合做为样品4；

各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5%CO₂细胞培养箱中培养48h；

48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的担载阿霉素复合物胶束及担载顺铂复合物胶束共混物的细胞存活率。

将担载阿霉素复合物胶束及担载顺铂复合物胶束共混物与共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束对于A549细胞的毒性进行比较，结果参见图7。

结果表明，共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束对于细胞的抑制效果高于担载阿霉素的复合物胶束与担载顺铂的复合物胶束共混使用时对细胞的抑制效果。共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束的IC50为0.90μg/mL，共混胶束的IC50为1.16μg/mL。共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束的交联结构可以增强胶束稳定性，促进细胞的内吞，因此细胞抑制效果好。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种共担载顺铂和阿霉素的复合物，由顺铂、阿霉素与嵌段共聚物复合而成，顺铂与嵌段共聚物通过配位作用复合，阿霉素与嵌段共聚物通过静电作用复合，所述嵌段共聚物具有式（I）或式（II）结构；

式（I）中和式（II）中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60%以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20，所述嵌段共聚物的羧基与顺铂中Pt的摩尔比的比值小于10。

3.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述保护基为C1～C6的烷基或苯甲基。

4.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述R₁独立地选自C1～C40烷基或由氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽、LHRH短肽或叶酸取代的烷基。

5.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述R₄独立地选自C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基或脱氧胆酸基。

6.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢和苯甲基，且氢占全部R₃基团的60%以上；R₄是氢。

7.一种共担载顺铂和阿霉素的复合物胶束，包括权利要求1~6任意一项所述的共担载顺铂和阿霉素的复合物和水性介质。

8.一种共担载顺铂和阿霉素的胶束的制备方法，包括以下步骤：

将阿霉素、顺铂和具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物在水性介质中反应，得到共担载顺铂和阿霉素的胶束；

式（I）中和式（II）中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60%以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述嵌段共聚物的羧基与顺铂中Pt的摩尔比的比值为小于10。

Images