WO2024136540A1 - 잉어봄바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법 - Google Patents
잉어봄바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법 Download PDFInfo
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Definitions
- RT-PCR reverse-transcription PCR
- SVC Aphanomyces invadans
- FISH fluorescent peptide nucleic acid in-situ hybridisation
- the present invention includes a primer pair for amplifying the Matrix protein coding gene and/or the Nucleocapsid coding gene of Spring viraemia of carp (SVC), It relates to a composition for detecting carp spring virus disease caused by carp spring virus infection.
- the amount of the amplification product can be detected by a fluorescence signal.
- the intercalating method uses an intercalator that binds to the double-stranded DNA of the amplification product to which the probe is bound and displays fluorescence.
- the 5' end is labeled with a fluorescent substance and the 3' end is labeled with a quencher.
- the present invention also relates to carp caused by Spring viraemia of carp infection, comprising a primer pair for amplifying the Matrix protein coding gene or the Nucleocapsid coding gene of Spring viraemia of carp.
- This relates to a kit for detecting spring virus disease (Spring viraemia of carp; SVC).
- biological samples analyzed include body fluid samples, including blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, ocular fluid, saliva, semen, brain extracts (e.g., brain pulverized material), spinal fluid, appendix, and spleen. and tonsil tissue extract, but are not limited thereto.
- body fluid samples including blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, ocular fluid, saliva, semen, brain extracts (e.g., brain pulverized material), spinal fluid, appendix, and spleen. and tonsil tissue extract, but are not limited thereto.
- RNA sample of Spring viraemia of carp the cause of carp spring virus disease (Spring viraemia of carp; SVC), and analyzed to determine the causative virus. Detection was performed.
- PCR was performed using Exicycler96TM (Bioneer, Korea).
- Table 2 The composition of the reactants for PCR targeting the matrix protein coding gene is shown in Table 2, and the composition of the reactant for PCR targeting the matrix protein coding gene and the nucleocapsid coding gene is shown in Table 3.
- real-time PCR was performed by creating a PCR master mix and adding 5 ⁇ l viral RNA.
- Table 4 shows the amplification conditions and hybridization reaction conditions of the reactants, and shows the process of amplifying and hybridizing the viral RNA sample and then increasing the temperature of the hybridized product. The above process was performed by real-time PCR.
- the causative agent of spring viraemia of carp (SVC) and Real-time PCR was performed by adding 5 ⁇ L of nucleic acid of similar viruses.
- Figures 2a and 2b show the results of PCR using a primer pair with improved sensitivity and a TaqMan probe for the nucleic acid of a virus similar to the causative agent of spring viraemia of carp (SVC).
- compositions, kit, and detection method that can sensitively molecularly diagnose spring viraemia of carp, the causative agent of carp spring virus disease, through the primer pair according to the present invention, it is simple to determine whether the pathogen is infected. ⁇ It is effective in detecting quickly and accurately.
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Abstract
본 발명은 잉어봄바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍, 이를 포함하는 잉어봄바이러스 검출용 조성물, 검출용 키트 및 이를 이용한 잉어봄바이러스 검출방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 잉어봄바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍, 이를 포함하는 잉어봄바이러스 검출용 조성물, 검출용 키트 및 이를 이용한 잉어봄바이러스 검출방법에 관한 것이다.
잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp virus; SVCV)는 잉어, 비단잉어, 붕어, 초어 및 금붕어와 같은 담수성 어류에 체색 흑화, 안구돌출, 체표 및 아가미 출혈, 항문 돌출 및 복부팽만 등의 병변이 나타나는 질환으로 주로 봄철 수온 10 ~ 17C°에서 발생한다. 대부분의 유럽 국가들과 구소련의 연방국가들(벨라루스, 조지아, 리투아니아, 몰도바, 러시아 및 우크라이나)에서 발생이 보고되었고 점차 브라질, 미국, 캐나다 및 중국 등에서 보고되었다. 유럽의 치어에서 최대 70% 높은 폐사율이 보고되었으며 통상적으로 1-40%의 손실을 일으킨다. SVCV는 국내에서 제1종 수산생물전염병으로 지정되어 있으며, 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, WOAH)에 지정되어 있는 질병이다.
잉어봄바이러스 (Infection with Spring viraemia of carp)에 의해 발병하는 SVCV는 전 세계적으로 발생하며 담수성 어류(예를 들어 잉어, 붕어) 모두에 감염되어 대량 폐사를 초래한다. 자연적으로 발생하는 SVCV 감염은 잉어(Cyprinus carpio carpio) 및 비단잉어(Cyprinus carpio koi), 붕어(Carassius carassius), 백련어(Hypophthalmichthys molitrix), 대두어(Aristichthys), 초어((Ctenopharyngodon idella), 금붕어(Carassius auratus), 금빛황어(Leuciscus idus), 텐치(Tinca tinca) 및 도미(Abramis brama)가 있으며, 흰잉어(Cirrhinus merigala), 로후(Labeo rohita) 및 남아시아 잉어(Catla catla)의 3종의 인도 잉어도 SVCV의 숙주로 보고되었다.
수산생물질병의 진단방법으로는 다양한 분자 진단 방법과 키트 등이 개발되어 있다. 일반적으로 중합효소연쇄반응을 이용하여 전기영동법을 통해 확인하거나 SYBR Green과 TaqMan 프로브를 이용한 실시간중합효소연쇄반응 (Real-time Polymerase Chain Reaction; Real-time PCR) 기반의 진단방법이 많이 사용되고 있다 (한국양식학회 2004년도 수산관련학회 공동학술대회 발표요지집 2004 May 13, 2004년, pp.387 - 388).
실시간중합효소연쇄반응에서는 형광 리포터 물질을 사용하여 증폭의 매 주기마다 증폭 산물이 축적됨에 따라 비례하여 증가하게 된다. 실시간 정량 분석 방법 중 TaqMan을 이용한 방법으로, TaqMan 프로브는 기존의 중합효소연쇄반응처럼 아가로즈겔 분석 없이, 특이성이 매우 높은 TaqMan을 이용한다. 약 2시간 정도의 1회 반응으로 증폭된 산물의 서열 정보를 확인할 수 있으며, 표준시료를 이용하여 시료 중 핵산의 양을 정확하게 측정할 수 있다.
현재까지 수산생물법정전염병에 대한 표준 진단법으로는 일반적인 유전자 진단법인 종래 RT-PCR(reaverse-transcription PCR)법이 지정되어 있다. 하지만 잉어봄바이러스병 (Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 잉어봄바이러스 (Aphanomyces invadans: A. invadans)의 경우 중합효소연쇄반응과 FISH (Fluorescent peptide nucleic acid in-situ hybridisation) 방법이 개발되어 OIE에 등록되어 있으나, Real-time PCR 기반의 진단방법과 키트가 개발되어 있지 않아, 기존의 종래 PCR법을 수행하여 RT-PCR 증폭산물을 전기영동으로 확인한 다음, 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, WOAH)의 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code)의 기준에 따른 진단을 수행하도록 규정되어 있다. SVCV의 진단을 하기 위해서는 감염조직으로부터 RNA를 분리하고, RT-PCR를 진행해야 하는 단점이 있어 Real-time PCR을 이용한 진단법은 현재까지 보고된 바로는 없는 실정이다.
WOAH에 등록되어 있는 SVCV의 Real-Time PCR 진단 방법은 Protocol 1(SVCV n2 F, SVCV n2 R, SVCV n2 P)이 있으며 SVCV를 진단 및 판별을 위해서는 WOAH 기준에 따라 RT-PCR을 실시하고 시퀀싱 단계를 거쳐 최종적으로 판별한다.
이러한 기술적 배경에서, 본 출원의 발명자들은 잉어봄바이러스병 (Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp virus) 검출용 PCR 산물을 통해 새우류 질병 원인체를 판별하고, 상기 질병 원인체에 감염된 개체 (예컨대, 새우류)로부터 잉어봄바이러스 (Spring viraemia of carp virus)를 검출하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 잉어봄바이러스 (Spring viraemia of carp virus) 중 2개 유전자의 염기서열을 잉어봄바이러스병 판별 및/또는 검출용 유전자 마커로 선정하고, 선정된 마커를 이용하여 형광의 증폭을 나타나게 함으로써 새우류 질병 원인병원체를 기존의 Real-Time PCR법 보다 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있음을 확인하였고, 본 발병을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술에 대한 정보는 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 (Spring viraemia of carp; SVC) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 잉어봄바이러스 (Spring viraemia of carp: SVC)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 및/또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 잉어봄바이러스 (Spring viraemia of carp: SVC)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, 검체에서 추출된 핵산을 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp: SVC)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출방법에 관한 것이다.
도 1a 및 도 1b는 각각 본 발명에 사용된 프라이머 쌍 및 택맨 프로브 (TaqMan probe)의 염기서열 일례를 나타낸 결과이다 (A: 기질 단백질 코딩 유전자를 표적하는 프라이머 쌍 및 TaqMan probe, B: 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 유전자를 표적하는 프라이머 쌍 및 TaqMan probe).
도 2a 및 도 2b는 각각 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체와 유사한 바이러스류의 핵산에 대해 민감도가 향상된 프라이머 쌍 및 TaqMan probe를 이용하여 PCR을 수행한 결과이다
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp: SVC)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 및/또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 검체에서 추출된 핵산을 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp: SVC)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 및/또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 Spring viraemia of carp virus를 검출하고, 상기 원인병원체에 감염된 개체(예컨대, 잉어 붕어)를 검출하는 방법을 개발하고자, 바이러스 유형에 따른 특이적 염기서열을 가지는 검출용 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 수산생물전염병의 원인병원체를 검출할 수 있었다.
본 명세서에서 ‘프라이머’는 적합한 온도 및 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 따른 프라이머는 실시간중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 프라이머 쌍으로 단일의 프라이머를 사용했을 때보다 민감도가 약 3배 정도 향상되어, 민감한 검출이 가능하고, 잉어봄바이러스 (Spring viraemia of carp)를 검출할 수 있어, 담수성 어류에서 발생하는 잉어봄바이러스병에 대해 조기에 검출하여 피해를 줄일 수 있고 질병에 대한 방역 대책을 마련할 수 있는 효과가 있다.
본 명세서에서 ‘상보적 결합’은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션되는 것을 의미하고, 이합체(duplex) 구조를 형성할 수 있다. 상보적 결합은 쌍을 이루는 뉴클레오티드 서열 간의 상보성이 왓슨-크릭 결합(Watson-Crick pair)을 이루거나, 일부 비 왓슨-크릭 결합(Non-Watson-Crick base pair)이 존재하여도 형성될 수 있다.
타겟을 증폭시킬 수 있는 서열을 포함하는 경우 정확하게 일치하는 서열 뿐 아니라, 추가 bp가 포함되거나 삭제되는 경우에도 타겟을 증폭시킬 수 있다면 프라이머로 사용될 수 있다.
상기 프라이머 쌍은 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하고, 정방향 프라이머는 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자에 특이적으로 결합하여 증폭할 수 있다. 역방향 프라이머는 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자와 상보적 가닥에 결합하여 증폭할 수 있다.
예를 들어 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열을 포함할 수 있다.
상기 프라이머 쌍은 표지자를 포함할 수 있다. 역방향 프라이머에 표지자를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 프라이머에 포함된 표지자는 비오틴, Cy5, Cy3, FITC, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, DIG 또는 항체 또는 이와 결합된 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에, 표지자의 발색을 유도하는 결합제와 반응시켜 발색 또는 형광 발현 여부를 확인하고 표적 핵산의 증폭을 검출할 수 있다. 이 때, 상기 결합제는 스트렙타비딘일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로브는 프라이머 쌍에 의해 특이적으로 증폭된 유전자에 상보적으로 혼성화 할 수 있다.
혼성화 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 혼성화 되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 혼성화 되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 혼성화 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.
매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(혼성화 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 혼성화 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 혼성화에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
상기 프로브는 예를 들어, 서열번호 3 또는 6의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 1 및 2의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 3의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 4 및 5의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 1 및 2의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 3의 서열 및 서열번호 4 및 5의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
상기 증폭 산물의 양은 형광신호에 의해 검출할 수 있다. 프로브가 결합된 증폭산물의 이중 나선 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(intercalator)을 사용하는 인터컬레이팅(Intercalating)법, 5' 말단은 형광물질, 3' 말단은 소광자(quencher)로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법 등이 있다.
구체적으로, 상기 프로브 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자 (quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), 상기 소광자는 포스페이트 (Phosphate)에서 선택되어 사용할 수 있다.
본원발명에 따른 증폭은 실-시간 정량 증폭 예를 들어 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-Time PCR)을 통해 수행될 수 있으며, 실시간 중합효소연쇄반응에 있어 PCR 증폭 산물의 양은 형광 신호에 의해 검출할 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응이 진행되면서 증가하는 폴리뉴클레오티드 양에 따라 형광 신호의 세기가 증가하게 되고, 증폭 사이클 횟수에 따른 형광 신호 세기를 나타내는 증폭 프로파일(amplification profile) 곡선을 얻게 된다.
본 발명의 Real-time PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥 (double strand) DNA 사슬에 인터컬레이션(intercalation)됨으로써 형광량이 비로소 기기에 감지되기 시작한다. 이렇게 형광량이 최저 감지가능 수준(background level)을 넘어 두드러지게 증가하는 시점의 증폭주기인 한계 주기(threshold cycle, Ct)가 나타난다. 주형 초기량의 로그(log)값과 주형을 실시간 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭할 때 해당하는 한계 주기 사이에는 직선적으로 비례하는 관계를 가지고 있다. 따라서, 핵산의 초기량을 이미 알고 있는 시료를 이용하여 초기량의 로그값과 한계 주기를 측정하여 표준검량곡선을 얻음으로써 핵산 증폭산물의 실시간 측정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, Spring viraemia of carp 감염에 의한 잉어봄바이러스병 (Spring viraemia of carp; SVC) 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 경우에 따라, 중합효소, 버퍼와 같은 핵산 증폭 PCR 반응을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 다양한 버퍼 및 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트에서 특정 반응을 위해 사용되는 시약, 버퍼 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 앞서 언급된 프라이머 쌍 및/또는 프로브 각각을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 수행함에 있어 사용되는 키트와 관련된 구성에 대한 설명은 방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 검체는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 잉어, 붕어 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검체로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 핵산의 추출은 예를 들어 상업화 되어 공급되고 있는 다양한 키트 또는 추출 시약을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 검체로부터 표적 핵산 추출시, 핵산 추출에 사용되는 시약(예를 들어, 버퍼) 혹은 여러 가지 요소 (예를 들어, vortexing)에 의해 핵산의 단편이 발생하여 PCR시 민감도가 감소하여 병원체를 검출하기 어려운 가능성이 있다. 핵산의 단편에 의한 민감도를 개선하기 위해 서열번호 1~3 및 서열번호 1~6의 염기서열을 각각 이용하여 비교하는 실험을 수행하였다. 상기 PCR 산물에 대한 형광량을 측정하였을 시 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 Spring viraemia of carp virus를 검출하기 위한 두 방법에서 서열번호 1~6을 이용한 방법이 서열번호 1~3을 이용한 방법보다 민감도가 약 3배 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 Spring viraemia of carp의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자와 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트 제작
잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 Spring viraemia of carp의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자와 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 제작하기 위해서, 미국 국립생물공학정보센터물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열과 전체 유전자 염기서열을 참조하였다. 이로부터 Spring viraemia of carp의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자와 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였으며, 이를 하기 표 1에 나타내었다.
도 1a는 Spring viraemia of carp의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자, 도 1b는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자에 결합하는 프라이머 쌍 및 택맨 프로브 (TaqMan probe)의 일례를 나타내는 염기 서열도이다.
[실시예 2] 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 Spring viraemia of carp의 검출용 Real-Time PCR의 민감도 비교
실시예 1에서 제작된 TaqMan 프로브 및 프라이머를 이용하여, 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 Spring viraemia of carp의 RNA 샘플에 대하여 증폭곡선을 도출하였고, 이를 분석하여 원인바이러스의 검출을 수행하였다. PCR은 Exicycler96™ (Bioneer, 대한민국)을 이용하여 수행하였다. 기질 단백질 코딩 유전자를 표적으로 하는 PCR을 위한 반응물의 조성은 표 2에 나타내었고 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자와 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 표적으로 하는 PCR을 위한 반응물의 조성은 표 3에 나타내었으며, PCR master mix를 만든 후 5μl 바이러스 RNA를 첨가하여 Real-time PCR을 수행하였다.
도 2는 기질 단백질 코딩 유전자, 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자와 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 모두 표적으로 하는 조성물을 이용하였을 때 실시한 형광량을 나타낸 결과이다.
표 4는 반응물의 증폭 조건 및 혼성화 반응 조건을 나타낸 것으로, 바이러스 RNA 샘플을 증폭하고 혼성화한 다음, 상기 혼성화된 산물의 온도를 높이는 과정을 나타낸 것이다. 상기 과정은 Real-time PCR로 수행되었다.
[실시예 3] Real-time PCR의 증폭 곡선에 따른 바이러스의 검출 방법
본 발명에 따른 검출 방법으로 Real-time PCR를 수행하여 샘플을 검출하고자 하는 경우, 표 5에 나타난 바와 같이 형광 리포터를 TaqMan probe에 결합시켜 사용할 수 있다. 예컨대, 표 5에 나타난 바와 같이, 형광 리포터로 바이러스를 검출할 수 있도록 형광 증폭곡선을 확인한다(FAM 형광으로 Spring viraemia of carp 검출).
[실시예 4] 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 Spring viraemia of carp의 검출용 Real-Time PCR의 특이도 비교
본 발명에서 민감도가 향상된 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 및/또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 표적으로 하는 PCR 반응물의 조성을 이용하여 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체와 유사한 바이러스류의 핵산을 5 μL 첨가하여 Real-time PCR을 수행하였다.
도 2a 및 도 2b는 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체와 유사한 바이러스류의 핵산에 대해 민감도가 향상된 프라이머 쌍 및 TaqMan probe를 이용하여 PCR을 수행한 결과이다.
단일의 경우 도 2a 및 다음과 같이 결과가 확인되었다.
듀얼의 경우 도 2b 및 다음과 같이 결과가 확인되었다.
[실시예 5] 잉어봄바이러스병(Spring viraemia of carp; SVC)의 원인체인 SVCV의 검출용 Real-Time PCR의 검출 한계 및 cut-off value 비교
본 발명에서 잉어봄바이러스병(Epizootic ulcerative syndrome; EUS)의 원인체인 SVCV의 matrix 단백질과 nucleocapsid region이 서열이 포함되어 있는 Plasmid DNA를 제작하였고 민감도가 향상된 nucleocapsid 단백질과 matrix 단백질을 표적으로 하는 PCR 반응물의 조성과 matrix 단백질만 표적으로 하는 PCR반응물의 조성을 이용하였다(표 2, 3 참고). 검출 한계 및 cut-off value 분석은 위해 1000~1.4 copies/rxn으로 3 fold-dilution된 Plasmid DNA를 이용하였고 95% probit regression analysis를 사용하여 검출 한계 및 cut-off value를 비교 분석하였다.
도 2a는 matrix 단백질만 표적으로 하는 PCR 조성물에 대한 검출 한계 및 cut-off value를 분석한 결과이고 도 2b는 matrix 단백질과 nucleocapsid 단백질을 표적으로 하는 PCR 조성물에 대한 검출 한계 및 cut-off value를 분석한 결과이다.
첨부된 도 2b는 [표 3]의 프라이머 혼합액을 사용한 결과이고 [표 2]의 프라이머 혼합액을 사용하였을 때 보다 검출 한계에서 약 3배정도 차이나는 것을 확인하였다. 본 발명의 따른 프라이머 혼합액 [표 3]에 의해 잉어봄바이러스병의 원인체인 SVCV의 민감도가 상승함을 확인하였다.
본 발명에 따른 프라이머 쌍을 통해 잉어봄바이러스병의 원인체인 잉어봄바이러스 (Spring viraemia of carp)를 민감하게 분자적으로 진단할 수 있는 조성물, 키트 및 검출방법을 제공함으로써, 병원체의 감염 여부를 간단·신속·정확하게 검출할 수 있는 효과가 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.
Claims (12)
- 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp: SVC)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 및/또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 또는 6의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp: SVC)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 및/또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출용 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 키트.
- 제7항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 또는 6의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 검체에서 추출된 핵산을 잉어봄바이러스(Spring viraemia of carp: SVC)의 기질 단백질 (Matrix protein) 코딩 유전자 또는 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 코딩 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 잉어봄바이러스 감염에 의한 잉어봄바이러스병 검출방법.
- 제9항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 제9항에 있어서, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가하는 것을 포함하는 검출방법.
- 제11항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 또는 6의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
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