CN110184244A - 一种绣球菌产漆酶的制备方法 - Google Patents

一种绣球菌产漆酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种绣球菌产漆酶的制备方法，包括以下步骤：（1）取混合果皮作为发酵基质，混合活性炭进行均质，过滤，灭菌后，得果皮固态培养基；（2）于果皮固态培养基中接种已活化的绣球菌菌株，进行一次发酵培养；（3）对一次发酵产物进行漆酶酶活监测，待酶活达到峰值后挑取步骤（2）中所得绣球菌菌丝团，接种于含Cu2+及诱导剂的液体培养基中，摇瓶产酶后转移至发酵罐；（4）在发酵罐中添加氨基寡糖及生物发酵消泡剂，进行二次深层发酵，发酵产物即为绣球菌产漆酶，漆酶酶活高，绣球菌发酵菌龄适宜，发酵菌株纯度高，产量大。

Description

一种绣球菌产漆酶的制备方法
技术领域
本发明涉及绣球菌领域，具体涉及一种绣球菌产漆酶的制备方法。
背景技术
木质素和与木质素前体结构相似的污染物是环境污染的重要来源之一，近年来利用真菌漆酶降解此类污染物已经成为环境保护研究的热点，尤其是在纸浆漂白、染料脱色、环境污染物质脱毒与降解等方面漆酶显示出了较大的研究价值与应用潜力。
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶、哺乳动物血浆铜蓝蛋白和胆红素氧化酶等同属于蓝色多铜氧化酶家族，而绣球菌可分泌漆酶、 锰过氧化物酶或木质素过氧化物酶等几种常见的胞外酶，这些木质素降解酶均分布在胞外，由于胞外酶无需将细胞破坏便可直接获取，使该降解酶系的利用更加简便。
现有技术中有利用真菌发酵产漆酶的方法，常见的如液体深层发酵或固体发酵，而液体深层发酵容易产生氧气循环差而不利于好氧绣球菌的生长发育的问题，同时，由于绣球菌为巨型真菌，菌丝体易缠绕在动力设备上，堵塞管路，并且菌丝的无序扩张还会提高发酵液的粘稠度，严重影响物料、氧气和热量的均匀传递和扩散；而固体发酵固体发酵周期长、产酶量不高，易在菌株转入生殖生长时，菌丝之间相互扭结，从而抑制了菌株胞外产酶，且由于固体发酵空间相对液体发酵开放，易混入其他杂菌从而降低产酶效率。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种绣球菌产漆酶的制备方法，漆酶酶活高，绣球菌发酵菌龄适宜，发酵菌株纯度高，产量大。
本发明的技术方案是，一种绣球菌产漆酶的制备方法，包括以下步骤：（1）取混合果皮作为发酵基质，混合活性炭进行均质，过滤，灭菌后，得果皮固态培养基；（2）于果皮固态培养基中接种已活化的绣球菌菌株，进行一次发酵培养；（3）对一次发酵产物进行漆酶酶活监测，待酶活达到峰值后挑取步骤（2）中所得绣球菌菌丝团，接种于含Cu2+及诱导剂的液体培养基中，摇瓶产酶后转移至发酵罐；（4）在发酵罐中添加氨基寡糖及生物发酵消泡剂，进行二次深层发酵，发酵产物即为绣球菌产漆酶。
优选地，所述诱导剂包括木脂素、香豆素、查尔酮、邻香兰素中的一种或几种。
优选地，所述果皮为等质量的马蹄皮、菠萝皮、柚皮、橙皮、龙眼皮的混合物。
优选地，所述活性炭的添加量为混合果皮质量的1/10-1/5。
优选地，所述一次发酵培养的温度为30℃-35℃，光照下发酵。
优选地，所述漆酶酶活监测的开始时间为一次发酵后的第6-8天。
优选地，所述液体培养基成分包括1份诱导剂、马铃薯浸出液、20份葡萄糖、1份蛋白胨、3份KH2PO4、3份MgSO4·7H2O、3份(NH4) 2SO4、10份玉米粉、1份CuSO4·5H2O，1份天然底物，以马铃薯质量为250份计。
优选地，所述天然底物为茶叶、稻草、麦草、花生壳、豆粕、蔗渣、桔皮、玉米杆、麦麸中的一种或几种。
优选地，所述摇瓶产酶接种量20%，摇床150rpm，温度28℃。
优选地，所述二次深层发酵的接种量为10%，通气量为0.5-1.0vvm，温度为30-40℃，搅拌转速为200-300rpm。
大多数真菌漆酶是一种含糖的酸性单体蛋白，通常由多肽链、多糖和铜原子三个部分组成，在理化性质方面具有诸多的共性，但来源于不同菌种的漆酶之间，也存在着不同程度的差异，如来源不同的漆酶其功能不同，因此以绣球菌为来源制备漆酶，需根据绣球菌特殊的发酵特性调整生长发酵条件，如绣球菌与其他腐生菌需要阴暗潮湿的环境不同，其子实体需要光照100小时以上才可生长为绣球状，因此发酵条件也设置了光照。
本方案中，先利用固体培养基培养活化的菌株，在菌株发酵产酶到峰值后，再挑取绣球菌菌丝团接种于液体培养基中摇瓶产酶，最后再进行发酵罐深层发酵，扩大生产，相较于单纯用液体发酵或固体发酵而言，两种发酵环境的交替使用除了克服单纯的液体发酵或固体发酵带来的不良影响外，通过先固体培养，绣球菌菌丝生长于固体培养基上，更易分辨和挑取绣球菌菌丝，而选择性的将非绣球菌菌丝留在固体培养基内，避免杂菌的混入，使得深度发酵时，菌种更纯，发酵效率更高，也避免了其他非目标性发酵产物的混入，而且在固体发酵过程中，菌株产酶在菌丝长满时达到最大值，然而在原基形成时酶活却急剧下降，这是由于绣球菌菌株在营养生长期间需要不断分泌漆酶来分解底物，从而获得自身扩繁的养料，而当菌株转入生殖生长时，菌丝之间相互扭结，从而抑制了菌株胞外产酶及产漆酶；若直接进行发酵罐的深层发酵，相当于菌株在发酵罐中直接增殖同时分泌漆酶，而作为细胞或菌株增殖而言，初期细胞数量不多时，选择相对生长环境大小合适的培养环境更利于菌株的增殖和***，对于绣球菌等真菌而言，菌龄太短往往出现前期生长缓慢，发酵周期延长，菌丝体开始形成的时间推迟；菌龄过长，则引起菌丝体过早自溶，导致生产能力下降，因此在固体培养后再进入发酵罐培养，使得菌株在菌龄合适的情况下，进行扩大培养，深层发酵分泌漆酶，菌体量的增加使培养液中的酶活力水平增高，另外由于漆酶是主要的木质素生物降解酶之一，它能加速木质芳香族高分子化合物的分解，为菌丝提供生长所需要的营养，发酵液中漆酶活性越高，菌株分解能力就越强，菌丝生长速度也就越快。
果皮可以作为一种发酵基质，富含糖类和蛋白类物质，可为菌体的生长和代谢提供养料，特别是马蹄皮、菠萝皮、柚皮、橙皮、龙眼皮含有一定量的木质素、纤维素或者半纤维素外还含有一定的胶质，可作为绣球菌分泌漆酶的诱导物为微生物，利用果皮作菌菇培养基质生产漆酶可实现废物利用，节约资源，对环境的可持续发展 具有重要意义，本方案中在果皮的发酵基质中混入了活性炭，一方面活性炭可作为碳源，另一方面活性炭为多孔结构，具有较强的吸附能力和静电引力，在固体培养基培养时，将菌丝吸附到表面固定，使菌丝有序生长，不至于缠结。
加入诱导剂的作用机理为它能够与某些阻遏目标蛋白合成的物质相结合，使其发生变构效应，降低这些物质对酶蛋白合成的阻遏作用，促进基因转录、翻译以生成相应的酶蛋白，能够诱导白腐菌产漆酶的物质大多为一些与木质素结构类似的低分子芳香族化合物和木质素降解的碎片化合物，它们大部分是漆酶的作用底物，木脂素、香豆素、查尔酮、邻香兰素在结构上都是含羟基或者氨基的芳香环化合物，均能达到诱导效果。
酶蛋白的活性基团中通常含有金属元素，如Cu、Mn、Zn、Fe 等，是微生物合成酶蛋白所必须的营养元素，某些金属元素也是酶蛋白活性的激活剂，对酶活力的影响不容忽视，因此液体培养基中添加金属元素很有必要，值得一提的是，在培养基中添加一定量的 Cu2+离子，由于漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，每个酶蛋白分子中大都含有四个铜离子，因此相关基因转录合成漆酶时需要元素铜的存在，而在限铜或缺铜的培养条件下，漆酶的合成则会受影响。
利用丝状真菌具有向固体物质表面粘附的自然属性，采用固定化技术来控制绣球菌的自由生长，其优势是能够便捷的从液体培养基中分离出菌体细胞，简化了补料和后续操作，以实现连续发酵产酶，细胞固定化技术还能够降低发酵液的粘稠度，使发酵液的流变特性更有利于氧气的供给和物料的传递，此外，这种技术还能够保护菌丝细胞免受剪切力作用，降低酸碱度、温度、有毒物质等外界环境的对菌丝细胞生长和产酶的干扰，本方案中采用氨基寡糖作为固定剂。
本方案的有益效果如下：
（1）本方案中，先利用固体培养基培养活化的菌株，在菌株发酵产酶到峰值后，再挑取绣球菌菌丝团接种于液体培养基中摇瓶产酶，最后再进行发酵罐深层发酵，菌株更纯，发酵时，菌龄合适，产漆酶酶活更高；
（2）果皮混合活性炭作为固体培养基，将菌丝吸附到表面固定，使菌丝有序生长，不至于缠结，利于菌丝生长。
（3）加入诱导剂及Cu2+，加速漆酶的合成。
（4）利用氨基寡糖作为固定剂固定菌株，提高发酵效率。
附图说明
图1为漆酶酶活检测数据；
图2为菌丝形态观察结果。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
配置斜面培养基活化绣球菌菌株，称取200g马铃薯、20g葡萄糖、18g琼脂粉、3gKH2PO4、1.5gMgSO4、1mL浓度为0.05g/L的维生素B1、1L蒸馏水，配置斜面培养基，30℃培养绣球菌菌株2天，使绣球菌菌株得以活化；
在直径为9cm的培养皿中分别加入马蹄皮、菠萝皮、柚皮、橙皮、龙眼皮、各5g，活性炭0.5g，蒸馏水25mL，于121℃灭菌30min，冷却后，接入绣球菌菌株，置于30℃光照培养，观察菌丝长势，在培养的第6、10、15、20天取样用于测定漆酶活力，至酶活不再增长。
称取1g木脂素、1L马铃薯浸出液、20g葡萄糖、1g蛋白胨、3gKH2PO4、3gMgSO4•7H2O、3g(NH4) 2SO4、10g玉米粉、1gCuSO4•5H2O，1gFeSO4，1gMnSO4，1g茶叶，搅拌均匀，灭菌制得液体培养基，其中马铃薯浸出液用250g马铃薯配以1L蒸馏水制备，挑取上述固体培养基中接种量20%的绣球菌菌丝团，剔除杂菌，接种至液体培养基中，摇瓶培养，摇床150rpm，温度28℃，光照培养7天；
按上述比例，扩大配置液体培养基至5L，并于发酵罐中添加2g氨基寡糖作为固定剂，1g生物发酵消泡剂，所述生物发酵消泡剂为市售产品，按体积接种量10%绣球菌，通气量为0.5vvm，温度为30℃，搅拌转速为200rpm，进行深层发酵，发酵液即为漆酶粗液。
实施例2
配置斜面培养基活化绣球菌菌株，称取200g马铃薯、20g葡萄糖、18g琼脂粉、3gKH2PO4、1.5gMgSO4、1mL浓度为0.05g/L的维生素B1、1L蒸馏水，配置斜面培养基，30℃培养绣球菌菌株2天，使绣球菌菌株得以活化；
在直径为9cm的培养皿中分别加入马蹄皮、菠萝皮、柚皮、橙皮、龙眼皮、各5g，活性炭1g，蒸馏水25mL，于121℃灭菌30min，冷却后，接入绣球菌菌株，置于35℃光照培养，观察菌丝长势，在培养的第8、12、17、22天取样用于测定漆酶活力，至酶活不再增长。
称取1g香豆素、1L马铃薯浸出液、20g葡萄糖、1g蛋白胨、3gKH2PO4、3gMgSO4•7H2O、3g(NH4) 2SO4、10g玉米粉、1gCuSO4•5H2O，1gFeSO4，1gMnSO4，1g稻草，搅拌均匀，灭菌制得液体培养基，其中马铃薯浸出液用250g马铃薯配以1L蒸馏水制备，挑取上述固体培养基中接种量20%的绣球菌菌丝团，剔除杂菌，接种至液体培养基中，摇瓶培养，摇床150rpm，温度28℃，光照培养7天；
按上述比例，扩大配置液体培养基至5L，并于发酵罐中添加2g氨基寡糖作为固定剂，1g生物发酵消泡剂，所述生物发酵消泡剂为市售产品，按体积接种量10%绣球菌，通气量为1.0vvm，温度为40℃，搅拌转速为300rpm，进行深层发酵，发酵液即为漆酶粗液。
实施例3
配置斜面培养基活化绣球菌菌株，称取200g马铃薯、20g葡萄糖、18g琼脂粉、3gKH2PO4、1.5gMgSO4、1mL浓度为0.05g/L的维生素B1、1L蒸馏水，配置斜面培养基，30℃培养绣球菌菌株2天，使绣球菌菌株得以活化；
在直径为9cm的培养皿中分别加入马蹄皮、菠萝皮、柚皮、橙皮、龙眼皮、各5g，活性炭0.8g，蒸馏水25mL，于121℃灭菌30min，冷却后，接入绣球菌菌株，置于32℃光照培养，观察菌丝长势，在培养的第7、11、16、21天取样用于测定漆酶活力，至酶活不再增长。
称取1g查尔酮、1L马铃薯浸出液、20g葡萄糖、1g蛋白胨、3gKH2PO4、3gMgSO4•7H2O、3g(NH4) 2SO4、10g玉米粉、1gCuSO4•5H2O，1gFeSO4，1gMnSO4，1g稻草，搅拌均匀，灭菌制得液体培养基，其中马铃薯浸出液用250g马铃薯配以1L蒸馏水制备，挑取上述固体培养基中接种量20%的绣球菌菌丝团，剔除杂菌，接种至液体培养基中，摇瓶培养，摇床150rpm，温度28℃，光照培养7天；
按上述比例，扩大配置液体培养基至5L，并于发酵罐中添加2g氨基寡糖作为固定剂，1g生物发酵消泡剂，所述生物发酵消泡剂为市售产品，按体积接种量10%绣球菌，通气量为0.8vvm，温度为35℃，搅拌转速为250rpm，进行深层发酵，发酵液即为漆酶粗液。
实施例4
配置斜面培养基活化绣球菌菌株，称取200g马铃薯、20g葡萄糖、18g琼脂粉、3gKH2PO4、1.5gMgSO4、1mL浓度为0.05g/L的维生素B1、1L蒸馏水，配置斜面培养基，30℃培养绣球菌菌株2天，使绣球菌菌株得以活化；
在直径为9cm的培养皿中分别加入马蹄皮、菠萝皮、柚皮、橙皮、龙眼皮、各5g，活性炭0.8g，蒸馏水25mL，于121℃灭菌30min，冷却后，接入绣球菌菌株，置于32℃光照培养，观察菌丝长势，在培养的第7、11、16、21天取样用于测定漆酶活力，至酶活不再增长。
称取1g邻香兰素、1L马铃薯浸出液、20g葡萄糖、1g蛋白胨、3gKH2PO4、3gMgSO4•7H2O、3g(NH4) 2SO4、10g玉米粉、1gCuSO4•5H2O，1gFeSO4，1gMnSO4，1g稻草，搅拌均匀，灭菌制得液体培养基，其中马铃薯浸出液用250g马铃薯配以1L蒸馏水制备，挑取上述固体培养基中接种量20%的绣球菌菌丝团，剔除杂菌，接种至液体培养基中，摇瓶培养，摇床150rpm，温度28℃，光照培养7天；
按上述比例，扩大配置液体培养基至5L，并于发酵罐中添加2g氨基寡糖作为固定剂，1g生物发酵消泡剂，所述生物发酵消泡剂为市售产品，按体积接种量10%绣球菌，通气量为0.8vvm，温度为35℃，搅拌转速为250rpm，进行深层发酵，发酵液即为漆酶粗液。
实施例5
配置斜面培养基活化绣球菌菌株，称取200g马铃薯、20g葡萄糖、18g琼脂粉、3gKH2PO4、1.5gMgSO4、1mL浓度为0.05g/L的维生素B1、1L蒸馏水，配置斜面培养基，30℃培养绣球菌菌株2天，使绣球菌菌株得以活化；
称取1g木脂素、1L马铃薯浸出液、20g葡萄糖、1g蛋白胨、3gKH2PO4、3gMgSO4•7H2O、3g(NH4) 2SO4、10g玉米粉、1gCuSO4•5H2O，1gFeSO4，1gMnSO4，1g茶叶，搅拌均匀，灭菌制得液体培养基，其中马铃薯浸出液用250g马铃薯配以1L蒸馏水制备，接种绣球菌菌丝团，接种至液体培养基中，摇瓶培养，摇床150rpm，温度28℃，光照培养7天；
按上述比例，扩大配置液体培养基至5L，并于发酵罐中添加2g氨基寡糖作为固定剂，1g生物发酵消泡剂，所述生物发酵消泡剂为市售产品，按体积接种量10%绣球菌，通气量为0.5vvm，温度为30℃，搅拌转速为200rpm，进行深层发酵，发酵液即为漆酶粗液。
实施例6
配置斜面培养基活化绣球菌菌株，称取200g马铃薯、20g葡萄糖、18g琼脂粉、3gKH2PO4、1.5gMgSO4、1mL浓度为0.05g/L的维生素B1、1L蒸馏水，配置斜面培养基，30℃培养绣球菌菌株2天，使绣球菌菌株得以活化；
在直径为9cm的培养皿中分别加入马蹄皮、菠萝皮、柚皮、橙皮、龙眼皮、各5g，蒸馏水25mL，于121℃灭菌30min，冷却后，接入绣球菌菌株，置于30℃光照培养，观察菌丝长势，在培养的第6、10、15、20天取样用于测定漆酶活力，至酶活不再增长。
称取1g木脂素、1L马铃薯浸出液、20g葡萄糖、1g蛋白胨、3gKH2PO4、3gMgSO4•7H2O、3g(NH4) 2SO4、10g玉米粉、1gCuSO4•5H2O，1gFeSO4，1gMnSO4，1g茶叶，搅拌均匀，灭菌制得液体培养基，其中马铃薯浸出液用250g马铃薯配以1L蒸馏水制备，挑取上述固体培养基中接种量20%的绣球菌菌丝团，剔除杂菌，接种至液体培养基中，摇瓶培养，摇床150rpm，温度28℃，光照培养7天；
按上述比例，扩大配置液体培养基至5L，并于发酵罐中添加2g氨基寡糖作为固定剂，1g生物发酵消泡剂，所述生物发酵消泡剂为市售产品，按体积接种量10%绣球菌，通气量为0.5vvm，温度为30℃，搅拌转速为200rpm，进行深层发酵，发酵液即为漆酶粗液。
实施例7
配置斜面培养基活化绣球菌菌株，称取200g马铃薯、20g葡萄糖、18g琼脂粉、3gKH2PO4、1.5gMgSO4、1mL浓度为0.05g/L的维生素B1、1L蒸馏水，配置斜面培养基，30℃培养绣球菌菌株2天，使绣球菌菌株得以活化；
在直径为9cm的培养皿中分别加入马蹄皮、菠萝皮、柚皮、橙皮、龙眼皮、各5g，蒸馏水25mL，于121℃灭菌30min，冷却后，接入绣球菌菌株，置于30℃光照培养，观察菌丝长势，在培养的第6、10、15、20天取样用于测定漆酶活力，至酶活不再增长。
称取1L马铃薯浸出液、20g葡萄糖、1g蛋白胨、3gKH2PO4、3gMgSO4•7H2O、3g(NH4)2SO4、10g玉米粉、1gFeSO4，1gMnSO4，1g茶叶，搅拌均匀，灭菌制得液体培养基，其中马铃薯浸出液用250g马铃薯配以1L蒸馏水制备，挑取上述固体培养基中接种量20%的绣球菌菌丝团，剔除杂菌，接种至液体培养基中，摇瓶培养，摇床150rpm，温度28℃，光照培养7天；
按上述比例，扩大配置液体培养基至5L，并于发酵罐中添加2g氨基寡糖作为固定剂，1g生物发酵消泡剂，所述生物发酵消泡剂为市售产品，按体积接种量10%绣球菌，通气量为0.5vvm，温度为30℃，搅拌转速为200rpm，进行深层发酵，发酵液即为漆酶粗液。
实施例8
测定实施例1-7中各阶段酶活，测定方法为：4ml反应体系中含0.5mmol/L的ABTS作为反应底物，0.1mol/L的檬酸酸-檬酸钠缓冲液（pH4.0），1ml稀释的粗酶液。35℃反应5min，于波长420nm处测吸光度，取吸光度变化的线性部分，按Bradford法测定蛋白质含量。定义：每分钟催化氧化1μmolABST氧化所需的酶量为一个酶活力单位，单位以U/g表示，如表1所示。
观察实施例1-7发酵罐中的菌丝形态，判定生物量，如表2所述。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取混合果皮作为发酵基质，混合活性炭进行均质，过滤，灭菌后，得果皮固态培养基；（2）于果皮固态培养基中接种已活化的绣球菌菌株，进行一次发酵培养；（3）对一次发酵产物进行漆酶酶活监测，待酶活达到峰值后挑取步骤（2）中所得绣球菌菌丝团，接种于含Cu2+及诱导剂的液体培养基中，摇瓶产酶后转移至发酵罐；（4）在发酵罐中添加氨基寡糖及生物发酵消泡剂，进行二次深层发酵，发酵产物即为绣球菌产漆酶。
2.根据权利要求1所述的一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，所述诱导剂包括木脂素、香豆素、查尔酮、邻香兰素中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，所述果皮为等质量的马蹄皮、菠萝皮、柚皮、橙皮、龙眼皮的混合物。
4.根据权利要求1所述的一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，所述活性炭的添加量为混合果皮质量的1/10-1/5。
5.根据权利要求1所述的一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，所述一次发酵培养的温度为30℃-35℃，光照下发酵。
6.根据权利要求1所述的一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，所述漆酶酶活监测的开始时间为一次发酵后的第6-8天。
7.根据权利要求1所述的一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，所述液体培养基成分包括1份诱导剂、马铃薯浸出液、20份葡萄糖、1份蛋白胨、3份KH2PO4、3份MgSO4·7H2O、3份(NH4) 2SO4、10份玉米粉、1份CuSO4·5H2O，1份FeSO4，1份MnSO4，1份天然底物，以马铃薯质量为250份计。
8.根据权利要求7所述的一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，所述天然底物为茶叶、稻草、麦草、花生壳、豆粕、蔗渣、桔皮、玉米杆、麦麸中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，所述摇瓶产酶接种量20%，摇床150rpm，温度28℃。
10.根据权利要求1所述的一种绣球菌产漆酶的制备方法，其特征在于，所述二次深层发酵的接种量为10%，通气量为0.5-1.0vvm，温度为30-40℃，搅拌转速为200-300rpm。
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