CN110777135A - 一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于绣球菌高产β‑葡聚糖的发酵方法，该方法通过多级放大处理，进而可能的扩大绣球菌生长范围，降低外界限制，并且充分提供发酵生长所需养分；通过天麻提取物增大葡聚糖的提取率，由于天麻提取物中含有大量的天麻素、天麻醇和对羟基苯甲醛，这些物质能够促进菌丝体的生长，同时也葡聚糖合成的关键成分；通过双向发酵可以降低最终产物中的蛋白和淀粉含量，进而提高葡聚糖的纯度，同时也可发挥菌群促进的作用，进一步提高绣球菌的生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法。
背景技术
葡聚糖以β-葡聚糖最具生理活性。β-葡聚糖活性结构是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它们大多数通过β-1,3结合，这是葡萄糖链连接的方式。它能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，因此能提高白细胞素、细胞***素和特殊抗体的含量，全面刺激机体的免疫***。那么，机体就有更多的准备去抵抗微生物引起的疾病。β-葡聚糖能使受伤机体的淋巴细胞产生细胞因子（IL-1）的能力迅速恢复正常，有效调节机体免疫机能。β-葡聚糖可促进体内IgM抗体的产生，以提高体液的免疫能力。这种葡聚糖活化的细胞会激发宿主非专一性防御机制，故应用在肿瘤、感染病和治疗创伤方面深受瞩目。经特殊步骤萃取且不含内毒素的β-1,3葡聚糖在美国FDA已认定是一种安全的物质，可添加在一般食品，许多报导显示老鼠口服酵母β-1,3葡聚糖，可增加强腹膜细胞抗菌之吞噬作用。此外，葡聚糖尚有清除游离基、抗辐射、溶解胆固醇，预防高脂血症作用及抵抗滤过性病毒、真菌、细菌等引起的感染。故广泛用于医药、食品、化妆品等行业。时下酵母葡聚糖已实现产业化。
而作为β-葡聚糖天然来源主体的绣球菌，近些年来也备受关注，由于其含有大量β葡聚糖，比灵芝和姬松茸高出3-4倍，可以说，绣球菌所含的β-葡聚糖为菇类之最。
但是，随着越来越多的受到社会各界的关注和应用，葡聚糖的需求量逐年增加，供不应求，主要是因为葡聚糖的在其原料中的含量有限，导致其较低的提取率。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，通过多级发酵、双向发酵来实现高产β-葡聚糖。
本发明提出一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，包括以下步骤：
S1：菌种活化，将绣球菌种接种于菌种活化培养基上；
S2：初级培养基的制备；
S3：绣球菌初级种子液的制备；从菌种活化培养基上刮取绣球菌种转接到初级培养基中进行培养，得到绣球菌初级种子液；
S4：双向培养种子液的制备；向绣球菌初级培养液中接入双向发酵培养菌种，得到双向培养种子液；
S5：双向发酵培养基的制备；
S6：放大培养种子液的制备；将双向培养种子液和双向发酵培养基按体积比1∶500-900进行接种，即得到放大培养种子液；
S7：放大培养基的制备；
S8：将放大培养种子液和大培养基液按体积比1∶300-800进行放大接种发酵，发酵培养后，即得到β-葡聚糖粗品。
进一步地，S1中的菌种活化温度为25-30℃，静置恒温培养2-3d。
进一步地，S2中初级培养基按照酵母粉5.0-8.0g/L、淀粉8.0-10.0 g/L、蛋白胨10.0-15.0g/L、生物素0.5-1.5g/L、甘油10.0-13.0g/L的质量浓度进行配备。
进一步地，S3中接种后需要在摇床中以200-280rpm的速度震荡培养1-2d，培养温度为25-30℃，培养液OD600值在0.6-0.9之间。
进一步地，所述双向发酵培养菌种为黄伞和大杯伞中的一种或两种。
进一步地，S5中双向发酵培养基按照酵母粉12.0-16.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、生物素2.0-5.0g/L、硫酸钙10.0-15.0g/L、硫酸镁10.0-15.0g/L、硫酸钾10.0-15.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、甘油20.0-26.0g/L的质量浓度进行配备。
进一步地，S6中放大培养种子液需要在25-35℃下，发酵1-2d， pH 范围为5.6-6.2，通气量0.6-0.8vvm，培养液OD600值大于或者等于0.9。
进一步地，S7中的放大培养基按照蔗糖10.0-15.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、的质量浓度进行配备。
进一步地，S8中发酵培养温度为25-32℃，发酵4-7d，通气量为0.6-0.8vvm；定时取样检测，待氮源耗尽时，调pH至5.5-5.6，误差不超过±0.1，通气量为0.7-0.9vvm。
进一步地，所述天麻醇提物的制备方法为：将经过干燥处理的天麻进行粉碎，并用50-60的质量倍数的乙醇进行浸提，浸提后旋蒸，去除乙醇，再用80-100质量倍数的无菌水进行溶解。
本发明的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，该方法通过多级放大处理，进而可能的扩大绣球菌生长范围，降低外界限制，并且充分提供发酵生长所需养分；通过天麻提取物增大葡聚糖的提取率，由于天麻提取物中含有大量的天麻素、天麻醇和对羟基苯甲醛，这些物质能够促进菌丝体的生长，同时也葡聚糖合成的关键成分；通过双向发酵可以降低最终产物中的蛋白和淀粉含量，进而提高葡聚糖的纯度，同时也可发挥菌群促进的作用，进一步提高绣球菌的生长。
具体实施方式
为下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，本领域技术人员对本发明所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本发明实施例中的配比均为以重量计。
天麻醇提物的制备方法为：将经过干燥处理的天麻进行粉碎，并用50-60的质量倍数的乙醇进行浸提，浸提后旋蒸，去除乙醇，再用80-100质量倍数的无菌水进行溶解。
实施例1
S1：菌种活化，菌种活化温度为25-30℃，静置恒温培养2-3d，将绣球菌种接种于菌种活化培养基上；
S2：初级培养基的制备，初级培养基按照酵母粉5.0-8.0g/L、淀粉8.0-10.0 g/L、蛋白胨10.0-15.0g/L、生物素0.5-1.5g/L、甘油10.0-13.0g/L的质量浓度进行配备；
S3：绣球菌初级种子液的制备；从菌种活化培养基上刮取绣球菌种转接到初级培养基中进行培养，接种后需要在摇床中以200-280rpm的速度震荡培养1-2d，培养温度为25-30℃，培养液OD600值在0.6-0.9之间，得到绣球菌初级种子液；
S4：双向培养种子液的制备；向绣球菌初级培养液中接入双向发酵培养菌种，双向发酵培养菌种为黄伞和大杯伞中的一种或两种，得到双向培养种子液；
S5：双向发酵培养基的制备，双向发酵培养基按照酵母粉12.0-16.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、生物素2.0-5.0g/L、硫酸钙10.0-15.0g/L、硫酸镁10.0-15.0g/L、硫酸钾10.0-15.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、甘油20.0-26.0g/L的质量浓度进行配备；
S6：放大培养种子液的制备；将双向培养种子液和双向发酵培养基按体积比1∶500-900进行接种，即得到放大培养种子液，放大培养种子液需要在25-35℃下，发酵1-2d， pH 范围为5.6-6.2，通气量0.6-0.8vvm，培养液OD600值大于或者等于0.9；
S7：放大培养基的制备，放大培养基按照蔗糖10.0-15.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、的质量浓度进行配备；
S8：将放大培养种子液和大培养基液按体积比1∶300-800进行放大接种发酵，发酵培养温度为25-32℃，发酵4-7d，通气量为0.6-0.8vvm；定时取样检测，待氮源耗尽时，调pH至5.5-5.6，误差不超过±0.1，通气量为0.7-0.9vvm，发酵培养后，即得到β-葡聚糖粗品。
实施例2
S1：菌种活化，菌种活化温度为25-30℃，静置恒温培养2-3d，将绣球菌种接种于菌种活化培养基上；
S2：初级培养基的制备，初级培养基按照酵母粉5.0-8.0g/L、淀粉8.0-10.0 g/L、蛋白胨10.0-15.0g/L、生物素0.5-1.5g/L、甘油10.0-13.0g/L的质量浓度进行配备；
S3：绣球菌初级种子液的制备；从菌种活化培养基上刮取绣球菌种转接到初级培养基中进行培养，接种后需要在摇床中以200-280rpm的速度震荡培养1-2d，培养温度为25-30℃，培养液OD600值在0.6-0.9之间，得到绣球菌初级种子液；
S4：双向培养种子液的制备；向绣球菌初级培养液中接入双向发酵培养菌种，双向发酵培养菌种为黄伞和大杯伞中的一种或两种，得到双向培养种子液；
S5：双向发酵培养基的制备，双向发酵培养基按照酵母粉12.0-16.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、生物素2.0-5.0g/L、硫酸钙10.0-15.0g/L、硫酸镁10.0-15.0g/L、硫酸钾10.0-15.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、甘油20.0-26.0g/L的质量浓度进行配备；
S6：放大培养种子液的制备；将双向培养种子液和双向发酵培养基按体积比1∶500-900进行接种，即得到放大培养种子液，放大培养种子液需要在25-35℃下，发酵1-2d， pH 范围为5.6-6.2，通气量0.6-0.8vvm，培养液OD600值大于或者等于0.9；
S7：放大培养基的制备，放大培养基按照蔗糖10.0-15.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、的质量浓度进行配备；
S8：将放大培养种子液和大培养基液按体积比1∶300-800进行放大接种发酵，发酵培养温度为25-32℃，发酵4-7d，通气量为0.6-0.8vvm；定时取样检测，待氮源耗尽时，调pH至5.5-5.6，误差不超过±0.1，通气量为0.7-0.9vvm，发酵培养后，即得到β-葡聚糖粗品。
实施例3
S1：菌种活化，菌种活化温度为25-30℃，静置恒温培养2-3d，将绣球菌种接种于菌种活化培养基上；
S2：初级培养基的制备，初级培养基按照酵母粉5.0-8.0g/L、淀粉8.0-10.0 g/L、蛋白胨10.0-15.0g/L、生物素0.5-1.5g/L、甘油10.0-13.0g/L的质量浓度进行配备；
S3：绣球菌初级种子液的制备；从菌种活化培养基上刮取绣球菌种转接到初级培养基中进行培养，接种后需要在摇床中以200-280rpm的速度震荡培养1-2d，培养温度为25-30℃，培养液OD600值在0.6-0.9之间，得到绣球菌初级种子液；
S4：双向培养种子液的制备；向绣球菌初级培养液中接入双向发酵培养菌种，双向发酵培养菌种为黄伞和大杯伞中的一种或两种，得到双向培养种子液；
S5：双向发酵培养基的制备，双向发酵培养基按照酵母粉12.0-16.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、生物素2.0-5.0g/L、硫酸钙10.0-15.0g/L、硫酸镁10.0-15.0g/L、硫酸钾10.0-15.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、甘油20.0-26.0g/L的质量浓度进行配备；
S6：放大培养种子液的制备；将双向培养种子液和双向发酵培养基按体积比1∶500-900进行接种，即得到放大培养种子液，放大培养种子液需要在25-35℃下，发酵1-2d， pH 范围为5.6-6.2，通气量0.6-0.8vvm，培养液OD600值大于或者等于0.9；
S7：放大培养基的制备，放大培养基按照蔗糖10.0-15.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、的质量浓度进行配备；
S8：将放大培养种子液和大培养基液按体积比1∶300-800进行放大接种发酵，发酵培养温度为25-32℃，发酵4-7d，通气量为0.6-0.8vvm；定时取样检测，待氮源耗尽时，调pH至5.5-5.6，误差不超过±0.1，通气量为0.7-0.9vvm，发酵培养后，即得到β-葡聚糖粗品。
评价：
取上述实施例1、实施例2和实施例3的制得的绣球菌培养基而得到绣球β-葡聚糖以及采用传统发酵法得到的β-葡聚糖纯度和收率对比评价。β-葡聚糖的收率公式为：Y（%）=A/B*100%；纯度公式为：X（%）=C/A*100%，其中B为绣球菌原料重量、A为β-葡聚糖的重量、C为粗提物的重量；本发明具体实施例采用的检测采用紫外可见分光光度计进行检测，检测波长为510nm。测试评价结果如表1。
通过表1可知，本发明实施例1、实施例2和实施例3得到的β-葡聚糖收率较传统发酵工艺有着较为明显的提高。
以上对本发明的实施例进行了示例性说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依据本发明申请范围的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：菌种活化，将绣球菌种接种于菌种活化培养基上；
S2：初级培养基的制备；
S3：绣球菌初级种子液的制备；从菌种活化培养基上刮取绣球菌种转接到初级培养基中进行培养，得到绣球菌初级种子液；
S4：双向培养种子液的制备；向绣球菌初级培养液中接入双向发酵培养菌种，得到双向培养种子液；
S5：双向发酵培养基的制备；
S6：放大培养种子液的制备；将双向培养种子液和双向发酵培养基按体积比1∶500-900进行接种，即得到放大培养种子液；
S7：放大培养基的制备；
S8：将放大培养种子液和大培养基液按体积比1∶300-800进行放大接种发酵，发酵培养后，即得到β-葡聚糖粗品。
2.如权利要求1所述的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：S1中的菌种活化温度为25-30℃，静置恒温培养2-3d。
3.如权利要求1所述的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：S2中初级培养基按照酵母粉5.0-8.0g/L、淀粉8.0-10.0 g/L、蛋白胨10.0-15.0g/L、生物素0.5-1.5g/L、甘油10.0-13.0g/L的质量浓度进行配备。
4.如权利要求1所述的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：S3中接种后需要在摇床中以200-280rpm的速度震荡培养1-2d，培养温度为25-30℃，培养液OD600值在0.6-0.9之间。
5.如权利要求1所述的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：所述双向发酵培养菌种为黄伞和大杯伞中的一种或两种。
6.如权利要求1所述的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：S5中双向发酵培养基按照酵母粉12.0-16.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、生物素2.0-5.0g/L、硫酸钙10.0-15.0g/L、硫酸镁10.0-15.0g/L、硫酸钾10.0-15.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、甘油20.0-26.0g/L的质量浓度进行配备。
7.如权利要求1所述的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：S6中放大培养种子液需要在25-35℃下，发酵1-2d， pH 范围为5.6-6.2，通气量0.6-0.8vvm，培养液OD600值大于或者等于0.9。
8.如权利要求1所述的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：S7中的放大培养基按照蔗糖10.0-15.0g/L、葡萄糖10.0-15.0g/L、淀粉20.0-25.0 g/L、蛋白胨20.0-25.0g/L、天麻醇提物20.0-35.0ml/L、的质量浓度进行配备。
9.如权利要求1所述的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：S8中发酵培养温度为25-32℃，发酵4-7d，通气量为0.6-0.8vvm；定时取样检测，待氮源耗尽时，调pH至5.5-5.6，误差不超过±0.1，通气量为0.7-0.9vvm。
10.如权利要求6或8中所述的一种基于绣球菌高产β-葡聚糖的发酵方法，其特征在于：所述天麻醇提物的制备方法为：将经过干燥处理的天麻进行粉碎，并用50-60的质量倍数的乙醇进行浸提，浸提后旋蒸，去除乙醇，再用80-100质量倍数的无菌水进行溶解。
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