CN110964761B - 一株银耳菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株银耳菌(Tremella fuciformis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.15684。本发明还提供了利用该银耳菌发酵生产银耳孢糖的方法，通过种子液制备、发酵培养、后处理等步骤得到银耳孢糖产品，实际产率可达25g/L以上，总糖含量85％以上；由于使用玉米淀粉加工副产物玉米浆作为主要氮源，同时后处理醇沉过程采用先浓缩后加乙醇沉淀的工艺，与现行工艺相比节约乙醇用量，生产成本显著降低。本发明涉及的银耳菌种还具有生长速度快的特点，整个生产周期明显缩短，银耳孢糖生产效率显著提高，有利于银耳菌深层发酵生产银耳孢糖的产业化。

Description

一株银耳菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一株银耳菌及其在高密度深层发酵制备银耳孢糖中的应用。
背景技术
银耳孢糖(Tremella Polysaccharide)又称银耳多糖，是从银耳(TremellafuciformisBerk)子实体中得到的一种酸性杂多糖，由甘露糖、木糖、葡萄糖、醛酸和少量的岩藻糖组成，以α(1-3)甘露糖为主链。银耳孢糖具有滋阴、润肺、养胃、补肾、补气血等功能，用于治疗各种白细胞减少症、中度骨髓急性放射病、慢性迁延性肝炎和慢性活动性肝炎等，还可以作为慢性气管炎、慢性肺原性心脏病、免疫功能低下患者的辅助用药，在临床上具有很高的使用价值。
目前银耳孢糖主要通过液体深层发酵途径获得，且已经实现产业化。吴大康、张久春等人对银耳菌深层发酵的摇瓶培养条件进行了探索，以添加增稠剂的方式提高产量，该工艺在发酵中加入了琼脂、CMS-Na、明胶、海藻酸钠等增稠剂，这些增稠剂成分单价较高，不适合大生产使用，而且发酵72小时菌体干重仅为5g/L，生产效率低、成本高(银耳深层发酵条件的研究《食品科学》2002，第23卷(第1期)，64-69页)。
中国专利CN102559802B公开了一种用银耳菌深层发酵生产银耳孢糖的方法，发酵72小时菌体干重可达到9.5g/L，但每吨发酵液仅可获得不到9kg左右的成品，生产成本仍相对较高。
中国专利CN107446825A公开了一株可发酵生产银耳孢糖的菌株，虽然产率达到了18g/L，但由于发酵过程使用的蛋白胨作为氮源，氮源成本较高，培养基中需要另外加入维生素B1，且发酵过程需要采用物料流加工艺，生产控制过程较为复杂。
中国专利CN109234334A所述银耳孢糖发酵培养基氮源成分为蛋白质含量在60％以上的玉米蛋白粉和硝酸盐，每级种子培养周期为3～4天，最终银耳多糖的产量为12.8g/L，生产效率较低。
中国专利CN107446825A中所述银耳孢糖的醇沉过程，乙醇用量为发酵液体积的2～3倍，即每吨发酵液乙醇消耗量为2000～3000L，成本较高。
发明内容
本发明提供了一株银耳菌，以及应用该银耳菌进行高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，能够解决上述现有技术问题中的一种或几种。
根据本发明的一个方面，提供了一株银耳菌(Tremellafuciformis)，已于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.15684。
该银耳菌的形态为：菌落胶质，浅黄白色，直径约20mm；显微镜下可见菌丝形成酵母状分生孢子，分生孢子大小为4.5～5.5×3.0～3.5μm。
本发明提供了上述银耳菌在银耳孢糖的制备中的应用。
本发明提供了一种采用上述银耳菌进行高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，按照如下步骤进行：
(1)菌种培养：将银耳菌接入种子培养基，培养得种子液；
(2)发酵生产：将(1)中所得种子液转接入发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液；
(3)提取：发酵结束后，发酵液经浓缩后加入乙醇进行沉淀，静置分层后，离心取沉淀物，干燥并粉碎后得银耳孢糖。
在一些实施方式中，种子培养基的配比为：葡萄糖5～15g/L，蔗糖15～30g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，酵母浸膏5～15g/L。
在一些实施方式中，发酵培养基的配比为：葡萄糖20～50g/L，蔗糖5～30g/L，磷酸二氢钾0.1～0.8g/L，酵母浸膏1.5～5.0g/L，尿素0.5～2.0g/L，玉米浆5～20g/L。
玉米浆的固体物质含量45％以上，含有丰富的氨基酸和多肽类氮源物质，还含有丰富的维生素和生物素及有机酸类营养成分。在银耳孢糖生产中用玉米浆作为主要氮源，能够降低培养基成本，同时，玉米浆提供丰富的维生素和生物素能有效提高菌种生长速度，增加产量的同时缩短生长周期。
在一些实施方式中，种子液的制备方法如下：
①将银耳菌转接在PDA斜面培养基，并控制温度为18～25℃，培养4～7天，得银耳菌斜面菌种；
②取①中所得斜面菌种接种到种子培养基中，并控制温度18～25℃，摇瓶培养1～2天，得摇瓶种子液；
③取②中所得摇瓶种子液接入种子培养基中，接种量1％～10％，控制温度18～25℃，通入无菌空气，控制空气流量为0.5～1.5vvm，培养1～2天，得一级种子液。
由此，对银耳菌种进行了扩大培养。
在一些实施方式中，一级种子液可以按照步骤③继续扩大培养。将所得的一级种子液按照同样的培养方法在种子培养基内进行多次扩大培养得到二级种子液、三级种子液、四级种子液等多级种子液，根据菌种的生长情况以及实际生成的需求选择合适的种子培养基进行发酵生产。由此，可以刺激菌种的良好生长，有利于提高发酵的生产效率。
在一些实施方式中，进行发酵生产时，将种子液以5％～15％的接种量转接入发酵培养基，通入无菌空气，通气量：0.5～1.0vvm，搅拌频率：20～25Hz，维持DO值15～55％，控制温度为18～25℃，发酵周期68～73小时。由此，为银耳菌的发酵提供优良的环境条件，菌体可以有效利用培养基中的营养成品，一方面促进菌体的生长和繁殖，另一方面也有利于促进银耳孢糖的生产。
在一些实施方式中，步骤(3)中乙醇浓度为95～99％，乙醇的用量为浓缩后发酵液体积的2～3倍。使用95～99％乙醇对发酵液进行沉淀，银耳孢糖的分离效果明显，可以保证银耳孢糖的产率。
在一些实施方式中，在使用乙醇进行沉淀之前，先将发酵液减压浓缩至原体积的1/2至1/5。由此可以大幅度减少乙醇的用量，降低生产成本。
在一些实施方式中，步骤(3)中所得沉淀物经过真空干燥，直到干燥失重在6％以下，粉碎后得银耳孢糖成品。
采用该银耳菌进行高密度深层发酵制备银耳孢糖，银耳孢糖产量可达25g/L以上，显著提高生产效率。
本发明的有益效果：提供了一株银耳菌，该银耳菌种在种子培养期生长较快，可以有效缩短整个生产周期。本发明所述的银耳菌菌株能够利用成本较低的玉米浆作为主要氮源，通过发酵得到高产量的银耳孢糖，有效降低了培养基成本，并在增加产量的同时缩短了生长周期。
醇沉过程先将发酵液浓缩至原体积的1/2～1/5，再加2～3倍体积的乙醇，乙醇用量较现行工艺减少50％以上，能够有效降溶剂消耗低成本；同时发酵液浓缩后体积减小，有利于提高洁净区设备生产效率。
本发明所述工艺通过优化发酵过程中的工艺参数，无需流加物料，生产过程操作简单易于控制。发酵72小时后，菌体干重可达26g/L(实际产率为25g/L)以上，本发明所述工艺与现行工艺相比成本显著降低，生产效率显著提高，有利于提高银耳孢糖的产业化程度。
生物保藏说明
本发明提供的一株银耳菌(Tremellafuciformis)，已于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.15684，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为本发明银耳菌的菌落形态图；
图2为图1所示银耳菌的电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例提供了一株银耳菌(Tremellafuciformis)，该菌种已于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15684。这株银耳菌在PDA培养基上，25℃黑暗条件下培养10天，菌落胶质，浅黄白色，直径20mm，如图1所示；菌丝形成酵母状分生孢子，分生孢子大小为4.5～5.5×3.0～3.5μm，镜检图片如图2中所示，该菌种的ITS rRNA序列如SEQ ID No.1所示，与GenBank中银耳Tremellafuciformis的ITS序列相似度为100％。
实施例2
本实施例提供了一种高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，采用的菌种为实施例1中的银耳菌(Tremellafuciformis)。
本实施例的具体步骤如下：
(1)将银耳菌转接在PDA斜面培养基上，并控制温度为18℃，培养4天，得银耳菌斜面菌种；
(2)将(1)中银耳斜面菌种接种到1000mL摇瓶种子培养基中，摇瓶种子培养基的配比：葡萄糖8g/L，蔗糖20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，酵母浸膏15g/L，其余为水。接种后置于恒温摇床上，控制温度为18℃，转速180rpm,培养2天，得摇瓶种子液；
(3)将步骤(2)中摇瓶种子液1L接入100L一级种子培养基中，该培养基配比为：葡萄糖8g/L，蔗糖20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，酵母浸膏15g/L。接种完毕后，控制温度为18℃，空气流量0.75vvm，搅拌频率20Hz，维持DO值40％，培养2天，得一级种子液；
(4)将步骤(3)中的一级种子液100L转接入2000L发酵培养基中，发酵培养基配比为：葡萄糖25g/L，蔗糖5g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，酵母浸膏2.0g/L，尿素1.5g/L，玉米浆15g/L。接种后，控制通气量：0.8vvm，搅拌频率23Hz，维持DO值35％，控制温度为18℃进行发酵培养。
(5)发酵72小时后，测得发酵罐中菌体干重达到26.1g/L。将发酵液浓缩至500L，降至室温后加入1250L浓度为95％的乙醇，搅拌2小时，静置分层。将沉淀物离心甩干，真空干燥7小时，干燥失重3.1％，粉碎、称重，得银耳孢糖成品53.0kg，产率25.2g/L，总糖含量(以无水葡萄糖计)86.2％。
发酵中选用的银耳菌种在种子培养期生长较快，生长周期短。进入发酵阶段后，要获得细胞的快速增殖和高产量的银耳孢糖，则需要提供大量的碳源和氮源。发酵培养基以葡萄糖和蔗糖为碳源，以酵母浸膏、尿素和玉米浆为氮源。其中酵母浸膏与种子培养基中的氮源相同，保证转接到发酵培养基的菌体能够尽快适应新的培养基。少量的尿素作为速效氮源可在短时间内为细胞增殖提供营养，价格低廉的玉米浆不仅含有丰富的氨基酸和多肽类氮源物质，还含有丰富的维生素和生物素及有机酸类营养成分，能有效提高菌种生长速度，增加产量的同时缩短生长周期。
采用实施例1中的菌种进行发酵，在18℃的温度下培养，发酵过程中维持DO值35％，72小时后，测得发酵罐中菌体干重已达到26g/L以上。说明该菌种的生长要求低，营养需求简单，适应能力强。与现行工艺相比大幅提高了银耳孢糖的生产效率和产率。
实施例3
本实施例提供了一种高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，采用的菌种为实施例1中的银耳菌(Tremellafuciformis)。
本实施例的具体步骤如下：
(1)将银耳菌转接在PDA斜面培养基上，并控制温度为25℃，培养7天，得银耳菌斜面菌种；
(2)将(1)中银耳斜面菌种接种到6瓶各1000mL的摇瓶种子培养基中，摇瓶种子培养基的配比：葡萄糖12g/L，蔗糖15g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，酵母浸膏5g/L。接种后置于恒温摇床上，控制温度为25℃，转速180rpm，培养1天，得摇瓶种子液；
(3)将步骤(2)中摇瓶种子液共6L接入200L一级种子培养基中，一级种子培养基的配比：葡萄糖12g/L，蔗糖15g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，酵母浸膏5g/L。接种后，通入无菌空气，并控制温度为25℃，搅拌频率25Hz，通气量1.0vvm，培养1天，得一级种子液；
(4)将步骤(3)中的一级种子液200L接入2000L发酵培养基中。发酵培养基的配比为：葡萄糖35g/L，蔗糖25g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，酵母浸膏2.0g/L，尿素1.5g/L，玉米浆12g/L。接种后通入无菌空气培养，通气量0.8vvm，搅拌频率25Hz，维持DO值45％，控制温度为25℃进行发酵培养；
(5)发酵68小时后，测得发酵罐中菌体干重达到26.4g/L，发酵中选用的银耳菌种生长较快，所得发酵液中菌体干重增加，有利于提高银耳孢糖的产量。将发酵液浓缩至800L，降至室温后加入95％乙醇2400L，搅拌1小时后静置分层，将发酵液浓缩后再进行醇沉，降低了乙醇的用量，缩短了提取时间。将所得沉淀物离心甩干，真空干燥6小时，干燥失重1.9％，粉碎、称重，得银耳孢糖成品重量55.9kg，产率25.4g/L，总糖含量(以无水葡萄糖计)85.8％。
发酵中选用的银耳菌种在种子培养期生长较快，生长周期短，种子培养基中的葡萄糖和蔗糖为菌种的增殖提供了充足的碳源，并以酵母浸膏作为主要的氮源，有效满足了菌体繁殖的营养需求，控制温度25℃，采用摇瓶通气培养，使得菌体在种子培养期迅速增殖。
菌种转入发酵培养基后，继续以葡萄糖和蔗糖为碳源，以酵母浸膏、尿素和玉米浆为氮源。其中碳源物质与种子培养基相同，并且酵母浸膏与种子培养基中的氮源相同，保证转接到发酵培养基的菌体能够尽快适应新的培养基，加快菌体的生长与银耳孢糖的合成。采用实施例1中的菌种进行发酵，保证发酵温度适宜，并通入空气，维持DO值45％，延长发酵中稳定期的时间，促进银耳孢糖的合成。68小时后，测得发酵罐中菌体干重已达到26g/L以上，并且所得银耳孢糖总糖含量高，品质优良。
实施例4
本实施例提供了一种高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，采用的菌种为实施例1中的银耳菌(Tremellafuciformis)。
本实施例的具体步骤如下：
(1)将银耳菌转接在PDA斜面培养基上，并控制温度为20℃，培养5天，得银耳菌斜面菌种；
(2)将步骤(1)中银耳斜面菌种接种到4瓶各1000mL的摇瓶种子培养基中，摇瓶种子培养基的配比：葡萄糖12g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，酵母浸膏10g/L。接种后置于恒温摇床上，转速180rpm；并控制温度为20℃，培养2天，得摇瓶种子液；
(3)将步骤(2)中摇瓶种子液4L接入100L一级种子培养基中，一级种子培养基的配比：葡萄糖12g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，酵母浸膏10g/L。接种后通入无菌空气，通气量0.75vvm，并控制温度为20℃，培养1天，得一级种子液；
(4)将步骤(3)中的一级种子液100L接入2000L发酵培养基中，发酵培养基的配比为：葡萄糖45g/L，蔗糖5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，酵母浸膏2.0g/L，尿素0.5g/L，玉米浆20g/L。接种后通入无菌空气培养，通气量0.8vvm，搅拌频率23Hz，维持DO值35％，控制温度为20℃，进行发酵培养；
(5)发酵70小时后，测得发酵罐中菌体干重达到26.5g/L。将发酵液浓缩至500L，降至室温后加入99％乙醇1000L，搅拌2小时后静置分层，发酵液浓缩后减少了乙醇用量，缩短提取时间。沉淀物离心甩干，真空干燥5小时，干燥失重为2.6％，粉碎、称重，得银耳孢糖成品重量57.6kg，产率26.2g/L，总糖含量(以无水葡萄糖计)85.2％。
发酵中选用的银耳菌种在种子培养期生长较快，生长周期短。菌种转入发酵培养基后，以葡萄糖和蔗糖为碳源，酵母浸膏、尿素和玉米浆为氮源。其中玉米浆作为主要氮源，用量较实施例2和实施例3进一步增加，而其它氮源的用量相对较少。发酵过程维持DO值35％，发酵70小时后，菌体干重已达到26g/L以上。与现行工艺相比不仅大幅提高了生产效率和产率，也呈现出低成本优势。
实施例5
本实施例提供了一种高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，采用的菌种为实施例1中的银耳菌(Tremellafuciformis)。
本实施例的具体步骤如下：
(1)将银耳菌转接在PDA斜面培养基上，并控制温度为25℃，培养6天，得银耳菌斜面菌种；
(2)将(1)中银耳斜面菌种接种到6瓶各5000mL的摇瓶种子培养基中，摇瓶种子培养基的配比：葡萄糖5g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，酵母浸膏8g/L。接种后置于恒温摇床上，控制温度为25℃，转速180rpm，培养1.5天，得摇瓶种子液；
(3)将步骤(2)中摇瓶种子液共30L接入300L一级种子培养基中，一级种子培养基的配比：葡萄糖5g/L，蔗糖28g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，酵母浸膏8g/L。接种后，通入无菌空气，并控制温度为25℃，搅拌频率25Hz，通气量0.5vvm，培养1.5天，得一级种子液；
(4)将步骤(3)中的一级种子液300L接入2000L发酵培养基中。发酵培养基的配比为：葡萄糖20g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，酵母浸膏1.5g/L，尿素0.8g/L，玉米浆20g/L。接种后通入无菌空气培养，通气量0.5vvm，搅拌频率20Hz，维持DO值15％，控制温度为25℃进行发酵培养；
(5)发酵73小时后，测得发酵罐中菌体干重达到26.2g/L。将发酵液浓缩至460L，降至室温后加入98％乙醇1200L，搅拌1小时后静置分层，沉淀物离心甩干，真空干燥6小时，干燥失重6％，粉碎、称重，得银耳孢糖成品重量57.7kg，产率25.1g/L，总糖含量(以无水葡萄糖计)85.5％。
发酵中选用的银耳菌种在种子培养期生长较快，生长周期短。菌种转入发酵培养基后，以葡萄糖和蔗糖为碳源，酵母浸膏、尿素和玉米浆为氮源。其中，氮源物质中酵母浸膏与种子培养基中的氮源相同，保证转接到发酵培养基的菌体能够尽快适应新的培养基，加快菌体的生长与银耳孢糖的合成。通入无菌空气，维持发酵过程中DO值15％，提供了良好的发酵环境，延缓菌体进入衰亡期的时间。发酵73小时后，菌体干重达到26g/L以上，与现行工艺相比大幅提高了生产效率，提高了产率。另外，发酵培养基中以玉米浆作为主要氮源物质，大幅降低了生产成本。
实施例6
本实施例提供了一种高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，采用的菌种为实施例1中的银耳菌(Tremellafuciformis)。
本实施例的具体步骤如下：
(1)将银耳菌转接在PDA斜面培养基上，并控制温度为20℃，培养7天，得银耳菌斜面菌种；
(2)将(1)中银耳斜面菌种接种到6瓶各1000mL的摇瓶种子培养基中，摇瓶种子培养基的配比：葡萄糖20g/L，蔗糖15g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，酵母浸膏12g/L。接种后置于恒温摇床上，控制温度为25℃，转速180rpm，培养1天，得摇瓶种子液；
(3)将步骤(2)中摇瓶种子液共6L接入200L一级种子培养基中，一级种子培养基的配比：葡萄糖20g/L，蔗糖18g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，酵母浸膏12g/L。接种后，通入无菌空气，并控制温度为25℃，搅拌频率23Hz，通气量1.5vvm，培养2天，得一级种子液；
(4)将步骤(3)中的一级种子液200L接入2000L发酵培养基中。发酵培养基的配比为：葡萄糖50g/L，蔗糖10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，酵母浸膏5.0g/L，尿素2.0g/L，玉米浆5g/L。接种后通入无菌空气培养，通气量1.0vvm，搅拌频率25Hz，维持DO值55％，控制温度为25℃进行发酵培养；
(5)发酵72小时后，测得发酵罐中菌体干重达到26.8g/L。将发酵液浓缩至1100L，降至室温后加入95％乙醇2400L，搅拌1小时后静置分层，沉淀物离心甩干，真空干燥6小时，干燥失重2.3％，粉碎、称重，得银耳孢糖成品重量56.3kg，产率25.6g/L，总糖含量(以无水葡萄糖计)85.7％。
发酵中选用的银耳菌种在种子培养期生长较快，生长周期短。菌种转入发酵培养基后，继续以葡萄糖和蔗糖为碳源，以酵母浸膏、尿素和玉米浆为氮源，实现菌体的快速生长，并促进银耳孢糖的大量合成。发酵72小时后，菌体干重达到26g/L以上。发酵液适当浓缩后再进行银耳孢糖的提取，乙醇的用量相应减少。与现行工艺相比，具有产量高成本低的优势。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏远大仙乐药业有限公司
<120> 一株银耳菌及其应用
<130> 2019.05.23
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 502
<212> rRNA基因ITS1-5.8S-ITS2区序列
<213> 银耳(Tremella fuciformis)
<400> 1
aggccctacc tgatttgagg ccagagtgca aagtaaaggg ggttgtgagc ggcccacagt 60
cgacgcgtaa cttacgacgt ctgcgtgaaa ccactaacgc atttaaggcc agccagagag 120
gcagggccca aatccaacac cgccgggtca gaaacccagg gggttgagtc tacatgacac 180
tcaaacaggc atgcctttcg gaataccaaa aggcgcaagg tgcgttcaaa gattcgatga 240
ttcactgaat tctgcaattc acattacttt tcgcaattcg ctgcgttctt catcgatgcg 300
agagccaaga gatccgttgt tgaaagttgt ttcatgttat gatgcattac grrcttgaca 360
tatgtttgtg tgaaggcggc ccggcccggg ggcgcggtcc gatgtgcaca ggtgtttgga 420
agggcctcgt ggcccggtgt aatctcaaat gatccttccg caggttcacc tacggaaacc 480
ttgttacgac ttttacttcc ca 502

Claims (10)

1.一株银耳菌(Tremella fuciformis)，其特征在于，所述银耳菌已于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15684。
2.如权利要求1所述的一株银耳菌在银耳孢糖制备中的应用。
3.一种高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，其特征在于，采用权利要求2中所述的银耳菌作为菌种，该银耳菌的保藏编号为CGMCC NO.15684，按照如下步骤进行：
(1)菌种培养：将银耳菌接入种子培养基，培养得种子液；
(2)发酵生产：将(1)中所得种子液转接入发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液；
(3)提取：发酵结束后，发酵液经浓缩后加入乙醇进行沉淀，离心取沉淀物。
4.根据权利要求3所述的高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，其特征在于，所述种子培养基的配比为：葡萄糖5～20g/L，蔗糖15～30g/L，磷酸二氢钾0.1～1g/L，酵母浸膏5～15g/L；所述发酵培养基的配比为：葡萄糖20～50g/L，蔗糖5～30g/L，磷酸二氢钾0.1～0.8g/L，酵母浸膏1.5～5.0g/L，尿素0.5～2.0g/L，玉米浆5～20g/L。
5.根据权利要求3所述的高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述种子液的制备方法如下：
①将银耳菌转接在PDA斜面培养基，温度18～25℃，培养4～7天，得银耳菌斜面菌种；
②取①中所得斜面菌种接种到种子培养基中，温度18～25℃，摇瓶培养1～2天，得摇瓶种子液；
③取②中所得摇瓶种子液接入种子培养基中，接种量1％～10％，温度18～25℃，通气量0.5～1.5vvm，培养1～2天，得一级种子液。
6.根据权利要求5所述的高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，其特征在于，所述一级种子液可以按照步骤③继续扩大培养。
7.根据权利要求3所述的高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，其特征在于，步骤(2)中种子液用量为发酵培养基体积的5％～15％，接种后培养条件为通气量0.5～1.0vvm，搅拌频率20～25Hz，维持DO值15～55％，温度为18～25℃，发酵周期不超过73小时。
8.根据权利要求3所述的高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，其特征在于，步骤(3)中所述乙醇浓度为95％～99％，所述乙醇的用量为浓缩后发酵液体积的2～3倍，步骤(3)中所得沉淀物经过真空干燥，直到干燥失重在6％以下，粉碎后得银耳孢糖成品。
9.根据权利要求8所述的高密度深层发酵制备银耳孢糖的方法，其特征在于，在使用乙醇进行提取之前，可以先将发酵液减压浓缩至原体积的1/2至1/5。
10.根据权利要求3～9中任意一项所述的方法，其特征在于，银耳孢糖产量为25g/L以上。
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