CN104745529B - 瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途及其应用，包括：用于诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞的试剂盒、利用前述的试剂盒制备造血干/祖细胞的方法和制备造血干/祖细胞的***。实验发现，瘦素可以显著提高胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的效率，提高分化细胞的造血集落形成能力，诱导效果好且稳定。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途及其应用，更具体地，涉及瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途、用于诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞的试剂盒，利用试剂盒制备造血干/祖细胞的方法，以及制备造血干/祖细胞的***。
背景技术
造血干/祖细胞移植是用于治疗重症再生障碍性贫血、白血病、地中海贫血、重症免疫缺陷症等多种恶性血液及免疫***疾病最为有效的治疗方式。目前，临床上造血干/祖细胞主要来源于捐献者骨髓、动员后的外周血及脐带血。但由于目前造血干/祖细胞捐献者数量稀少且配型成功率极低，而脐带血中造血干/祖细胞的数量不足以重建成年人造血，导致大量患者无法找到合适配型的造血干/祖细胞，因此，寻找新的造血干/祖细胞来源具有非常重要的经济价值和社会意义。
以人胚胎干细胞及诱导多能干细胞为代表的多能干细胞技术的出现为生物技术和再生医学的发展带来了巨大的机遇。多能干细胞具有高度的自我更新能力和多向分化的潜能，能够在特定诱导条件下定向分化为三胚层及其衍生分化的组织细胞。多能干细胞所具有的这些独特的生物学特性不仅使其成为研究胚胎发育规律的良好模型，并且能够为临床替代或移植治疗提供源源不断的种子细胞。
目前，多能干细胞向造血干/祖细胞分化模型的建立源于人们对于造血发育的认识，通过与基质细胞共培养或添加细胞因子及小分子化合物等诱导剂模拟体内造血发育微环境，诱导多能干细胞经过中胚层祖细胞和生血内皮细胞阶段，最终分化为造血干/祖细胞和成熟血细胞。然而，由于人们对造血分化机制的认识仍存在较大局限性，多能干细胞向造血细胞的诱导分化效率低，并且诱导细胞尚不具备体内造血重建的能力。
因此，多能干细胞向造血细胞的诱导分化体系有待进一步的改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种利用瘦素提高人胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率的方法及其应用。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：瘦素(Leptin)是一种由脂肪组织分泌的激素类物质，其最主要的生理学作用是在人体内参与糖、脂肪和能量的代谢调节，加快机体新陈代谢和能量释放，抑制食欲，降低体重。发明人发现，在特定的分化阶段培养基中添加瘦素，人胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，并且显著增加造血集落形成数量，同时向成熟造血谱系细胞的分化能力也有显著提高。
由此，基于发明人的上述发现，本发明提供了用于诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞的试剂盒、装置和方法。
根据本发明的一个方面，本发明提供了瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途。
发明人惊奇的发现，瘦素可以显著提高胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的效率，提高分化细胞的造血集落形成能力，诱导效果好且稳定。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一培养基，所述第一培养基为添加了瘦素的AdvancedRPMI 1640培养基；以及第二培养基，所述第二培养基为添加了瘦素的Stempro34培养基。
发明人惊奇的发现，利用该试剂盒诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞，集落形成能力增强，并且胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的效率显著提高，诱导效果好且稳定。
从而，根据本发明的另一方面，本发明提供了一种利用前述的试剂盒制备造血干/祖细胞的方法。该方法包括：利用所述第一培养基对预处理的胚胎干细胞进行培养，以便得到生血内皮细胞；和利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞进行培养，以便获得造血干/祖细胞。
根据本发明的实施例，利用该方法诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞，胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，并且造血集落形成能力增强，诱导效果稳定性好。
进一步地，根据本发明的再一方面，本发明提供了一种制备造血干/祖细胞的***。根据本发明的实施例，该***包括：第一培养装置，所述第一培养装置利用第一培养基对预处理的胚胎干细胞进行培养，以便得到生血内皮细胞；和第二培养装置，所述第二培养装置与第一培养装置相连，所述第二培养装置利用第二培养基对所述生血内皮细胞进行培养，以便获得造血干/祖细胞。
根据本发明的实施例，利用该***诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞，胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的效率显著提高，并且造血集落形成能力增强，诱导效果好且稳定。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的培养基中添加100ng/ml瘦素的实验组，胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化过程中，各诱导培养阶段显微观察的细胞形态图片，图片中，大图的标尺200μm，小图的标尺25μm，其中，
图A显示了诱导分化前人胚胎干细胞的形态图片，
图B显示了第二阶段培养后获得的细胞的形态图片，
图C显示了第三阶段培养后获得的细胞的形态图片，
图D显示了第四阶段培养后获得的细胞的形态图片，
图2显示了根据本发明一个实施例的实验组的胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化过程中各诱导培养阶段，诱导细胞造血特征基因Runx1和HoxB4的表达变化趋势示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的实验组的胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化过程中第二阶段获得的细胞的特异性的标志蛋白Brachyury的表达情况图示；
图4显示了根据本发明一个实施例的实验组和对照组的胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化过程中第三阶段获得的细胞的特异性的标志表面蛋白KDR、CD31和CD144的表达情况图示；
图5显示了根据本发明一个实施例的实验组和对照组的胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化过程中第四阶段获得的细胞的特异性标志表面蛋白CD34和CD45的表达情况图示；
图6显示了根据本发明一个实施例的实验组和对照组的胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化过程中第四阶段获得的细胞的集落形成情况图示；以及
图7显示了根据本发明一个实施例的实验组和对照组的胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化过程中第四培养阶段获得的细胞的造血特异性转录因子RUNX1蛋白的表达情况图示。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提供了瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途。
其中，需要说明的是，本申请所提及的胚胎干细胞均来自商业化的永生化细胞株，例如，WA01和WA09，均来自美国WiCell研究中心，其获取并不需要破坏人类的胚胎，不违反伦理道德。
发明人惊奇的发现，瘦素可以显著提高胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的效率，提高分化细胞的造血集落形成能力，诱导效果好且稳定。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一培养基和第二培养基。
第一培养基，所述第一培养基为添加了瘦素的AdvancedRPMI 1640培养基。根据本发明的具体示例，所述瘦素的浓度为10-300ng/ml，优选地，50-150ng/ml。由此，胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。根据本发明的一些具体示例，所述第一培养基进一步添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组人骨形成蛋白4(BMP4)、重组人碱性成纤维生长因子(bFGF)和重组人血管内皮生长因子(VEGF)，其中，所述1-硫代甘油的浓度为3×10-4M～5×10-4M，优选地，4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为40μg/ml～60μg/ml，优选地，50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为1mM～3mM，优选地，2mM；所述重组人骨形成蛋白4的浓度为10ng/ml～30ng/ml，优选地，20ng/ml；所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为10ng/ml～30ng/ml，优选地，20ng/ml；以及所述重组人血管内皮生长因子的浓度为40ng/ml～60ng/ml，优选地，50ng/ml。由此，培养基无需牛血清等异源组分，并且胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。
第二培养基，所述第二培养基为添加了瘦素的Stempro 34培养基。根据本发明的具体示例，所述瘦素的浓度为10-300ng/ml，优选地，50-150ng/ml。由此，胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。根据本发明的一些具体示例，所述第二培养基进一步添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、SCF、IL-3、FLT-3L和CHIR99021。其中，所述1-硫代甘油的浓度为3×10-4M～5×10-4M，优选地，4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为40μg/ml～60μg/ml，优选地，50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为1mM～3mM，优选地，2mM；所述重组人干细胞因子的浓度为40ng/ml～60ng/ml，优选地，50ng/ml；所述重组人白介素3(IL-3)的浓度为40ng/ml～60ng/ml，优选地，50ng/ml；所述人FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT-3L)的浓度为40ng/ml～60ng/ml，优选地，50ng/ml；以及所述CHIR99021的浓度为2μM～4μM，优选地，3μM。由此，培养基无需牛血清等异源组分，并且胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。
发明人惊奇的发现，利用该试剂盒诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞，集落形成能力增强，并且胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的效率显著提高，诱导效果好且稳定。
根据本发明的一些实施例，该试剂盒进一步包括：第三培养基和第四培养基，其中，所述第三培养基为添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺的Advanced RPMI1640培养基，所述第四培养基为添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组激活素A(Activin A)、BMP4、bFGF和CHIR99021 3μM的Advanced RPMI 1640培养基。其中，根据本发明的具体示例，所述1-硫代甘油的浓度为3×10-4M～5×10-4M，优选地，4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为40μg/ml～60μg/ml，优选地，50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为1mM～3mM，优选地，2mM；所述Activin A的浓度为15ng/ml～35ng/ml，优选地，25ng/ml；所述BMP4的浓度为10ng/ml～30ng/ml，优选地，25ng/ml；所述bFGF的浓度为10ng/ml～30ng/ml，优选地，25ng/ml；以及所述CHIR99021的浓度为2μM-4μM，优选地，3μM。由此，培养基无需牛血清等异源组分，并且胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种利用前述的试剂盒制备造血干/祖细胞的方法。该方法包括：利用所述第一培养基对预处理的胚胎干细胞进行培养，以便得到生血内皮细胞；和利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞进行培养，以便获得造血干/祖细胞。
根据本发明的实施例，利用该方法诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞，胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，并且造血集落形成能力增强，诱导效果稳定性好。
根据本发明的具体实施例，所述预处理包括：利用所述第三培养基对胚胎干细胞进行培养，以便得到失去部分全能性的胚胎干细胞；和利用所述第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞进行培养，以便得到中胚层祖细胞。由此，获得的失去部分全能性的胚胎干细胞和中胚层祖细胞，细胞活性好，分化能力强。
根据本发明的一些具体实施例，利用所述第一培养基对所述预处理的胚胎干细胞培养84-108小时，利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞培养84-108小时，利用所述第三培养基对胚胎干细胞培养12-26小时，利用所述第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞培养36-60小时。由此，获得了大量人胚胎干细胞来源的造血干/祖细胞，高表达造血干/祖细胞特有的基因和表面蛋白，具有造血集落的形成能力。
进一步地，根据本发明的再一方面，本发明提供了一种制备造血干/祖细胞的***。根据本发明的实施例，该***包括：第一培养装置，所述第一培养装置利用第一培养基对预处理的胚胎干细胞进行培养，以便得到生血内皮细胞；和第二培养装置，所述第二培养装置与第一培养装置相连，所述第二培养装置利用第二培养基对所述生血内皮细胞进行培养，以便获得造血干/祖细胞。
根据本发明的实施例，利用该***诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，并且造血集落形成能力增强，诱导效果稳定性好。
根据本发明的具体实施例，该***进一步包括：预处理装置，所述预处理装置与所述第一培养装置相连，用于对所述胚胎干细胞进行预处理，所述预处理装置包括：第三培养单元，所述第三培养单元利用第三培养基对胚胎干细胞进行培养，以便得到失去部分全能性的胚胎干细胞；和第四培养单元，所述第四培养单元利用第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞进行培养，以便得到中胚层祖细胞。由此，利用该预处理装置获得的失去部分全能性的胚胎干细胞和中胚层祖细胞，细胞活性好，分化能力强。
根据本发明的一些具体实施例，利用所述第一培养基对所述预处理的胚胎干细胞培养84-108小时，利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞培养84-108小时，利用所述第三培养基对胚胎干细胞培养12-26小时，利用所述第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞培养36-60小时。由此，获得了大量人胚胎干细胞来源的造血干/祖细胞，高表达造血干/祖细胞特有的基因和表面蛋白，具有造血集落的形成能力。
根据本发明的一些实施例，所述第一培养基为添加了瘦素的AdvancedRPMI 1640培养基。根据本发明的具体示例，所述瘦素的浓度为10-300ng/ml，优选地，50-150ng/ml。由此，胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。根据本发明的一些具体示例，所述第一培养基进一步添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、BMP4、bFGF和VEGF，其中，所述1-硫代甘油的浓度为3×10-4M～5×10-4M，优选地，4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为40μg/ml～60μg/ml，优选地，50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为1mM～3mM，优选地，2mM；所述重组人骨形成蛋白4的浓度为10ng/ml～30ng/ml，优选地，20ng/ml；所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为10ng/ml～30ng/ml，优选地，20ng/ml；以及所述重组人血管内皮生长因子的浓度为40ng/ml～60ng/ml，优选地，50ng/ml。由此，培养基无需牛血清等异源组分，并且胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。
根据本发明的一些实施例，所述第二培养基为添加了瘦素的Stempro 34培养基。根据本发明的具体示例，所述瘦素的浓度为10-300ng/ml，优选地，50-150ng/ml。由此，胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。根据本发明的一些具体示例，所述第二培养基进一步添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、SCF、IL-3、FLT-3L和CHIR99021。其中，所述1-硫代甘油的浓度为3×10-4M～5×10-4M，优选地，4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为40μg/ml～60μg/ml，优选地，50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为1mM～3mM，优选地，2mM；所述重组人干细胞因子的浓度为40ng/ml～60ng/ml，优选地，50ng/ml；所述重组人白介素3的浓度为40ng/ml～60ng/ml，优选地，50ng/ml；所述人FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为40ng/ml～60ng/ml，优选地，50ng/ml；以及所述CHIR99021的浓度为2μM～4μM，优选地，3μM。由此，培养基无需牛血清等异源组分，并且胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。
根据本发明的一些实施例，所述第三培养基为添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺的Advanced RPMI 1640培养基，所述第四培养基为添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、Activin A、BMP4、bFGF和CHIR99021 3μM的Advanced RPMI 1640培养基。其中，所述1-硫代甘油的浓度为3×10-4M～5×10-4M，优选地，4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为40μg/ml～60μg/ml，优选地，50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为1mM～3mM，优选地，2mM；所述Activin A的浓度为15ng/ml～35ng/ml，优选地，25ng/ml；所述BMP4的浓度为10ng/ml～30ng/ml，优选地，25ng/ml；所述bFGF的浓度为10ng/ml～30ng/ml，优选地，25ng/ml；以及所述CHIR99021的浓度为2μM-4μM，优选地，3μM。由此，培养基无需牛血清等异源组分，并且胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Gibco公司。
实施例1
一、细胞的诱导分化培养
1.人胚胎干细胞的培养
发明人对MA01和MA09系人胚胎干细胞(来自美国Wicell研究中心)进行培养。具体地，将MA01和MA09系人胚胎干细胞分别培养在含mTeSR培养基(2.5ml/孔)并包被基质胶的六孔板中，每天更换新鲜的培养基。待克隆生长至70-80％汇合度后，用分散酶处理细胞，待克隆边缘卷起后，吸弃消化酶，并用培养基润洗细胞以充分终止消化酶的作用。将克隆吹成小细胞团块，按1:4的传代比例将其接种到新的培养孔中继续培养，传代周期为4-6天，获得大量扩增后的人胚胎干细胞，利用显微镜(OLYMPUS，CKX31)观察细胞的形态，如图1A所示，细胞呈克隆状生长，细胞排列紧密，细胞内核质比高，该胚胎干细胞可冻存于液氮中保存备用。
2.人胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化
将步骤1获得的扩增后的人胚胎干细胞进行诱导分化，主要包括以下4个诱导分化阶段：
第一阶段：吸弃人胚胎干细胞的培养基，以便促进人胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化，24小时后，用DF12培养基(购自Thermo公司，HyClone SH30023.01B)润洗细胞，然后，加入培养基1，处理细胞24小时，使胚胎干细胞失去部分全能性。
其中，培养基1组分为：
Advanced RPMI 1640培养基
1-硫代甘油4×10-4M
维生素C磷酸酯50μg/ml
谷氨酰胺2mM
第二阶段：吸弃第一阶段处理后的细胞的培养基，更换培养基2诱导培养48小时，利用显微镜(OLYMPUS，CKX31)观察诱导培养后细胞的形态，如图1B所示，细胞排列逐渐疏松，克隆中央出现半凸起细胞团，克隆边缘细胞向克隆外伸展，细胞由上皮状向间质样转变，细胞核质比降低。其中，培养基2组分为：
Advanced RPMI 1640培养基
1-硫代甘油4×10-4M
维生素C磷酸酯50μg/ml
谷氨酰胺2mM
Activin A 25ng/ml
BMP4 25ng/ml
bFGF 25ng/ml
CHIR99021 3μM
第三阶段：吸弃第二阶段处理后的细胞的培养基，并用培养基1润洗1-2次。然后，更换培养基3进行诱导培养96小时，期间换液一次，利用显微镜(OLYMPUS，CKX31)观察诱导培养后细胞的形态，如图1C所示，间质样细胞进一步增多，细胞排列疏松，出现一部分铺路石样形态的内皮细胞。
其中培养基3组分为：
Advanced RPMI 1640培养基
1-硫代甘油4×10-4M
维生素C磷酸酯50μg/ml
谷氨酰胺2mM
BMP4 20ng/ml
bFGF 20ng/ml
VEGF 50ng/ml
Leptin 100ng/ml
第四阶段：吸弃第三阶段处理后的细胞的培养基，将细胞用培养基1润洗1-2次后，换入培养基4(培养基4组分：Stempro 34培养基+1-硫代甘油4×10-4M+维生素C磷酸酯50μg/ml+谷氨酰胺2mM+SCF 50ng/ml+IL-3 50ng/ml+FLT-3L 50ng/ml+CHIR990213μM+Leptin100ng/ml)进行诱导培养，诱导96小时，获得造血干/祖细胞，设置该细胞为实验组，利用显微镜(OLYMPUS，CKX31)观察诱导培养获得的造血干/祖细胞的形态，如图1D所示，在贴壁细胞中出现大量悬浮细胞。
设置不含瘦素的培养基3和4，获得的造血干/祖细胞为对照组。
二、细胞的鉴定和检测
1、细胞RNA提取、反转录及实时定量PCR检测目的基因的表达
利用实时定量PCR检测实验组的人胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化过程中，胚胎干细胞各个诱导分化阶段的目的基因的表达情况，具体如下：
1.1实验方法
1.1.1收集细胞
(1)用不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗细胞后，用Accutase消化酶将诱导细胞消化成单细胞。
(2)将细胞离心后吸弃上清。
1.1.2提取RNA
(1)向上述收集的细胞中加入裂解液(RLT，QIAGEN,74104)，高速震荡充***解细胞。
(2)用试剂盒(RNeasy Mini Kit，QIAGEN,74104)，按说明书的步骤对裂解后的细胞进行分离纯化，提取细胞中总RNA。
1.1.3检测RNA溶液浓度和纯度
RNA浓度及纯度数据通过紫外分光光度计(eppendorf，biophotometer plus)260nm/280nm吸光值(A260/280)检测获得，纯度要求A260/280比值介于1.8-2.0之间。
1.1.4反转录
精确吸取含1μg总RNA的溶液，用反转录试剂盒(TOYOBO,FSQ-201)，按说明书的步骤将RNA反转录为cDNA，由此，获得样品的cDNA，并于-20℃下保存，备用。
1.1.5实时定量PCR
实时定量反应体系如下表所示。将试剂混匀后加至PCR管中，并用实时定量PCR仪(BIO-RAD,iQ5)检测目的基因的表达情况。
反应条件：
1.1.6采集数据，并对数据进行分析处理。
1.2实验结果
通过对数据的分析处理，目的基因的表达情况如图2所示，通过使用上述所述的诱导培养基，造血干/祖细胞特有的标志基因Runx和HoxB4的表达水平均随着诱导时间延长显著提高。
2.流式细胞术检测细胞核蛋白
利用流式细胞术检测实验组第二阶段获得的细胞的细胞核蛋白，具体如下：
2.1实验方法：
2.1.1收集细胞
(1)用不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗诱导细胞后，用Accutase消化酶将诱导细胞消化成单细胞。
(2)将细胞离心后吸弃上清，并用含2％牛血清的PBS重悬洗涤细胞。
(3)将细胞悬液通过70-100μm细胞筛网除去细胞团块，再次离心后吸弃上清。
2.1.2标记抗体
根据抗体说明书，将上述收集的细胞置于离心管中并将1×106细胞重悬于500μl的固定剂中，室温避光孵育10分钟。然后，用PBS洗涤细胞2次，用穿膜洗涤液洗涤细胞一次，用100μl的穿膜洗涤液重悬细胞，向细胞悬液中加入同型对照抗体或Brachyury-PE抗体(10μl/test)后混匀，置于4℃避光孵育45分钟。
2.1.3洗抗体
将标记后的细胞用穿膜洗涤液洗涤2-3次后重悬于400μl PBS中。
2.1.4流式细胞术检测
按照产品说明书及操作指南，将上述获得的重悬细胞利用流式细胞仪检测细胞内蛋白的表达情况。
2.2.实验结果
利用流式细胞仪(BD，FACSAria)检测细胞内该蛋白的表达情况，如图3所示，经过第一阶段的诱导分化后，绝大部分细胞表达中胚层特有的核转录因子Brachyury，说明该培养基能够高效诱导人胚胎干细胞向中胚层细胞分化。
3、流式细胞术检测细胞表面膜蛋白
利用流式细胞术分别检测第三阶段和第四阶段获得的细胞的表面膜蛋白的表达情况，具体如下：
3.1实验方法：
按以下步骤分别处理实施例1获得的实验组和对照组的细胞，具体如下
3.1.1收集细胞：
(1)用不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗细胞后，用Accutase消化酶将诱导细胞消化成单细胞。
(2)将细胞离心后吸弃上清，并用含2％牛血清的PBS重悬洗涤细胞。
(3)将细胞悬液通过70-100μm细胞筛网除去细胞团块，再次离心后吸弃上清，用100μl的PBS溶液重悬细胞。
3.1.2标记抗体
根据抗体说明书，将上述收集的细胞置于离心管中并将2×105-1×106细胞重悬于100μl PBS中，之后添加相应的抗体，向各检测样本的细胞悬液中加入同型对照抗体或检测抗体，其中，第三阶段细胞的检测抗体为KDR、CD31和VE-CAD抗体(KDR抗体BD公司，560494；CD31抗体eBioscience，17-0319-42；CD144抗体BD公司，561566)，第四阶段获得的细胞的检测抗体为CD34和CD45(CD34抗体eBioscience9012-0349；CD45抗体BD公司，555485)，抗体使用剂量均为5μl/test，然后混匀，置于4℃避光孵育45分钟。
3.1.3洗抗体
标记完成后，使用1.4ml PBS重悬上述经过抗体标记的细胞，并于1000rpm下离心5分钟。之后弃上清，重复上述步骤3次(即重悬和离心)。
3.1.3重悬
将细胞重悬于400μlPBS中。
3.1.4流式细胞术检测
按照产品说明书及操作指南，将上述获得的重悬细胞中加入7-AAD(1μl/test)室温避光孵育5分钟后，进行流式细胞术的检测。
3.2实验结果
用流式细胞仪(BD，FACSAria)检测细胞表面蛋白的表达情况，如图4和5所示，向分化第二阶段诱导培养基中添加瘦素后，生血内皮细胞表面标志蛋白KDR、CD3和CD144的表达比例显著提高。在诱导分化第三阶段添加瘦素后，造血干/祖细胞表面标志蛋白CD34和CD45的表达效率显著提高。说明添加瘦素能够显著提高生血内皮细胞和造血干/祖细胞的诱导分化效率。
4、造血集落形成检测
通过细胞和细胞集落计数，检测第四阶段获得的造血干/祖细胞的集落形成情况。
4.1实验方法
4.1.1收集细胞
(1)用不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗造血干/祖细胞后，用Accutase消化酶将诱导细胞消化成单细胞。
(2)将细胞离心后吸弃上清，并用含2％牛血清的PBS重悬洗涤细胞。
(3)将细胞悬液通过70-100μm细胞筛网除去细胞团块，再次离心后吸弃上清，500μl的Stempro 34培养基重悬细胞。
4.1.2细胞和细胞集落计数
将重悬细胞的细胞密度进行计数，向低吸附24孔板中加入500μl半固体培养基(Stemcell公司，MethoCult 04435)，将等量的细胞加入到培养基中，充分搅拌将细胞混匀。将培养板置于5％二氧化碳的37℃培养箱中，继续培养7-10天后对形成的造血干/祖细胞集落进行计数。
4.2实验结果
对照组和实验组的造血干/祖细胞集落总数如图6所示，实验组的集落总数显著高于对照组，为对照组的3倍左右，说明瘦素能显著提高细胞造血集落形成能力。
5、Western Blot
5.1实验方法
5.1.1细胞分组：按照“一、细胞的诱导分化培养”的方法对细胞进行诱导分化培养，设置实验组和对照组，其中，对照组为不含瘦素的培养基3和4，获得的造血干/祖细胞，实验组分为3个小组，(1)组：瘦素浓度为20ng/ml的培养基3和4，获得的造血干/祖细胞；(2)组：瘦素浓度为100ng/ml的培养基3和4，获得的造血干/祖细胞；(3)组：瘦素浓度为200ng/ml的培养基3和4，获得的造血干/祖细胞；
5.1.2收集细胞
(1)用不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗造血干/祖细胞后，用Accutase消化酶将诱导细胞消化成单细胞。
(2)将细胞离心后吸弃上清。
5.1.3检测总蛋白含量
(1)加入含1％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(100μl/管)，4℃旋转孵育1-2小时后130000rpm低温离心20分钟。
(2)离心后，吸取上清至新的EP管中，检测各样本中总蛋白的含量。
5.1.4SDS-Page电泳
分别吸取各组等量蛋白，与5X Load Buffer混匀，沸水浴5分钟，用12％丙烯酰胺-page胶电泳分离蛋白。
5.1.5转膜
利用半干法将胶中蛋白转移至0.45μm PVDF膜上。
5.1.6免疫反应
(1)用5％脱脂牛奶封闭膜1小时。
(2)将封闭后的膜，加入兔抗人RUNX1抗体(用5％脱脂牛奶配制)4℃孵育过夜，用PBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。
(3)将上述膜置于串联HRP的山羊抗兔二抗溶液中(用5％脱脂牛奶配制)室温孵育1小时，用PBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。
5.1.7化学发光，显影，定影
用ECL溶液孵育膜10秒，在暗室中用感光胶片检测膜上特异性条带的发光情况。
5.2实验结果
将胶片进行拍照，如图7所示，用凝胶图像处理***分析目标带，由图可见，向诱导培养基中添加瘦素能够显著提高造血分化关键的转录因子蛋白RUNX1的表达，且对瘦素的浓度存在一定的量效关系，添加100ng/ml瘦素对RUNX1蛋白的激活效果最佳。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种用于诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞的试剂盒，其特征在于，包括：
第一培养基，所述第一培养基为添加了瘦素的AdvancedRPMI 1640培养基；以及
第二培养基，所述第二培养基为添加了瘦素的Stempro 34培养基，
第三培养基，所述第三培养基为添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺的Advanced RPMI 1640培养基，
第四培养基，所述第四培养基为添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组激活素A、重组人骨形成蛋白4、重组人碱性成纤维生长因子和CHIR99021的Advanced RPMI1640培养基，
其中，所述第一培养基中、第二培养基中的瘦素的浓度为10-300ng/ml，
所述第一培养基进一步添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组人骨形成蛋白4、重组人碱性成纤维生长因子和重组人血管内皮生长因子，
所述第一培养基中，所述1-硫代甘油的浓度为4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为2mM；所述重组人骨形成蛋白4的浓度为20ng/ml；所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为20ng/ml；以及所述重组人血管内皮生长因子的浓度为50ng/ml；
所述第二培养基进一步添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组人干细胞因子、重组人白介素3、人FMS样酪氨酸激酶3配体和CHIR99021；
所述第二培养基中，所述1-硫代甘油的浓度为4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为2mM；所述重组人干细胞因子的浓度为50ng/ml；所述重组人白介素3的浓度为50ng/ml；所述人FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为50ng/ml；以及所述CHIR99021的浓度为3μM；
所述第三培养基和第四培养基中，所述1-硫代甘油的浓度为4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为2mM；所述重组激活素A的浓度为25ng/ml；所述重组人骨形成蛋白4的浓度为25ng/ml；所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为25ng/ml；以及所述CHIR99021的浓度为3μM，
其中，所述胚胎干细胞均来自商业化的永生化细胞株。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一培养基中、第二培养基中的瘦素的浓度为50-150ng/ml。
3.一种利用权利要求1或2所述的试剂盒制备造血干/祖细胞的方法，其特征在于，包括：
利用所述第一培养基对预处理的胚胎干细胞进行培养，以便得到生血内皮细胞；和
利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞进行培养，以便获得造血干/祖细胞，
其中，所述预处理包括：
利用所述第三培养基对胚胎干细胞进行培养，以便得到失去部分全能性的胚胎干细胞；和
利用所述第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞进行培养，以便得到中胚层祖细胞，
其中，所述胚胎干细胞均来自商业化的永生化细胞株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用所述第一培养基对所述预处理的胚胎干细胞培养84～108小时，
利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞培养84～108小时，
利用所述第三培养基对胚胎干细胞培养12～26小时，
利用所述第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞培养36～60小时。
5.一种制备造血干/祖细胞的***，其特征在于，包括：
预处理装置，所述预处理装置用于对胚胎干细胞进行预处理，所述预处理装置包括：第三培养单元，所述第三培养单元利用第三培养基对胚胎干细胞进行培养，以便得到失去部分全能性的胚胎干细胞；和第四培养单元，所述第四培养单元利用第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞进行培养，以便得到中胚层祖细胞；
第一培养装置，所述第一培养装置与所述预处理装置相连，所述第一培养装置利用第一培养基对预处理的胚胎干细胞进行培养，以便得到生血内皮细胞；和
第二培养装置，所述第二培养装置与第一培养装置相连，所述第二培养装置利用第二培养基对所述生血内皮细胞进行培养，以便获得造血干/祖细胞，
其中，
所述第一培养基为添加了瘦素的AdvancedRPMI 1640培养基；
所述第二培养基为添加了瘦素的Stempro 34培养基；
所述第三培养基为添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺的Advanced RPMI1640培养基；
所述第四培养基为添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组激活素A、重组人骨形成蛋白4、重组人碱性成纤维生长因子和CHIR99021的Advanced RPMI 1640培养基，
所述第一培养基中、第二培养基中，所述瘦素的浓度为10ng/ml～300ng/ml，
所述第一培养基进一步添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组人骨形成蛋白4、重组人碱性成纤维生长因子和重组人血管内皮生长因子，
所述第一培养基中，所述1-硫代甘油的浓度为4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为2mM；所述重组人骨形成蛋白4的浓度为20ng/ml；所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为20ng/ml；以及所述重组人血管内皮生长因子的浓度为50ng/ml，
所述第二培养基进一步添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组人干细胞因子、重组人白介素3、人FMS样酪氨酸激酶3配体和CHIR99021，
所述第二培养基中，所述1-硫代甘油的浓度为4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为2mM；所述重组人干细胞因子的浓度为50ng/ml；所述重组人白介素3的浓度为50ng/ml；所述人FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为50ng/ml；以及所述CHIR99021的浓度为3μM，
所述第三培养基和所述第四培养基中，所述1-硫代甘油的浓度为4×10-4M；所述维生素C磷酸酯的浓度为50μg/ml；所述谷氨酰胺的浓度为2mM；所述重组激活素A的浓度为25ng/ml；所述重组人骨形成蛋白4的浓度为25ng/ml；所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为25ng/ml；以及所述CHIR99021的浓度为3μM，
其中，所述胚胎干细胞均来自商业化的永生化细胞株。
6.根据权利要求5所述的***，其特征在于，利用所述第一培养基对所述胚胎干细胞培养84～108小时，
利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞培养84～108小时，
利用所述第三培养基对所述胚胎干细胞培养12～26小时，
利用所述第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞培养36～60小时。
7.根据权利要求6所述的***，其特征在于，所述第一培养基中、第二培养基中，所述瘦素的浓度为50ng/ml～150ng/ml。
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