CN114209814A - Tnfsf15蛋白在促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增中的用途 - Google Patents
Tnfsf15蛋白在促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种TNFSF15蛋白在促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增中的用途，使用TNFSF15蛋白获取巨噬细胞后，再过继治疗相关疾病，为日后临床巨噬细胞相关疾病治疗提供新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种TNFSF15蛋白在促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增中的用途。
技术背景
巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞，具有高度可塑性，它被发现在各种组织中，例如破骨细胞(骨)，肺泡巨噬细胞(肺)，小胶质细胞(脑)，组织细胞(***)，枯否细胞(肝脏)和朗格汉斯细胞(皮肤)等，且表现出功能的多样性。他们在生长发育、维持代谢平衡、组织修复和免疫反应中均有着重要的作用。研究发现注射巨噬细胞对急性心肌梗死后的心脏重构具有促进作用；向脑内移植一种能吞噬无用物质或有害蛋白质的小胶质细胞(巨噬细胞)，可减少导致阿尔兹海默症的β淀粉样蛋白等。因此，可通过移植巨噬细胞的方式治疗多种疾病。但由于机体本身的免疫功能，对外来物种的排斥反应，注入的巨噬细胞最好来自个体本身。因此如何在尽可能不影响机体健康，又可大量获得机体自身的巨噬细胞是一个重要的研究方向。骨髓干细胞是巨噬细胞的一个重要来源，利用骨髓干细胞的增殖特性，和现有可分离骨髓细胞的技术，可将骨髓细胞取出体外诱导骨髓干细胞向巨噬细胞分化从而获得大量巨噬细胞。目前诱导骨髓干细胞向巨噬细胞分化的细胞因子主要有M-CSF和IL34，由于它们促进分化的巨噬细胞具有特定表型，应用于多种疾病模型中具有局限性，因此寻找新的促进骨髓干细胞向巨噬细胞分化的蛋白是十分重要的课题。
肿瘤坏死因子超家族成员15(Tumor necrosis factor superfamily-15，TNFSF15，又称TL1A)，是一种主要由成熟血管内皮细胞分泌的血管生长抑制因子。研究发现它不仅是一种血管负调控因子，能够抑制肿瘤内血管新生和肿瘤生长；还可作为一种免疫激活剂，促进T细胞活化和树突状细胞成熟。目前，尚未有关于TNFSF15蛋白在骨髓干细胞向巨噬细胞分化中作用的报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种TNFSF15蛋白促进骨髓干细胞在体外分化为巨噬细胞并增殖中的用途，以解决上述现有技术存在的不足，该蛋白能促进骨髓干细胞向巨噬细胞分化，增加巨噬细胞数量，为巨噬细胞相关疾病提供治疗方案。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种TNFSF15蛋白在制备用于促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增的药物或制剂中的用途。
优选的，在该用途中，所述药物或制剂通过促进骨髓干细胞向巨噬细胞分化，增加巨噬细胞的比例。
优选的，在该用途中，所述药物或制剂通过促进骨髓干细胞/骨髓源巨噬细胞增殖，增加巨噬细胞的数量。
在该用途中，TNFSF15蛋白能够独立或在其他相关巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF/GM-CSF)存在时促进骨髓干细胞向巨噬细胞的分化。
本发明的第二方面，提供一种应用TNFSF15蛋白在体外诱导骨髓干细胞向巨噬细胞分化并扩增的方法，所述方法中使用的扩增培养基中添加有浓度不高于10μg/mL的TNFSF15蛋白。
优选的，所述方法包括如下步骤：
从小鼠骨髓中取出骨髓细胞，用含有RPMI 1640、15％FBS和TNFSF15蛋白培养基重悬，调整细胞浓度为2×106mL,加入孔板(六孔板)中，每孔2mL，于孵箱中培养3-7d，培养条件为37℃，5％CO2。
优选的，所述方法中的扩增培养基的组成为RPMI 1640、15％FBS和3μg/mLTNFSF15蛋白。
在体外培养过程中检测到TNFSF15蛋白在骨髓干细胞分化过程中，提升巨噬细胞的比例，且呈现时间和浓度依赖性。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
(1)本发明TNFSF15蛋白促进骨髓干细胞向巨噬细胞的分化和扩增，可以体外获取巨噬细胞后，再过继治疗相关疾病。
(2)TNFSF15蛋白单独使用和与其他巨噬细胞集落刺激因子联合使用均能发挥促进骨髓干细胞向巨噬细胞分化的作用，作用稳定，不易受其他因素影响，可考虑在体内使用。
(3)本发明TNFSF15纯化方法简单大量，经济成本较低廉，可与其他治疗方式联合治疗，具有很广的应用前景。
附图说明
图1是：TNFSF15蛋白对体外骨髓干细胞向巨噬细胞分化的影响，其中，A为不同浓度TNFSF15蛋白处理骨髓干细胞7d后，巨噬细胞比例的变化；B为TNFSF15蛋白处理骨髓干细胞不同天数后，巨噬细胞比例的变化。
图2是：TNFSF15蛋白在巨噬细胞集落刺激因子M-CSF和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF存在时对巨噬细胞分化比例的影响。
图3是：TNFSF15蛋白对骨髓干细胞/骨髓源巨噬细胞增殖和数量的影响，其中，A为骨髓细胞在TNFSF15蛋白处理后，骨髓干细胞/骨髓源巨噬细胞增殖的变化；B为骨髓细胞在TNFSF15蛋白处理7d后，细胞数量的变化。。
图4是：TNFSF15蛋白对荷瘤小鼠骨髓中巨噬细胞祖细胞、前体细胞和肿瘤中巨噬细胞的影响。
图5是：TNFSF15蛋白对肿瘤中骨髓干细胞分化的巨噬细胞数量的影响。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1TNFSF15蛋白单独使用时对骨髓干细胞在体外向巨噬细胞分化的影响
1)骨髓细胞的获得
(1)、准备：将洁净的手术器械(至少两把小剪刀、小镊子)、纱布(8层，共需20块左右)，尼龙膜(70μm孔径，10小块)，置于饭盒中，高压灭菌，120℃，20min；
(2)、取出骨髓细胞：处死5周雄鼠，取出后腿骨，一只腿可以取出三截相连的骨头，用纱布剔除干净周围的组织，剪掉骨头两端的关节，用1mL注射器吸取PBS冲出骨髓细胞。冲出的骨髓细胞聚集在一起，呈现红色片状，用1mL注射器和移液枪吹打，使之分散为单细胞悬液；
(3)、将收集的骨髓细胞用70μm尼龙网过滤，400g，4℃离心5min，弃上清；
(4)、裂解红细胞：加2mL红细胞裂解液，重悬，置于冰上，3min后加入10mL含有2％FBS的PBS溶液，混匀；
(5)、400g，4℃离心5min，弃上清，加10mL 2％FBS的PBS溶液，混匀；
(6)、计数：吸取10μL上述细胞悬液，稀释一定倍数，用细胞计数板在显微镜下计数。10mL细胞总数＝四大格细胞总数/4×104×倍数×10mL；
2)TNFSF15蛋白对骨髓干细胞向巨噬细胞分化的影响
(1)、将细胞悬液离心，4℃，400g离心5min，弃上清。
(2)、细胞沉淀用(RPMI 1640+15％FBS)培养基重悬，调整细胞浓度为2×106/mL，每孔2mL，加入孔板(如6孔板)中；
(3)、a，实验设置对照组和实验组，实验组在上述培养基中加入0.3μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、5μg/mL的TNFSF15蛋白，对照组在上述培养基中加入相应剂量的buffer。轻轻震荡混匀，放入37℃孵箱中培养。在培养3d，5d用对应培养基进行半量换液，待到7d收取细胞，标记F4/80-PE-Cy7抗体；b，对照组和3μg/mL的实验组，分别于3d、5d、7d收取细胞，标记F4/80-PE-Cy7抗体、CD11b-FITC抗体。每种抗体均4℃孵育30min，避光，离心，弃去未结合的抗体。并用200μL细胞固定液重悬，进行流式检测。
3)TNFSF15蛋白诱导分化的骨髓源巨噬细胞的表型分析
(1)、将细胞悬液离心，4℃，400g离心5min，弃上清。
(2)、细胞沉淀用(RPMI 1640+15％FBS)培养基重悬，调整细胞浓度为2×106/mL，每孔2mL，加入孔板(如6孔板)中；
(3)、实验设置对照组和的实验组，实验组在上述培养基中加入3μg/mL的TNFSF15蛋白，对照组在上述培养基中加入相应剂量的buffer。轻轻震荡混匀，放入37℃孵箱中培养。在培养3d，5d用对应培养基进行半量换液，并于3d、5d、7d收取细胞，标记F4/80-PE-Cy7抗体、MHC2-FITC、CD206-APC抗体。室温孵育30min，避光，离心，弃去未结合的抗体。并用200μL细胞固定液重悬，进行流式检测。
3)结果分析：
由图1可知，与相应的buffer组相比，TNFSF15蛋白能提高骨髓干细胞体外分化过程中巨噬细胞的比例，并且呈现出浓度(图1A)和时间(图1B)的依赖性。
实施例2TNFSF15蛋白在巨噬细胞相关集落刺激因子存在时，对骨髓源巨噬细胞分化的影响
1)骨髓干细胞的获得
与实施例1相同
2)TNFSF15蛋白在M-CSF/GM-CSF存在时对骨髓干细胞向巨噬细胞分化能力的影响
(1)、4℃，400g离心5min，弃上清，用(RPMI 1640+15％FBS+50ng/mL M-CSF或GM-CSF因子)培养基重悬，调整细胞浓度为2×106/mL，每孔2mL，加入孔板(如6孔板)中；
(2)、实验设置对照组和实验组，实验组在上述培养基中分别加入3μg/mL的TNFSF15蛋白，对照组在上述培养基中加入相应剂量的buffer。轻轻震荡混匀，放入37℃孵箱中培养。在培养3d用对应培养基进行半量换液，待到5d收取细胞，标记F4/80-PE-Cy7抗体。室温孵育30min，避光。离心，弃去未结合的抗体。并用200μL细胞固定液重悬，进行流式检测。
由图2可知，与相应的buffer组相比，TNFSF15蛋白均能在M-CSF(图3A)或GM-CSF(图2B)存在时提高骨髓干细胞体外分化过程中F4/80+巨噬细胞的比例。由此可知，TNFSF15蛋白在M-CSF和GM-CSF存在时依然发挥促进骨髓干细胞向巨噬细胞分化的作用。
实施例3TNFSF15蛋白对巨噬细胞祖细胞/骨髓源巨噬细胞增殖和数量的影响
1)骨髓来源巨噬细胞的获得
与实施例1相同。
2)TNFSF15蛋白对巨噬细胞祖细胞/骨髓源巨噬细胞增殖和数量的影响
(1)、4℃，400g离心5min，弃上清，用(RPMI 1640+10％FBS+3μg/mL TNFSF15蛋白/对应buffer)培养基重悬，调整细胞浓度为2×106/mL，每孔2mL，加入孔板(如6孔板)中，于孵箱中(37℃，5％CO2)培养3d、5d、7d；
(2)、在培养3d、5d用相应培养基进行半量换液，待到3d，5d，7d收取细胞，标记CD11b-APC，F4/80-PE-Cy7抗体。室温孵育30min，避光。流式分析CD11b+F4/80+巨噬细胞CFSE的荧光强度；并在7d时显微镜下观察并记录实验组和对照组细胞数量。
3)结果分析：
由图3A可知，与对照组相比，TNFSF15蛋白促进骨髓中巨噬细胞祖细胞或已分化的巨噬细胞增殖；由图3B可知TNFSF15蛋白组骨髓细胞数量显著高于对照组。由此可知，TNFSF15蛋白能够促进骨髓干细胞/骨髓源巨噬细胞增殖，提升其数量；结合图1中TNFSF15蛋白显著提升分化过程中巨噬细胞比例，表明TNFSF15显著增加巨噬细胞数量。
实施例4：TNFSF15蛋白对荷瘤小鼠骨髓中巨噬细胞祖细胞、前体细胞和肿瘤中巨噬细胞的影响
1)获得高表达TNFSF15细胞系
(1)、构建plvx-puro-TNFSF15质粒。
(2)、将plvx-puro-TNFSF15、pspAX2和pMD.2G转染进293T细胞后，收集上清病毒液，转染LLC细胞。并通过有限稀释法进一步筛选过表达TNFSF15细胞株；
2)TNFSF15过表达肿瘤模型的建立
(1)、将上述构建的过表达hTNFSF15的LLC与对照LLC细胞系复苏培养，长至一定数量，消化下来，用PBS清洗两次，再以5×105/mL的密度重悬于无血清培养基中。
(2)、按照每只小鼠5×105/100μL的量，将细胞种植到C57BL/6J鼠皮下。每隔两天测量瘤子大小，记录老鼠体重，直至收取肿瘤。瘤子体积(mm3)＝长×宽×宽/2。
3)分析骨髓中巨噬细胞祖细胞和前体细胞比例
(1)、获取骨髓细胞的方法同实施例1；
(2)、按照抗体说明，以1:100的比例将CD45、F4/80、CD11b、CD86、CD115、CD117(ckit)抗体稀释在PBS中；另一组以1:50的比例将Lin(CD5,CD11b,CD19,CD45R/B220,Ly6G/C(Gr-1),TER119,7-4)、Sca1、cKit、CD16/32、CD34抗体稀释在PBS中，每管样品中加入100μL抗体稀释液，用移液枪轻柔吹打混匀，4℃避光孵育30min；
(3)、400g离心，5min，弃上清，加入1mL PBS洗涤；
(4)、400g离心，5min，弃上清，荧光直标的样品组加入200μL细胞固定液重悬，过70μm筛网后，转移到流式管中，即可上机检测分析。
(5)、APC-CY7-Streptavidin按照以1:100稀释在PBS中，每管荧光间标样品加100μL抗体稀释液，室温孵育20min；
(6)、400g离心，5min，弃上清，加入1mL PBS洗涤；
(7)、400g离心，5min，弃上清，加入200uL细胞固定液重悬，过70μm筛网后，转移到流式管中，即可上机检测。
4)分析肿瘤中巨噬细胞比例
(1)、从小鼠身上取下肿瘤组织，并用小剪刀剪碎，加入胰酶，在37℃水浴中消化30min，每隔10min摇晃一次。
(2)、消化完成用，用含有10％血清的培养基中和，离心；
(3)、用PBS清洗一次，接着在不锈钢70μm细胞筛网上用EP管盖轻轻研磨，可加PBS冲洗，使之分散为单个细胞。
(4)、离心，用PBS清洗一次，加入红细胞裂解液，冰上裂解5min，因为红细胞裂解液无色，此时溶液颜色的深浅可体现红细胞数量的多少；
(5)、用含有2％血清的PBS中和，用PBS清洗一次，过70μm尼龙膜，获得肿瘤单细胞悬液；
(6)、接下来将细胞转移到1.5mL EP管中，400g离心，5min，弃上清；
(7)、按照抗体说明，以1:100的比例将CD45、F4/80、CD11b抗体稀释在PBS中，离心后的细胞，加入100μL抗体稀释液，用移液枪轻柔吹打混匀，4℃避光孵育30min；
(8)、400g离心，5min，弃上清，加入1mL PBS洗涤；
(9)、400g离心，5min，弃上清，加入200μL PBS重悬，过70μm筛网后，转移到流式管中，即可上机检测分析。
5)构建红色骨髓移植模型小鼠
(1)、选择8～10周(体重为20～22g)的C57BL/6雌鼠作为骨髓移植模型受体小鼠。9.0Gy Cs137放射(时间约10min)。
(2)、放射六小时后，尾静脉注射6～8周tdTomato荧光C57BL6雄鼠的红色荧光(td-Tomato+)骨髓细胞。受体小鼠需tdTomato+骨髓细胞约5×106个细胞。
(3)、随后观察两周，如果小鼠体重都在18g以上且状态良好，即骨髓移植模型构建成功。
6)骨髓移植荷瘤小鼠模型构建及给药
(1)、将消化成单悬细胞的肿瘤细胞在10倍体积PBS中洗三次，200g，5min，弃上清，加入无血清无双抗的培养基重悬细胞至5×106mL-1。每只小鼠(接受骨髓细胞移植两周后)皮下接种100μL上述重悬的细胞。
(2)、肿瘤接种时间第四天，肿瘤能够被肉眼观察到时，将小鼠随机分配成两组，进行瘤旁给药。每隔两天给一次药并监测小鼠体重和肿瘤体积(游标卡尺测量最长和最短直径)。分别于肿瘤接种后的第19天收取肿瘤组织。
(3)、实验组：每只鼠瘤旁注射5mg/kg TNFSF15；对照组：每只鼠瘤旁注射等体积的缓冲液。
(4)、肿瘤体积(mm3)＝L×W×W/2；其中，L代表肿瘤最长的直径，W代表肿瘤最短的直径。
7)免疫荧光分析肿瘤组织
(1)、切片恢复至室温。-20℃下，冰甲醇(-20℃预冷)固定切片组织20min。自来水缓慢水流冲洗5min，注意避免破坏组织切片。
(2)、PAP笔画防水圈，为后续孵育抗体做准备。注意防水圈不能太小，以免抗体挥发。每个防水圈内的组织内需要大约30-50μL液体。
(3)、PBST稀释Triton-X100(0.25％)，室温，30min。PBST洗3次，每次5min。轻甩片子，滤纸吸走多余液体。防水圈明显成闭合的包围组织时，向防水圈内滴加5％BSA(PBST稀释)封闭非特异性抗原，置于湿盒内，室温，1h。
(4)、甩干，勿洗。向防水圈内滴加稀释好的F4/80抗体(1:100稀释)，使组织被完全覆盖。置于湿盒内，37℃，1h。
(5)、PBST洗三次，每次5min。向防水圈内滴加稀释好的FITC荧光二抗，室温孵育，1h。PBST洗三次，每次5min。
(6)、封片：滤纸吸走多余液体，滴加抗荧光淬灭封片剂(每张片子约20μL)，轻压盖玻片，注意避免气泡出现和组织完全干裂。
(7)、共聚焦显微镜镜下观察目标抗体在组织中的表达及定位。
由图4可知，TNFSF15减少小鼠骨髓中巨噬细胞祖细胞和前体细胞比例(图4A、图4B)，增加肿瘤中巨噬细胞比例(图4C)；由图5可知，TNFSF15增加肿瘤中骨髓干细胞分化的巨噬细胞数量(图5A)，由此可见TNFSF15蛋白在体内对骨髓干细胞向巨噬细胞分化依然有促进作用(图5B)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.TNFSF15蛋白在制备用于促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增的药物或制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物或制剂通过促进骨髓干细胞向巨噬细胞分化，增加巨噬细胞的比例。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物或制剂通过促进骨髓干细胞/骨髓源巨噬细胞增殖，增加巨噬细胞的数量。
4.一种应用TNFSF15蛋白体外诱导骨髓干细胞向巨噬细胞分化并扩增的方法，其特征在于：所述方法中使用的扩增培养基中添加有浓度不高于10μg/mL的TNFSF15蛋白。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
从小鼠骨髓中取出骨髓细胞，用含有RPMI 1640、15％FBS和TNFSF15蛋白的扩增培养基重悬，调整细胞浓度为2×106mL,加入孔板(六孔板)中，每孔2mL，于孵箱中培养3-7d，培养条件为37℃，5％CO2。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述扩增培养基的组成为RPMI 1640、15％FBS和3μg/mL TNFSF15蛋白。
7.TNFSF15蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物中含有TNFSF15蛋白，所述TNFSF15蛋白通过促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增，达到抗肿瘤的作用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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