CN110770335A - 使用多能干细胞的免疫细胞的分化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过使用多能干细胞来诱导造血干细胞或巨噬细胞的分化的方法、以及用于诱导分化的组合物。具体地，涉及在多能干细胞中包含骨形态发生蛋白4的用于诱导分化造血干细胞的组合物、或包含骨形态发生蛋白4及巨噬细胞集落刺激因子的用于诱导分化巨噬细胞的组合物、使用它们诱导分化的方法。本发明的优点在于，由于诱导分化的方法中使用的细胞因子的种类少，分化方法简单，因此与现有诱导分化的方法相比，分化效率提高了数十倍且分化的细胞的收率高。

Description

使用多能干细胞的免疫细胞的分化
技术领域
本发明涉及从多能干细胞分化诱导造血干细胞或巨噬细胞分化的方法及其用于诱导分化的组合物。所分化的造血干细胞还可以分化为巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞等的骨髓(myeloid)类细胞。
本发明的诱导分化的方法的特征在于，在从多能干细胞分化巨噬细胞的步骤中，不形成拟胚体(embryonic body)(细胞聚集体(aggregate))，而是直接分化。并且，通过使用阶段性处理用于诱导分化的添加物、排除抑制分化的组合物的方法、将白蛋白聚乙烯醇必需脂质(APEL)用作分化用基本培养基的方法等，来与已知方法相比，具有优异的收率。
背景技术
多能干细胞是指能够分化为人体所有细胞的未分化状态的干细胞。自1990年代后期建立人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)之后正式开始的干细胞领域的研究自2000年代中期在制备诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)方面取得突破性业绩以来，取得了飞跃性发展。并且，最近在建立人体细胞核移植胚胎干细胞(human somatic-cell nuclear transfer ESCs，hSCNT-ESCs)方面的成功活跃了对干细胞领域的进一步研究。
在这种使用干细胞的研究领域中，正在进行关于在细胞培养中将细胞分化为所需的种类的方法的研究，尤其正在进行更有效分化它们的方案的研究作为主要问题。未分化状态的干细胞随着分化而失去干细胞的特性，并逐渐具有分化的细胞原有特性，在此过程中，形态发生素(morphogen)及生长因子(growth factor)等的各种信号物质根据发生步骤依次且组合工作。通过将这些因子添加到培养中的干细胞培养液中来诱导分化。
先天性免疫反应是保护我们的身体免受外部入侵病原体侵害的第一道防线，也称为非特异性免疫。中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等参与先天性免疫反应，先天性免疫反应的开始与病原体的种类或是否存在感染经历无关。
巨噬细胞作为负责先天性免疫反应的细胞，遍布全身。大部分巨噬细胞具有粘性，并包含尘埃细胞、小胶质细胞、库珀细胞、朗格汉斯细胞等，当它们识别抗原时，将抗原吞噬，或分泌毒素以破坏抗原，通过向淋巴细胞传递抗原以触发免疫反应。巨噬细胞以未分化的单核细胞(monocyte)存在于某些血液中，单核细胞可根据需要分化为树突状细胞或巨噬细胞，并且所述各种信号物质参与巨噬细胞的分化。
像这样，可通过诱导多能干细胞的分化来获得所需细胞，尤其，如本发明的分化为免疫细胞可以用于各种疾病诊断或药物筛选方法。由此，需要开发可以提高分化效率及最终细胞的收率的新型诱导干细胞分化的方法及用于诱导分化的组合物。
因此，本发明人为了开发出通过改进之前开发的方案来以高效率诱导造血干细胞或巨噬细胞的的分化的方法，确认了使各种基本培养基通过测试、细胞因子组成的变化、信号传递物质的顺序调节等来从多能干细胞经造血干细胞成功诱导分化为巨噬细胞的方法，并以此完成了本发明。
通过确认由本发明的新型诱导分化的方法生产的巨噬细胞具有与人类中存在的巨噬细胞非常高的相似性，从而能够以多种方式利用。
现有专利文献
非专利文献
Meguma K.Saito等，Plos One，Published:April 3，2013(https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059243)
专利文献
韩国公开专利第10-2011-0020468号
国际公开专利第2016114723号
美国授权专利第8372642号
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供通过调节包含骨形态发生蛋白4(BMP4)及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等的各种信号物质来从多能干细胞有效诱导骨髓(myeloid)类造血干细胞及巨噬细胞分化的方法。
本发明的另一目的在于，提供用于诱导分化来源于多能干细胞的骨髓类造血干细胞及巨噬细胞的组合物，所述组合物包含用于执行所述方法的骨形态发生蛋白4(BMP4)及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。
解决问题的手段
为了解决所述问题，本发明提供包括：将在mTeSR1或mTeSR8基本培养基中培养的多能干细胞保持在涂敷有玻连蛋白(vitronectin)或基质胶(matrigel)的皿的步骤；将转移到包含骨形态发生蛋白4的诱导造血干细胞分化的培养基中进行培养的步骤；通过对所述多能干细胞处理并培养血管内皮生长因子及干细胞因子后，处理信号物质来诱导骨髓类造血干细胞分化的步骤；以及将包含分化的所述造血干细胞的巨噬细胞集落刺激因子转移至诱导巨噬细胞分化的培养基并以105细胞/cm2以上的密度培养的步骤的诱导分化来源于多能干细胞的巨噬细胞的方法。
作为另一实施方式，本发明提供基于白蛋白聚乙烯醇必需脂质(APEL)培养基包含骨形态发生蛋白4及巨噬细胞集落刺激因子的用于诱导分化来源于多能干细胞的巨噬细胞的组合物。
具体地，本发明提供对多能干细胞高浓度处理骨形态发生蛋白4(BoneMorphogenetic Protein 4，BMP4)2天，低浓度处理2天来进行中胚层诱导(mesoderminduction)之后，仅处理血管内皮生长因子(VEGF)及干细胞因子(SCF)的细胞因子来分化为造血干细胞的方法。在此情况下，其特征在于，排除干扰分化的碱性成纤维细胞生长因子等。并且，其特征在于，通过进一步添加CDDO甲酯(CDDO metyl ester)来进一步提高骨髓类造血祖细胞的收率。
本发明涉及为了将分化的造血干细胞成熟为骨髓类造血祖细胞，处理白细胞介素3、白细胞介素-6、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)及血小板生成素(TPO)的细胞因子来仅获得纯骨髓类造血祖细胞的方法。所述步骤的特征在于，不处理巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，在与现有方法相比可以提高纯骨髓类造血祖细胞的收率的方面可以认为是有效的分化方法。
本发明涉及包括对骨髓类造血祖细胞仅处理巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage-Colony Stimulating Factor，M-CSF)来诱导巨噬细胞分化的步骤的诱导分化的方法。
本发明的诱导分化的方法具有如下的特征：分化效率高，直接分化而没有拟胚体形成步骤因此分化方法简单，与现有方法相比，分化的细胞的收率高数十倍以上。
根据本发明的诱导分化的方法分化的巨噬细胞广泛应用于需要大量细胞的各种领域中。
发明的效果
本发明的诱导巨噬细胞分化的方法包括诱导从多能干细胞分化为骨髓(myeloid)类造血干细胞后，再诱导分化为巨噬细胞的步骤，作为通过使用包含骨形态发生蛋白4及巨噬细胞集落刺激因子等的各种信号物质来诱导分化的所述方法及包含所述信号物质的用于诱导分化的组合物，具有分化步骤简单、细胞因子数量少、由于分化效率增加因此分化细胞的收率高的效果。
附图说明
图1为具体图示本发明的诱导骨髓类诱导造血干细胞分化的方法的图，是示出四种造血干细胞分化基本培养基的造血干细胞分化方案。
图2示出用荧光标记的作为为了确认根据各个基本培养基的造血干细胞分化结果而只在造血干细胞中特意性表达的标记的CD34+CD45+。
图3示出用定量细胞数量标记分别由标记表达来区分的CD34+CD45+造血干细胞(HSPC)的收率，意味着从5个菌落(colony)生成的CD34+CD45+造血干细胞的数量。
图4示出对诱导造血干细胞分化时处理化合物CDDO甲酯的情况和未处理的情况下的CD34+CD45+造血干细胞的收率进行比较。
图5示出将根据本发明的基本培养基生成的造血干细胞的血液细胞分化能力示为菌落形成能力。巨噬细胞集落形成单位(Granulocyte Macrophage-colony forming unit，GM)示出包含巨噬细胞的骨髓类血液细胞分化能力。基于白蛋白聚乙烯醇必需脂质(APEL)基本培养基的本发明的造血干细胞分化方法大多具有向骨髓类细胞的分化能力。
图6为具体图示本发明的诱导巨噬细胞分化的方法的图，表示诱导分化的整个方案。
图7为与已知方案进行比较的示意图。与已知方案相比，在步骤2中去除了碱性成纤维细胞生长因子，在步骤3中去除了干细胞因子和巨噬细胞集落刺激因子并添加了IL6。在步骤4中去除了FL3及粒细胞巨噬细胞刺激因子。与已知方案相比，以第28天为基准，巨噬细胞的收率增加了约3.8倍，而与直到结束时生产的量相比，增加了100倍。这表明本发明是减少细胞因子的数量同时增加收率的方法。
图8示出本发明中的巨噬细胞的生产效率，示出用荧光标记当漂浮的造血干细胞分化为巨噬细胞时的巨噬细胞特异性标记表达。
图9示出表达巨噬细胞特异性标记的细胞的百分比(％)，即，定量示出纯度。
图10定量示出从20个多能干细胞菌落中生产的巨噬细胞的数量。
图11示出为了确认完成分化的巨噬细胞，作为通过调理的微珠确认所述细胞的巨噬作用的结果，通过流式细胞分析仪分析呈荧光的细胞的百分比并定量的图。
图12示出通过基因表达模式分析所分化的巨噬细胞和人类巨噬细胞的相似性的结果，其示出通过主成分分析(PCA)统计学上确认本发明的分化的巨噬细胞(iMAC)、从人类血液中分离的人类单核细胞来源巨噬细胞(hMDM)、以及人类巨噬细胞细胞株(Thp-1)的基因表达的相似性的相关可能性的结果。
图13为证明与分化的巨噬细胞的病毒和细菌有关的感染可能性的结果，是向分化的巨噬细胞感染H3N2感冒病毒或嗜吞噬细胞无形体细菌后，用离心涂片(cytospin)方法染色巨噬细胞并用显微镜观察。
图14为示出用透射式电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察感染的所述巨噬细胞的细胞内感染的病毒和细菌的结果。
图15为示出向分化的巨噬细胞感染病毒或细菌之后，活性氧(ROS)增加的图。
图16为示出向分化的巨噬细胞感染病毒或细菌之后，炎性细胞因子的分泌增加的图。
图17为证明对分化的巨噬细胞的结核菌的感染可能性的结果，示出当用感染之后按照感染复数(MOI)0～20处理结核菌(Mycoplasma Tuberculosis)时的感染率，将感染率示为巨噬细胞比结核菌的量。
具体实施方式
本发明人通过研究将多能干细胞分为造血干细胞或巨噬细胞的方法来完成了使用少量的细胞因子的同时分化效率及巨噬细胞的收率高的本发明的方法。
具体地，本发明的诱导巨噬细胞分化的方法包括：在mTeSR1或mTeSR8基本培养基中培养多能干细胞并以未分化的状态保持在涂敷有基质胶(matrigel)或玻连蛋白(vitronectin)的皿的步骤；使在所述基本培养基中培养的多能干细胞每35个饼状皿中保持5个菌落以下的步骤；基于白蛋白聚乙烯醇必需脂质(APEL)培养基仅骨形态发生蛋白4(BMP4)高浓度处理2天并低浓度处理2天，并且转移到造血干细胞分化诱导培养基进行培养的步骤；基于白蛋白聚乙烯醇必需脂质(APEL)培养基对所述多能干细胞处理血管内皮生长因子(VEGF)及干细胞因子(SCF)并进行培养后，通过处理另外的信号物质来诱导分化为造血干细胞的步骤；以及基于无血清细胞冻存培养基(RPMI)培养基将分化的所述造血干细胞转移到包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的诱导巨噬细胞分化的培养基，并以105细胞/cm2以上的密度进行培养的步骤。
“骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)”是属于转化生长因子(Transforming Growth Factorβ，TGF-β)超家族的肽生长因子。已知骨形态发生蛋白在哺乳动物中促进肝细胞向骨细胞或软骨细胞的分化(参照Jiwang Zhang，Linheng Li.BMPsignaling and stem cell regulation(2005)Developmental Biology 284 1-11)。据报告，在骨诱导性骨形态发生蛋白在骨形成过程中，当肝细胞分化为成骨细胞时，用作第一个信号分子，尤其在骨折愈合过程中，当形成骨时，骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4、骨形态发生蛋白7主要起到作用(参照M.Egermann，C.A.Lill，and K.Criesbeck，Effects ofBMP-2genetransfer on bone healing in sheep(2006)Gene Therapy，Vol.13，No.17，1290-1299)。并且，据报告，骨形态发生蛋白4及骨形态发生蛋白6具有诱导骨及软骨的功能(参照Morone MA，Boden SD，Hair G等，自体腰椎融合术中的基因表达及骨形态发生蛋白2的作用(Gene expression during autograft lumbar spine fusion and the effect ofbone morphogenetic protein 2)(1998)Clin Orthop(351)252；Gruber R，kandlerB.Fuerst G等，猪窦黏膜可容纳对骨形态发生蛋白BMP-6和BMP-7有反应的细胞并在体外促进成骨分化(Porcine sinus mucosa holds cells that respond to bone morphogenicprotein BMP-6and BMP-7with increased osteogenic differentiation in vitro)(2004)Clin Oral Implants Res 15(5)575-580)。
本发明包括在包含作为所述骨形态发生蛋白之一的骨形态发生蛋白4的培养基中进行培养以将未分化的状态培养的多能干细胞或逆分化干细胞迅速分化为中胚层细胞的步骤。
所述骨形态发生蛋白4是参与将多能干细胞诱导至中胚层的信号传递途径的蛋白质，在本发明中，包括通过转移到包含骨形态发生蛋白4的诱导分化培养基来进行培养以将在基本培养基中培养的多能干细胞诱导分化为作为中胚层细胞的造血干细胞的步骤。
与用已知方法中的包含激活素A(Activin A)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或转化生长因子b的培养经进行分化的方法相比，用仅包含骨形态发生蛋白4的诱导培养基进行分化具有更好的效率。预计这是因为碱性成纤维细胞生长因子等的细胞因子还用作未分化保持因子。
能够以20～100ng/ml的浓度处理所述骨形态发生蛋白4，但不限于此。当以20ng/ml以下的浓度处理时，不能很好的诱导分化为中胚层，当以100ng/ml以上的浓度长时间处理时，存在经济效率低下的问题。
并且，本发明可以包括通过第一次以100ng/ml的浓度处理所述骨形态发生蛋白4(BMP4)后，培养2天，以20ng/ml的浓度再处理2天来进行培养的方法。在本发明中，优选地，将骨形态发生蛋白4处理4天并进行培养。
本发明可以包括在骨形态发生蛋白4处理步骤中进一步处理CDDO甲酯化合物并进行培养的方法。在进一步处理CDDO甲酯化合物的情况下，可以将造血干细胞的生产率提高3倍以上。
本发明把包括处理各种另外的信号物质以将在分化诱导培养基上诱导为中胚层的多能干细胞分化为骨髓类造血干细胞的步骤。
可用于本发明的信号物质可包含血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-3(interleukin-3，IL-3)、以及FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3，Flt3)。
本发明的所述信号物质可以依次包含在诱导培养基中。
当同时处理用于诱导分化的信号物质时，不能实现充分的分化，当先处理骨形态发生蛋白4后依次处理其他信号物质时，可以更有效地诱导分化。这是因为多能干细胞通过骨形态发生蛋白4(BMP4)诱导为中胚层的过程对整个分化诱导过程具有重要影响。
在本发明的一实施例中，包括在将血管内皮生长因子及干细胞因子处理并进行培养2天后，进一步处理血小板生成素、IL6、IL3及FMS样酪氨酸激酶3(Flt3)并培养10天以上，并分化为骨髓类造血干细胞的方法。所述步骤是进一步处理造血干细胞的分化所需的信号物质的步骤，血管内皮生长因子及干细胞因子起到促进早期分化(hemangio blast)的作用，依次处理的血小板生成素、IL6、IL3及FMS样酪氨酸激酶3不仅有助于分化，还有助于进行造血干细胞的自体增殖所需的作用。
与同时处理血管内皮生长因子、干细胞因子、血小板生成素、IL3、IL6及FMS样酪氨酸激酶3的方法相比，先处理血管内皮生长因子及干细胞因子2天后，后处理血小板生成素、IL6、IL3及FMS样酪氨酸激酶3的方法对造血干细胞的分化更有效。
所述信号物质是在造血干细胞的分化中必需物质，优选地，依次处理以经过分化为中胚层细胞后分化为造血干细胞的过程。
本发明的造血干细胞具有作为粒细胞-巨噬细胞祖细胞(Granulocyte-Macrophage Progenitor，GMP)的特征，其为分化为巨噬细胞(macrophage)、巨核细胞(magakaryocyte)或中性粒细胞(neutrophil)的中间步骤。这种分化的诱导受所述信号物质的种类及处理顺序的影响。在通过所述条件诱导分化的情况下，粒细胞-巨噬细胞祖细胞的生成最多。
用于本发明的基本培养基可以是白蛋白聚乙烯醇必需脂质，白蛋白聚乙烯醇必需脂质(Albumin Polyvinylalcohol Essential Lipids，APEL)不含动物血清(serum)，其为不包含动物来源成分的培养基，是由Andrew G.Elefanty为了从胚胎干细胞中形成拟胚体而首次开发的培养基(Nature protocol 3，768-776，2018)。所述白蛋白聚乙烯醇必需脂质包含下表1的组成。
白蛋白聚乙烯醇必需脂质介质(APEL media)组成
Figure BDA0002324497590000091
并且，本发明包括从分化的所述造血干细胞分化巨噬细胞的步骤。在本发明中，可通过在所述过程中处理巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage Colony-StimulatingFactor，M-CSF)来从造血干细胞分化巨噬细胞。在所述步骤中，在最大程度地维持及培养诱导分化为造血干细胞的细胞后，处理巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)分化为巨噬细胞。在所述步骤中，对造血干细胞中的粒细胞-巨噬细胞祖细胞分化的细胞也处理巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。
本发明的一实施例包括同时或依次处理巨噬细胞集落刺激因子及白细胞介素-3的步骤。在首先处理白细胞介素-3的情况下，可以提高骨髓类造血干细胞的分化率，当之后处理巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)时，由于骨髓类造血干细胞大多分化为巨噬细胞，因此能够以高纯度生产巨噬细胞，与已知分化方法相比，具有更高的收率。
并且，与同时处理巨噬细胞集落刺激因子及白细胞介素-3的方法相比，依次处理的方法具有更高的收率。
在所述步骤中，能够以100ng/ml的初始浓度处理巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，一段时间后，可以将其浓度降低至20ng/ml。
在根据所述本发明的诱导分化的方法从多能干细胞分化巨噬细胞的情况下，诱导造血干细胞具有作为粒细胞-巨噬细胞祖细胞的特性，在用巨噬细胞集落刺激因子处理之前获取最大限度的粒细胞-巨噬细胞祖细胞后，将其一次性分化为巨噬细胞，因此可以提高巨噬细胞的收率。
本发明涉及诱导造血干细胞分化的方法，包括：步骤1)，在包含骨形态发生蛋白4的诱导造血干细胞分化的培养基中培养多能干细胞；步骤2)，通过对所述多能干细胞处理血管内皮生长因子及干细胞因子来进行培养；以及步骤3)，对所述多能干细胞处理血小板生成素、白细胞介素-6、白细胞介素-3及FMS样酪氨酸激酶3。
在所述本发明的诱导分化的方法的步骤1)中，由于不额外包含激活素A、碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子b中的一种以上，因此可以减少所使用的细胞因子的数量。
并且，在所述步骤1)中，优选地，以20～100ng/ml的浓度包含骨形态发生蛋白4，在初期以低浓度处理骨形态发生蛋白4后，优选以高浓度再处理一次。
并且，所述诱导造血干细胞分化的培养基优选为白蛋白聚乙烯醇必需脂质。
本发明涉及诱导巨噬细胞分化的方法，所述诱导巨噬细胞分化的方法包括：步骤1)，在包含骨形态发生蛋白4的诱导造血干细胞分化的培养基中培养多能干细胞；步骤2)，通过对所述多能干细胞处理血管内皮生长因子及干细胞因子来进行培养；步骤3)，通过对所述多能干细胞处理血小板生成素、白细胞介素-6、白细胞介素-3及FMS样酪氨酸激酶3来诱导造血干细胞分化；以及步骤4)将分化的所述造血干细胞添加到包含巨噬细胞集落刺激因子的诱导巨噬细胞分化的培养基中进行培养。
在所述4)中，优选地，当培养巨噬细胞时，将细胞密度维持在1×105细胞/cm2以上。
本发明涉及通过所述诱导造血干细胞分化的方法从多能干细胞诱导分化的造血干细胞。
本发明涉及通过所述诱导造血干细胞分化的方法从多能干细胞诱导分化的巨噬细胞。
本发明涉及用于诱导分化来源于多能干细胞的造血干细胞的组合物，所述用于诱导分化来源于多能干细胞的造血干细胞的组合物包含由骨形态发生蛋白4、血管内皮生长因子、干细胞因子、血小板生成素、白细胞介素-6、白细胞介素-3、CDDO甲酯及FMS样酪氨酸激酶3组成的组中的一种以上。
并且，本发明涉及用于诱导分化来源于多能干细胞的巨噬细胞的组合物，所述用于诱导分化来源于多能干细胞的巨噬细胞的组合物包含由骨形态发生蛋白4、血管内皮生长因子、干细胞因子、血小板生成素、白细胞介素-6、白细胞介素-3、FMS样酪氨酸激酶3及巨噬细胞集落刺激因子组成的组中的一种以上。
在本发明中，术语“多能干细胞”作为具有分化多能性的干细胞，是可以分化为内胚层、中胚层、外胚层细胞或组织的干细胞。虽然对细胞的来源没有特别限制，但包含人类胚胎干细胞、逆分化干细胞。
在本发明中，术语“中胚层细胞”是指可通过用于调节干细胞的分化的信号分子要素诱导，尤其通过骨形态发生蛋白4信号传递途径分化的细胞。本发明的中胚层细胞可包含通过骨形态发生蛋白4调节了分化的中胚层细胞，可包含经中胚层细胞分化为造血中胚层的所有细胞。
在本发明中，术语“造血干细胞”作为可以潜在地分化成血液的主要成分的造血细胞，也被称为“造血母细胞”。造血细胞可以区分为在发育步骤中从胎儿肝(fetal liver)生成的细胞、从卵黄囊(yolk sac)生成的细胞、以及出生后从骨髓生成的细胞，并分化为淋巴(lymphoid)类细胞和骨髓(myeloid)类细胞。本发明的造血干细胞可分化为巨噬细胞。
在本发明中，术语“巨噬细胞”负责先天性免疫，能够以单核细胞形式存在于血液内并且可以分化为树突状细胞或巨噬细胞。巨噬细胞进行去除细菌或病毒的作用，这表示为吞噬作用(phagocytosis)。通过本发明的诱导分化过程分化的巨噬细胞可用于病毒或细菌的感染研究模型。
在本发明中，术语“分化”是指未专业化的细胞发育成特定细胞的过程，尤其包括从干细胞发育成特定细胞的过程。在本发明中，作为具有分化能力的细胞使用胚胎干细胞及逆分化干细胞，所述胚胎干细胞和逆分化干细胞可经中胚层细胞、造血干细胞最终分化为巨噬细胞。
在本发明中，术语“信号物质”是包含参与多能干细胞的分化的信号蛋白、细胞因子、催化剂等的概念。尤其，本发明包含骨形态发生蛋白、巨噬细胞集落刺激因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、血小板生成素、白细胞介素-6、白细胞介素-3及FMS样酪氨酸激酶3。
在本发明中，CDDO甲酯作为Nrf2活化材料，指“2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9(11)-二烯-28-油酸甲酯(2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-diene-28-oic acidmethyl ester)”化合物。
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，本发明的范围不限于这些实施例。
实施例
实施例1
造血干细胞分化方案
1)使多能干细胞适应涂敷有基质胶(matrigel)的皿和mTeSR1培养基3周后，用移液管去除了除35饼状皿中5个菌落之外的其他菌落。这是为了给将来分化的细胞提供可增殖的空间的过程。此时，在作为涂敷材料使用玻连蛋白(vitronectin)或作为介质使用mTeSR8的情况下，也可以诱导造血干细胞或巨噬细胞的分化。
2)将在所述1)中培养的干细胞替换为白蛋白聚乙烯醇必需脂质培养基。如图2及图3所示，这是因为白蛋白聚乙烯醇必需脂质培养基的造血干细胞的分化效率远高于其他基本培养基。对此以高浓度(100ng/ml)处理骨形态发生蛋白4(BMP4)2天后，依次以低浓度(20ng/ml)处理2天，来迅速诱导分化为中胚层。
并且，可将CDDO甲酯化合物与骨形态发生蛋白4一同处理4天来增加造血干细胞的分化效率。
之后，用血管内皮生长因子及干细胞因子处理中胚层细胞以分化为初期造血干细胞(hemangioblast)，接下来处理白细胞介素-3、白细胞介素-6、血小板生成素及FMS样酪氨酸激酶3来诱导分化为造血干细胞。为了提高分化效率及纯度而不同时处理所述信号物质。
图1详细示出所述分化方案。
实施例2
确认造血干细胞标记的表达
CD34+CD45+是对造血干细胞特异性表达的标记。将从多能干细胞分化的中胚层细胞再次诱导分化为造血干细胞，为了证实这一点，测量仅对造血干细胞特异性表达的所述标记的表达量。
将分化的细胞单细胞化，并与荧光标记的抗体CD34及CD45反应后，使用流式细胞分析仪(Flow cytomery，FACs)确认各个呈递表面抗原的细胞，并将其结果示于图2及图3。
如图2及图3所示，确认了CD34+CD45+分别为阳性，这表明已经进行到造血干细胞的分化。
并且，如图4所示，可知在将50nM的CDDO甲酯化合物与骨形态发生蛋白4一同添加4天并诱导分化的情况下，造血干细胞的分化效率约增加了3倍。
实施例3
确认骨髓类造血干细胞活性
图5示出为确认分化的造血干细胞的血液细胞形成能力进行集落形成测定(Colony Forming Assay)的结果，确认生成了大部分粒细胞-巨噬细胞(granulocyte-macrophage，GM)菌落。如图5所示，可知在实施例1中生成的造血干细胞为骨髓类造血干细胞。
实施例4
巨噬细胞分化方案
1)收集所述造血干细胞(Floating cell)并转移至新60饼状皿(涂层正常细胞培养皿)，分别用100ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子单独处理以诱导分化为巨噬细胞。基本培养基使用RPMI1640，添加10％的胎牛血清(FBS)。培养10天后，以1：2的比率继代培养(sub-culture)。此时，细胞的密度非常重要，要在平板上保持105细胞/cm2以上的细胞才能提高巨噬细胞的收率。此时，巨噬细胞集落刺激因子的浓度可以被处理至20～100ng/ml的浓度。图6详细示出所述分化方案。
如图8至图9所示，确认了巨噬细胞在继代培养时持续生成60天以上，且确认了所生成的巨噬细胞的98％作为CD14+、CD11b+、CD45+、CD86+细胞，具有巨噬细胞特性。
分化的巨噬细胞用RPMI1640培养基及包含10％的胎牛血清的培养基培养，观察到当培养时回转式振荡(orbital shaking)期间产量增加。
实施例5
确认巨噬细胞标记的表达
CD14、CD11b、CD86是对巨噬细胞特异性表达的标记。将分化的造血干细胞诱导分化为巨噬细胞，为了证实这一点，测量所述标记的表达量，并将其结果示于图8。如图8所示，确认了CD14、CD11b、CD86及作为血液内标记的CD45所一同表达的巨噬细胞为98％以上。
可知从所述实施例4中生成的多能干细胞分化的巨噬细胞的纯度为98％以上。
通过本发明的分化方法及诱导分化组合物生成的巨噬细胞共计5×108个以上，这是由20个多能干细胞菌落生成的。
实施例6
对巨噬细胞分化收率进行比较
对现有多能干细胞来源巨噬细胞分化方案(eguma K.Saito et al.，Plos One，Published:April 3，2013)与所述分化方案进行比较，并将其结果示于图7。即，与所述现有分化方案相比，本发明的分化方案在步骤2中排除了碱性成纤维细胞生长因子，在步骤3中排除了干细胞因子及巨噬细胞集落刺激因子，添加了白细胞介素-6，并在步骤4中排除了FL3及粒细胞巨噬细胞刺激因子。示出通过本发明的分化方案获取的巨噬细胞的总收率比现有分化方案的收率相比高100倍。
实施例7
分化的巨噬细胞的巨噬作用
为了确认通过本发明的方案分化的巨噬细胞的巨噬作用(phagocyto sis)，以如下方法进行实验。
以人血清为样品，将分化的巨噬细胞放入调理(Opsonization)的微珠来确认了巨噬作用。其结果确认了巨噬作用活跃地进行，如图11所示，在CD11b及CD14阳性巨噬细胞中，95％以上参与巨噬作用。可知分化的巨噬细胞执行正常功能。
实施例8
确认本发明的巨噬细胞与人来源巨噬细胞的相似性
为了比较及确认在实施例4中生成的巨噬细胞与人来源巨噬细胞的相似性，以如下方法进行实验。
抽分化的巨噬细胞(分化20天后、分化40天后)，人巨噬细胞株Th p1细胞系(cellline)、人血液纯化外周血单核细(periperal blood m onocyte cell，PBMC)后，通过转录组测序(RNAseq)分析法确认了使用CD14+分离试剂盒从CD14+巨噬细胞仅分离人血液细胞来源巨噬细胞、多能干细胞株的基因组表达的相似性，并将其结果示于图12。如图12所示，可知分化的巨噬细胞的基因组表达程度与人血液细胞来源巨噬细胞非常相似。
实施例9
确认巨噬细胞的感染功能及利用传染病研究
为了确认在实施例4中生成的巨噬细胞对病毒或细菌的感染可能性，通过使用实际流感病毒或无形体细菌感染模型按照以下方法进行鉴定试验。即，将流感病毒H3N2(1MOU)感染到经分化的巨噬细胞106后，在37℃的温度下，培养1～7天，并将其结果示于图13。
目视确认用离心涂片(Cytospin)染色的细胞内感染了H3N2病毒。并且，在分化的巨噬细胞中也确认了无形体的桑椹胚(morula)。图14示出通过透射电子显微镜法(Transmission electron microscopy)更清楚地确认的结果。
并且，如图15及图16所示，确认在感染病毒或细菌之后巨噬细胞的活性氧(ROS)增加，并且确认了作为炎性细胞因子的白细胞介素-6的分泌量增加。
实施例10
使用巨噬细胞的结核菌感染研究
为了确认在所述实施例4中生成的巨噬细胞是否可以用作细菌感染研究模型，进行了以下实验。具体地，感染结核菌(Mycoplasma tuberc ulosis)后，在37℃的温度下，在5％的CO2培养箱中进行培养。
将结核菌以感染复数(MOI)1-20的浓度感染到20000个巨噬细胞后，将其结果示于图17。如图17所示，确认了感染了结核菌的巨噬细胞增加。
此时，所使用的结核菌为***了绿色荧光蛋白载体(GFP vector)的结核菌，呈荧光，为了确认巨噬细胞的感染率，用蓝色荧光(DAPI)染色巨噬细胞。通过用共聚焦显微镜拍摄呈绿色荧光蛋白(GFP)的结核菌和呈蓝色荧光(DAPI)的巨噬细胞来定量巨噬细胞内结核菌的感染程度。
实施例11
确认感染期间分化的巨噬细胞与人巨噬细胞的相似性
为了确认分化的巨噬细胞感染时是否与人巨噬细胞反应相似，向分化的巨噬细胞(iMAC)及人血液来源巨噬细胞(hMDM)感染结核菌MOI5，5天后通过转录组测序(RNAseq)确认了基因表达变化模式。其结果，确认了对结核菌两个细胞的基因表达变化相似。

Claims (12)

1.一种诱导造血干细胞分化的方法，其特征在于，包括：
步骤1)，在包含骨形态发生蛋白4的诱导造血干细胞分化的培养基中培养多能干细胞；
步骤2)，通过对所述多能干细胞处理血管内皮生长因子及干细胞因子来进行培养；以及
步骤3)，对所述多能干细胞处理血小板生成素、白细胞介素-6、白细胞介素-3及FMS样酪氨酸激酶3。
2.根据权利要求1所述的诱导造血干细胞分化的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，还处理CDDO甲酯。
3.根据权利要求1所述的诱导造血干细胞分化的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，不额外包含激活素A、碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子b中的一种以上。
4.根据权利要求1所述的诱导造血干细胞分化的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，以20～100ng/ml的浓度包含骨形态发生蛋白4。
5.根据权利要求1所述的诱导造血干细胞分化的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，以低浓度处理骨形态发生蛋白4后，再以高浓度处理。
6.根据权利要求1所述的诱导造血干细胞分化的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，所述诱导造血干细胞分化的培养基为白蛋白聚乙烯醇必需脂质。
7.一种诱导巨噬细胞分化的方法，其特征在于，包括：
步骤1)，在包含骨形态发生蛋白4的诱导造血干细胞分化的培养基中培养多能干细胞；
步骤2)，通过对所述多能干细胞处理血管内皮生长因子及干细胞因子来进行培养；
步骤3)，通过对所述多能干细胞处理血小板生成素、白细胞介素-6、白细胞介素-3及FMS样酪氨酸激酶3来诱导造血干细胞分化；以及
步骤4)将分化的所述造血干细胞添加到包含巨噬细胞集落刺激因子的诱导巨噬细胞分化的培养基中进行培养。
8.根据权利要求7所述的诱导巨噬细胞分化的方法，其特征在于，在所述步骤4)中，当培养巨噬细胞时，将细胞密度维持在1×105细胞/cm2以上。
9.一种造血干细胞，其特征在于，根据权利要求1的诱导造血干细胞分化的方法，从多能干细胞诱导分化。
10.一种巨噬细胞，其特征在于，根据权利要求7的诱导巨噬细胞分化的方法，从多能干细胞诱导分化。
11.一种用于诱导分化来源于多能干细胞的造血干细胞的组合物，其特征在于，包含由骨形态发生蛋白4、血管内皮生长因子、干细胞因子、血小板生成素、白细胞介素-6、白细胞介素-3、CDDO甲酯及FMS样酪氨酸激酶3组成的组中的一种以上。
12.一种用于诱导分化来源于多能干细胞的巨噬细胞的组合物，其特征在于，包含由骨形态发生蛋白4、血管内皮生长因子、干细胞因子、血小板生成素、白细胞介素-6、白细胞介素-3、FMS样酪氨酸激酶3及巨噬细胞集落刺激因子组成的组中的一种以上。
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