CN117159745B - 树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和活性多肽的包合物及其制备方法与应用 - Google Patents
树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和活性多肽的包合物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和活性多肽的包合物及其制备方法与应用。本发明涉及的包合物制备方法操作简单，反应条件温和高效，有利于工业化生产。树枝状四联苯[4]芳烃具有良好的水溶性和生物相容性，能够与活性多肽Nap‑FFGVRKKP很好的络合，络合常数为K a =(1.156±0.098)×107 M‑1。包合物能够有效促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和成骨分化，通过增加骨小梁的体积分数和厚度来增加骨量，改善糖皮质激素引起的骨质疏松症。
Description
技术领域
本发明属于超分子化学及生物医药领域，涉及一种树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和活性多肽包合物及其制备方法以及作为骨质疏松症治疗药物的应用。
背景技术
生物活性多肽凭借其易于制备合成、特异性强、生物相容性好等优势在药物递送、疾病治疗、再生医学、免疫调节等方面展现出巨大的潜力。然而其稳定性差、半衰期短、滞留率低等相关问题仍是阻碍其进一步体内应用乃至临床转化的重大挑战。为此，科学家们一直致力于各种递送生物活性多肽的载体的研发，大多为利用纳米材料进行物理封装或者通过聚合物进行化学偶联等，但往往都无法避免的面临包封率低、生物活性减弱等问题。
近年来，基于主客体相互作用来实现多肽递送的方式已经成为超分子化学家的重点研究领域。以环糊精、杯芳烃、葫芦脲和柱芳烃为代表的传统大环通常是利用疏水空腔锚定固有氨基酸残基来带动整体多肽链的递送。然而这种方式对于生物活性多肽的递送是十分不利的，主要是因为他们活性的发挥主要是依靠氨基酸残基与受体的紧密结合。大环空腔对氨基酸残基的包封势必会影响生物活性多肽与相应受体的结合，甚至影响其生物学活性的发挥。因此，生物活性多肽递送载体的选择不仅要具备与多肽较强的络合常数（用于提高其稳定性），而且不能阻碍其活性位点的暴露（便于其与受体结合从而发挥生物学活性）。我们课题组最近提出的基于超大环主客体络合的超分子策略比较完美的兼具了这两点，暗示联苯芳烃类超大环可能是一个很有前景的生物活性多肽递送的候选分子。
骨质疏松症导致的脆性骨折发病率很高，尤其是中老年女性。全球每3秒钟就有1例骨质疏松症导致的骨折发生，致残致死率很高。据估算，至2050年，我国用于骨质疏松骨折的医疗费用将达到254.3亿美元，为社会带来巨大的经济负担。目前临床用于防治骨质疏松症的药物主要有骨吸收抑制剂、骨形成促进剂，其他机制药物，中药等。生长因子是一类能够特异性的与细胞膜受体结合，调节细胞生长和功能的蛋白质，是一种潜在的治疗骨质疏松症的药物。血小板衍生生长因子（PDGFs）在调节成纤维细胞和其他间充质来源细胞的增殖、凋亡、迁移等方面有至关重要的作用，已经被广泛用于组织修复和再生。先前的研究表明，活性多肽Nap-FFGVRKKP是性能优良的PDGF模拟物，其能够通过标准的固相合成的方法得到。我们选用四联苯[4]芳烃为主体，通过修饰支状疏水链来增加其空腔的深度，并在疏水链末端引入多个羧基基团增加其在水溶液中的溶解度，得到了树枝状水溶性四联苯[4]芳烃。我们选择它们分别作为活性多肽和大环的代表，来制备超大环包封生物活性多肽的包合物，并通过骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和成骨分化实验来探究其对糖皮质激素引起的骨质疏松症的治疗作用。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种由式I所示的树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和式Ⅱ所示的PDGF活性多肽（Nap-FFGVRKKP）两者混合组成的包合物，包合物所含两种成分的特征在于具有如下的结构特征：
本发明进一步公开了包合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将式I所示的树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和式Ⅱ所示的PDGF活性多肽（Nap-FFGVRKKP）两种粉末按照摩尔比1:1的比例加入到pH=5.0~9.0的PBS缓冲溶液中，用碳酸钠溶液或盐酸溶液将其 pH 值调节至6.0~7.0，加热至90℃使化合物完全溶解，冷却到室温即制得包合物。
本发明更进一步公开了包合物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用，实验结果显示包合物能够通过Wnt/β-catenin和Hippo/YAP这两条信号通路促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和成骨分化，可以最大程度地保留递送肽的生物活性，从而有效减轻糖皮质激素***（Dex）对BMSCs增殖和分化的损害。后续本发明人又进行了动物实验，采用微计算机断层扫描技术（Micro-CT）和组织学染色评估了其在体内的疗效，包合物组的小鼠骨量明显增加，小梁骨体积分数（BV/TV）增加了40.55%，平均小梁厚度（Tb.Th）增加了17.03%，体内促进成骨的作用明显，能够有效治疗骨质疏松症。这种利用超大环与生物活性多肽形成包合物的策略为生物活性多肽的递送提供了一种通用型的方法，并为基于多肽的药物研发开辟了新的思路。
本发明公开的树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和活性多肽的包合物及其制备方法与应用，所具有的积极效果在于：
（1）本发明涉及的包合物化学结构明确，制备方法操作简单，有利于工业化生产。
树枝状四联苯[4]芳烃具有良好的水溶性，能够与生物活性多肽Nap-FFGVRKKP实现较强的络合（键合常数为 (1.156 ±0.098) ×107M-1）。
（2）这种利用超大环与生物活性多肽形成包合物的策略为生物活性多肽的递送提供了新的思路和方法，为生物活性多肽药物分子的体内递送***的构筑提供了可行性的方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和生物活性多肽Nap-FFGVRKKP的竞争荧光滴定与拟合图；其中A为不断的向浓度均为1×10-6M的Rho123和树枝状水溶性四联苯[4]芳烃1：1混合的PBS缓冲液（pH=7.4）中滴加生物活性多肽Nap-FFGVRKKP时，Rho123的发射光谱图（激发波长为500 nm），B为将A中在525 nm下对应的荧光强度数值和活性多肽浓度根据1:1竞争结合模型拟合出的两者的键合常数；
图2 包合物对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的促增殖效果图；其中A为用CCK-8试剂盒检测的生物活性多肽Nap-FFGVRKKP促进BMSCs增殖的最佳浓度，B为用 CCK-8试剂盒检测的包合物孵育培养1-3天后BMSCs的细胞增殖情况，C为用EdU染色法检测BMSCs的细胞增殖率；
图3 包合物对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的促成骨分化效果图；其中A为成骨分化诱导21天后，光学显微镜下观察茜素红（ARS）染色的照片，B为利用Image J软件对A图中茜素红相对染色面积进行统计的柱状图，C为成骨分化诱导7 天后，光学显微镜下观察碱性磷酸酶（ALP）染色的照片，D为利用Image J软件对C图中碱性磷酸酶相对染色面积进行统计的柱状图；
图4 包合物对骨髓间充质干细胞（BMSCs）促增殖和成骨分化的作用机制图；其中A为BMSCs中β-catenin的免疫荧光染色照片，B为BMSCs中β-catenin蛋白的表达水平，C为BMSCs中YAP的免疫荧光染色照片，D为BMSCs中p-YAP和YAP蛋白的相对表达水平；
图5 包合物对小鼠骨质疏松症的体内治疗效果图；其中A为用微计算机断层扫描技术（Micro-CT）分析检测不同处理组小鼠骨密度照片，B为采用μCT评价程序测量不同处理组小鼠的平均小梁厚度（Tb.Th），C为采用μCT评价程序测量不同处理组小鼠的小梁骨体积分数（BV/TV），D为不同处理组小鼠的胫骨近端骨小梁结构的H&E和Masson染色以及采用免疫组化染色法检测OPN、OCN、p-YAP表达水平的照片。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂例如：罗丹明123、磷酸缓冲盐溶液（PBS缓冲液）、α-MEM基础培养基、胎牛血清、骨髓间充质干细胞（BMSCs）、各种抗体和检测试剂盒等试剂均由市售。
树枝状水溶性四联苯[4]芳烃（参见期刊文献：Zhao, L.; Chen,J.; Tian, L.;Zhang, Y.; Chen, L.; Du, X.; Ma, M.; Li, J.; Meng, Q.; Li, C. SupramolecularDetoxification of Macromolecular Biotoxin through theComplexation by a Large-Sized Macrocycle.Adv. Healthcare Mater.2022, 11, 2200270）
活性多肽Nap-FFGVRKKP（参见发明专利：可模拟血小板衍生因子生物活性的多肽衍生物、纳米纤维及其应用。ZL 201911146406.X）
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
树枝状水溶性四联苯[4]芳烃与生物活性多肽Nap-FFGVRKKP进行竞争荧光滴定的实验步骤：
（1）准备树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和罗丹明123的混合液备用：用天平准确称取0.409 mg树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和0.038 mg罗丹明123溶于100 mL磷酸缓冲盐溶液（PBS缓冲液）中，制的浓度为1×10-6M的两者混合液。
（2）准备生物活性多肽Nap-FFGVRKKP的母液备用：用天平准确称取0.115 mg生物活性多肽Nap-FFGVRKKP溶于10 mL PBS缓冲溶液中，制的浓度为1×10-4M的母液。
（3）先向比色皿中加入2 mL浓度为1×10-6M的步骤（1）制得的混合液，然后用微量进样器向比色皿中依次加入1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、16 μL、32 μL、32 μL、64 μL、64 μL、64μL、64 μL、64 μL浓度为1×10-4M的生物活性多肽Nap-FFGVRKKP的母液，在激发波长Ex=507nm和发射波长Em=529 nm条件下进行荧光光谱测试，得到一系列荧光谱图。
如图1所示，随着生物活性多肽Nap-FFGVRKKP母液的加入，罗丹明123的荧光逐渐恢复、强度逐渐增加，说明生物活性多肽Nap-FFGVRKKP能够将罗丹明123从树枝状水溶性四联苯[4]芳烃大环主体的空腔内竞争出来。通过非线性拟合计算出树枝状水溶性四联苯[4]芳烃与生物活性多肽Nap-FFGVRKKP的键合常数为(1.156 ± 0.098) ×107M-1。结果表明树枝状水溶性四联苯[4]芳烃是一种很好的生物活性多肽Nap-FFGVRKKP的递送载体，这种强的络合作用能够提高生物活性多肽Nap-FFGVRKKP的稳定性，为生物活性多肽体内外疗效的提高奠定了基础。
实施例2
包合物对骨髓间充质干细胞（BMSCs）促增殖效果的实验步骤：
（1）把水浴锅提前升温至 37℃，将培养基、血清等放入水浴锅预热，并且同时打开超净台紫外灯照射30 min； （2）从液氮罐中取出冻存的骨髓间充质干细胞（BMSCs），迅速放置在 37℃的水浴锅中使细胞解冻，之后迅速转移到超净台里进行如下操作：把含细胞的溶液用移液器小心地转移到含有培养基的离心管中，离心 3 min，去上清，用含有10%的胎牛血清的α-MEM培养基重悬，转移到培养皿中，然后放入37℃培养箱中培养； （3）第二天观察细胞状态，待细胞状态良好后，传一代以后进行下面的实验； （4）加 2 mL胰酶，轻轻晃动，均匀覆盖，轻敲培养皿底，37℃消化 3 min，显微镜下观察大多数细胞悬浮，1 mL 枪吹打5-10 下，加 2 mL 培养基，吹打均匀，收集细胞培养液，吸入到离心管中，1000 rpm 转速下离心 3 min，之后弃掉上清溶液，加入含有10%的胎牛血清的α-MEM培养基用枪吹打均匀，用细胞计数板计数为每毫升含有 5×107个细胞。
（5）将细胞重悬于96孔板，每孔5000个细胞100 μL含有10%的胎牛血清的α-MEM培养基，37℃培养箱中过夜培养。第二天吸出α-MEM培养基换成无血清的α-MEM培养基，进行饥饿处理4 h，之后加入含有50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 700 nM, 1 mM包合物和500uM Dex的无血清的α-MEM培养基每孔100 μL，向对照组中加入100 μL的不含任何包合物并且无血清的α-MEM培养基。37℃培养箱中孵育48 h之后每孔加入10 μL CCK-8 和90 μL无血清的α-MEM培养基，4 h后用酶标仪测定450 nm处的OD值。如图2A所示随着包合物浓度增加OD值先增加后减少，说明细胞数量也是先增加后减少，由此筛选出促进细胞增殖最适的包合物浓度为400 nM。
（6）与步骤（5）一样的方式分别用含有400 nM包合物和500 uM Dex的无血清的α-MEM培养基孵育细胞48 h，然后用EdU工作液（1:1000）孵育10 h，之后用4%多聚甲醛室温固定30 min, 0.3% TritonX-100渗透10min。在遮光条件下将EdU染色液加入孔中孵育30min，然后用DAPI染细胞核5 min。最后用激光扫描共聚焦荧光显微镜拍照，对EdU标记的细胞数量进行统计。
如图2A所示包合物浓度在50 nM~1 μM范围内代表细胞数量的OD值都高于对照组，证明包合物能够促进细胞增殖，随着包合物浓度的增加OD值先增加后减少，当为400 nM时OD值最大，由此说明包合物促进细胞增殖的最适浓度为400nM；如图2B所示只含有500 uMDex组的细胞数量明显少于对照组，而含有400 nM包合物和500 uM Dex组的细胞数量明显多于只含有500uM Dex组，由此说明包合物能够有效抵抗Dex造成的细胞凋亡。
实施例3
包合物对骨髓间充质干细胞（BMSCs）促成骨分化效果的实验步骤：
（1）将细胞重悬于96孔板，每孔5000个细胞100 μL含有10%的胎牛血清的α-MEM培养基，37℃培养箱中过夜培养。第二天吸出α-MEM培养基换成无血清的α-MEM培养基，进行饥饿处理4 h，之后加入含有500 uM Dex、400 nM包合物和500 uM Dex的无血清的α-MEM培养基每孔100 μL，向对照组中加入100 μL的不含任何物质的无血清α-MEM培养基。成骨诱导后第7天和第21天分别用碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红（ARS）染色来评价成骨分化和钙沉积情况。
（2）对于ALP染色，将不同处理的BMSCs在室温下用4%甲醛固定20 min，按照碱性磷酸酶显色试剂盒操作步骤进行染色。
（3）对于ARS染色，将不同处理的BMSCs在室温下用95%酒精固定10 min，按照茜素红染色试剂盒操作步骤进行染色。
（4）最后在倒置光学显微镜下拍照，并统计染色区域面积。
如图3A-B所示，加入Dex后茜素红明显减少证明钙沉积明显减少，而加入Dex+包合物后能明显改善这一趋势，钙的沉积变多茜素红面积明显增加，由此说明包合物能够促进钙的沉积；如图3C-D所示，加入Dex后碱性磷酸酶的面积明显减少证明骨分化趋势被抑制，而加入Dex+包合物后，碱性磷酸酶的面积明显增多，由此说明包合物能够促进成骨分化。
实施例4
包合物对骨髓间充质干细胞（BMSCs）促增殖和成骨分化的作用机制实验步骤：
在室温下，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，然后用0.3% Triton X-100在PBS缓冲溶液中渗透10 min，之后用5%山羊血清阻断1 h。然后，用抗β-catenin、YAP的一抗在4℃下过夜，随后用Alexa Fluor®488标记的山羊抗兔二抗在37℃下室温孵育1 h。最后，用DAPI在室温下孵育5 min。在激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察和拍摄图像，统计三次平均值。
如图4A-B所示，荧光显微照片能看出加入Dex后β-catenin的荧光强度明显减少说明β-catenin的表达受到了抑制，与之对应的p-β-catenin的表达明显增强，而加入Dex+包合物后β-catenin的荧光强度明显增强，与之相对应的p-β-catenin的表达明显降低，由此说明包合物能够促进β-catenin的表达、抑制p-β-catenin的表达；同理于图4A-B，包合物促进YAP的表达、抑制p-YAP的表达。
实施例5
包合物对小鼠骨质疏松症的体内治疗效果实验步骤：
选用雄性C57BL/6小鼠30只，8周龄，每只20-25g，用于建立骨质疏松模型，体内评价包合物的骨再生性能。将C57BL/6小鼠随机分为3组，每组10只。其中，随机选取20只小鼠下肢注射Dex（8 mg/kg/天），连续注射6周建立糖皮质激素所致骨质疏松症模型，其余10只小鼠作为对照组，按上述方法注射生理盐水。在接下来的4周内，将20只骨质疏松小鼠随机分为2组，分别肌肉注射Dex（8 mg/kg/天, n=10）或Dex+包合物（8 mg/kg/天; 50 uM 包合物, n=10），对照组继续给予生理盐水注射。第10周处死所有小鼠，用4%多聚甲醛固定后肢，用微计算机断层扫描（CT）评估骨量。脱钙后取胫骨近端切片进行苏木精和伊红（H&E）染色、马松（Masson）染色和免疫组化（IHC）染色分析。
采用vivaCT80型扫描仪，曝光时间为200 ms. 用μCT Tomography V6.4-2软件采集原始数据，μCT Evaluation Program V6.6软件对小梁骨进行三维重建。为了评估胫骨近端微结构，沿着皮质骨和松质骨之间的边界划定小梁骨作为感兴趣区域（ROI）。利用辅助软件对限定ROI内的平均小梁厚度（Tb.Th）和小梁骨体积分数（BV/TV）进行量化。
将小鼠的股骨和胫骨在0.5 M EDTA脱钙1个月，每3天更换一次脱钙溶液，脱水后包埋石蜡。沿冠状面切片一系列3μm厚的切片。用苏木精和伊红（H&E）染色进行组织学观察。免疫组化染色时，OPN、OCN和p-YAP抗体检测相应蛋白在组织切片中的表达情况。马松（Masson）染色法观察胶原纤维，评价新生骨组织的含量。
如图5A-B所示，Dex组小鼠的平均小梁厚度（Tb.Th）和小梁骨体积分数（BV/TV）明显降低，而Dex+包合物组的骨量明显增加，与Dex组相比BV/TV增加了40.55%，Tb.Th增加了17.03%，Tb.Th值基本恢复到对照组的水平；IHC染色（图5C）显示，Dex处理的小鼠OPN和OCN表达减少，p-YAP表达增加，而加入包合物后这一情况被有效逆转。HE和Masson染色进一步显示Dex+包合物组小鼠的骨小梁排列整齐，代表新生骨组织的胶原纤维网络更加明显。
综上所述，本发明制备的树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和活性多肽的包合物在治疗糖皮质激素引起的骨质疏松症方面效果明显。
以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种由式I所示的树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和式Ⅱ所示的PDGF活性多肽（Nap-FFGVRKKP）两者混合组成的包合物在制备治疗骨质疏松治疗药物中的应用，其中所述包合物含两种成分，结构特征如下： 。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述包合物的制备方法包括以下步骤：将式I所示的树枝状水溶性四联苯[4]芳烃和式Ⅱ所示的PDGF活性多肽（Nap-FFGVRKKP）两种粉末按照摩尔比1:1的比例加入到pH=5.0~9.0的PBS缓冲溶液中，用碳酸钠溶液或盐酸溶液将其 pH值调节至6.0~7.0，加热至90℃使化合物完全溶解，冷却到室温即制得包合物。
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