CN110760525B

CN110760525B - 一种与油菜抗裂角性状相关的核苷酸序列及应用

Info

Publication number: CN110760525B
Application number: CN201911023460.5A
Authority: CN
Inventors: 刘佳; 胡琼; 周日金; 汪文祥; 李超; 梅德圣; 王会; 成洪涛
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN110760525A

Abstract

本发明涉及油菜育种领域，公开了一种与油菜抗裂角性状相关的核苷酸序列及应用。申请人通过甘蓝型油菜品系R1和R2杂交，生成DH分离群体，DH群体的基因型数据以及多年的抗裂角性状数据输入WinQTLcart2.5软件进行QTL定位，对该群体亲本进行了基因组重测序分许，挖掘目标区间内部的序列差异，发现有基因核苷酸序列产生了导致转录等活性较大变异，最终获得了与甘蓝型油菜抗裂角性相关的核苷酸序列，所述的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。针对这两个序列的差异设计引物，可用于油菜抗裂角的筛选。

Description

一种与油菜抗裂角性状相关的核苷酸序列及应用

技术领域

本发明涉及油菜育种领域，具体涉及一种与油菜抗裂角性状相关的核苷酸序列及应用。

背景技术

油菜是世界三大油料作物之一，也是我国第一大油料作物，我国油菜总产约占世界20％左右。油菜不仅能提供健康菜籽油，还能提供功能型菜薹、蜜用、饲用、肥用、休闲观光等多方位价值。我国油菜产量实现了三次飞跃，目前制约我国油菜产业进一步发展的是机械化程度不高，缺少适合于机械化收获的抗裂角油菜品种。

角果开裂对植物后代的繁殖和进化具有重要意义，但角果开裂却给作物种子收获的农业生产带来损失。在角果开裂这一性状上，植物进化和作物驯化是一个反向选择(Dong等，2015)。由于目前生产上利用的甘蓝型油菜品种在成熟时特别容易裂角，人工收获一般会造成大约10％的产量损失，机械化收割则损失更加严重。如遇到恶劣气候，产量损失可高达50％以上(Kadkol等，1984；Wang等，2007)。而且裂角散失的籽粒萌发形成自生苗，不但影响下茬作物的生长，同时也增加了施用除草剂去除再生苗的成本(等，2006)。目前生产上采取提前收获的方法避免裂角造成的产量损失和对下茬作物的不良影响，但该措施会造成油菜籽中叶绿素含量增加，油含量下降及品质降低。因此，努力提升栽培油菜品种角果裂角抗性是实现机械化生产，稳定收获产量和保证油菜籽品质的一项紧迫任务。

利用拟南芥中已克隆的与角果发育和开裂有关的基因，来抑制油菜角果开裂的工作取得了较好的进展(Mummenhoff等，2009)。Dinneny等(2005)和Ferrandiz等(2000)利用RNAi技术抑制油菜角果果瓣边缘SHP、IND和ALC基因表达，控制油菜角果开裂； aard等(2006)采用农杆菌介导法将35S：FUL基因转入黑芥(B.nigra)中，发现FUL基因在果瓣中异常表达，抑制了对果瓣边缘层的识别和发育，果瓣边缘层被当作果瓣细胞来发育，使角果不开裂。Salentijn等(2007)将拟南芥中的抗裂角基因导入油菜，得到了抗裂角的油菜种质。Braatz等(2017和2018)通过基因编辑和筛选突变体库，获得ALC，IND和FUL的抗性资源材料。

近年来，随着油菜分子生物学的迅速发展，许多控制油菜裂角的QTL已被定位，但对应抗裂角QTL位点下的关键基因及功能分子标记还没有利用的报道，针对上述问题，本发明提供了一种与油菜抗裂角性状相关的核苷酸序列，针对该序列设计引物可对油菜抗裂角性状进行高效筛选，加快油菜育种进程。

发明内容

本发明提供了一种与甘蓝型油菜抗裂角性相关的核苷酸序列，所述的序列为SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列差异性设计的引物组，所述的的引物组为：PF4-F:TATCCAGGATCCACACGGGA、PF4-R:ACCTGTAGCTGCGGAAAGTG、PF5-F:GTCACACTACGGGGCGTTTA和PF5-R:TTTGATCTGAGAGCATCATCCG。

本发明的最后一个目的在于提供了一种针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列差异性设计的引物组的应用，该引物组可用于甘蓝型油菜的育种，特别是抗裂角性状相关的筛选育种。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种与甘蓝型油菜抗裂角性相关的核苷酸序列的获得：

(1)利用甘蓝型油菜品系R1和R2杂交，杂种F1代通过小孢子培养生成DH分离群体。

(2)利用多态性引物对DH分离群体进行分子标记分析,获得基因型数据。

(3)把DH分离群体的基因型数据输入Joinmap4.0软件，进行遗传连锁图谱的构建；

(4)DH群体的基因型数据(仅限于定位到遗传图谱上的标记)以及多年的抗裂角性状数据输入WinQTLcart2.5软件进行QTL定位，其中，有一个QTL在DH群体多年中能重复检测到，而且效应值和贡献率稳定。

(5)对该群体亲本进行了基因组重测序分许，挖掘目标区间内部的序列差异，发现有基因核苷酸序列产生了导致转录等活性较大变异，因此针对目标基因核苷酸序列作进一步分析。

(6)将该基因(SEQ ID NO.2)和附近序列增强表达到抗裂角油菜亲本材料中，能导致油菜角果开裂程度提升，降低油菜的抗裂角性，而抑制或中断该基因的表达，会提升油菜的抗裂角性；甘蓝型油菜R1中与油菜抗裂角性状相关的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；甘蓝型油菜R2中与油菜抗裂角性状相关的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列差异性设计的引物组，所述的的引物组为：

PF4-F:TATCCAGGATCCACACGGGA、PF4-R:ACCTGTAGCTGCGGAAAGTG、PF5-F:GTCACACTACGGGGCGTTTA和PF5-R:TTTGATCTGAGAGCATCATCCG。

针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列差异性设计的引物组的应用，利用该引物组，对待测植株进行检测，若获得单一的700bp的条带，则认为是抗裂角品种；若获得单一的871bp的条带，则认为是裂角品种，因此，该引物组可用于甘蓝型油菜的育种，特别是抗裂角性状相关的筛选育种。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种与甘蓝型油菜抗裂角性相关的核苷酸序列，并利用135份油菜自然群体材料在2012和2013年两年自然环境中利用针对该序列设计的分子标记分型，结果显示油菜品系在纯合和杂合时，抗裂角指数有显著差异。在常规育种方法中，角果抗裂角性鉴定要等到成熟期收获后室内鉴定，费时费力且选择效率低下(抗裂角性会一定程度受到成熟期的影响)。通过基因功能标记检测角果抗裂角不同裂角基因变异，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中抗裂角功能基因差异明确，检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测抗裂角基因功能分子标记，即可预测育种材料的抗裂角性，进而准确快速筛选抗裂角油菜株系。

附图说明

图1目标基因核苷酸序列用PF4标记和自然群体中检测结果。

图2利用PF4和PF5标记识别的自然群体材料基因型和抗裂角系数两年表型做分组统计结果。

实施例1：

一种与油菜抗裂角性状相关的核苷酸序列的获得：

(1)利用油菜品系R1和R2杂交，杂种F1代通过小孢子培养生成DH分离群体。

实施例2：

分子标记引物的获得：

针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两个序列的差异性，设计了开发了两个显性标记PF4和PF5，分别对应检测R1和R2基因型的序列，PF4引物对包括1条正向引物PF4-F:TATCCAGGATCCACACGGGA和反向引物PF4-R:ACCTGTAGCTGCGGAAAGTG；PF5引物对包括1条正向引物PF5-F:GTCACACTACGGGGCGTTTA和反向引物PF5-R:TTTGATCTGAGAGCATCATCCG。

这两对引物特异分子标记可以分别在R1和R2中扩增出700bp和871bp的条带。PCR反应体系：引物各0.2uM，DNA模板1ul，2×Green Taq Mix(诺唯赞，P131)5ul，双蒸水补至10ul。PCR反应程序：95℃3min；95℃30s，60℃30s(每个循环依次降低1℃)，72℃1min，循环10次；95℃30s，50℃30s，72℃1min，循环25次；72℃5min。反应结束后，取5ul PCR产物跑琼脂糖胶检测。

实施例3：

针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列差异性设计的引物在油菜抗裂角育种中的应用：

本实施例共包括135份自然群体材料，其中包括R1和R2，这135份材料可以参考已发表的研究论文Liu,等.(2016)Multigenic control of pod shattering resistance in Chineseoilseed rape germplasm revealed by genome-wide association and linkage analyses.Front.Plant Sci.7(1058),1-14.

(1)田间种植油菜株系，在定苗前取样，用CTAB法抽提叶片总DNA,过程中所用到的试剂(提取液、氯仿、异戊醇、无水乙醇)如上所述；然后按照实施例2所述的引物和方法，对135份油菜品种(系)中进行了分型确认；

(2)根据基因型差异分型为R1，H(杂合)和R2三种类型(表1)，并在2012年和2013年两年种植这些材料鉴定这些材料的抗裂角指数(彭鹏飞，等.油菜抗裂角性鉴定方法的改进及试验.农业工程学报，2013，29(21):19-25.)，发现在2012年环境中，带有R1基因型的材料和R2基因型的油菜品系，抗裂角型有显著差异。在2013年环境中带有R1基因型的和杂合型的油菜品系与带有R2基因型的油菜品系，抗裂角性指数有极显著差异(图2)。

表1 135份材料标记基因型检测和2013年抗裂角系数

注：X，为未检测出基因型(指得是能扩增出条带，但不属于R1或R2的任一一个)；H，杂合基因型；NA，未检测出的表型。

综上所述，利用本发明提供的分子标记，鉴定获得抗裂角性超过R2的比例高达95％。该分子标记可用来预测油菜抗裂角性，可提高油菜抗裂角的选择效率，从而加快油菜裂角抗性育种进程。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>一种与油菜抗裂角性状相关的核苷酸序列及应用

<160> 6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211> 700

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400>1

tatccaggatccacacgggatcgttagtcttaccacttagacgatttccgtctgagtttg 60

ctttcggtgggtttaagagtttcaccaatgtttgccactgagcatcagagaaacctgtta 120

aaccctgtctgtcggcgtcggttaaggtgagattggcgccaatgccagttgttgatccaa 180

ttatctgagaagagtttgcacgtggagcagagttgtgtccagaagattgtgtatttgctt 240

gtccttcttgataattgttgcggtttcgaggtctcgttccccaccactccggaaacccaa 300

tcacacgaaaacatgaactagctcgatgtcctagcctgccacaactagtacatgtaacgt 360

ttgcgtctggatttggaggtcgtgggcggtagttgtcggtttgtcgagttgtcgaagaat 420

gtcgagagtgctccgagttgtgttgttgtgttggtgcttgagcagcaaaactcaacacgg 480

cgggagtctcagtttttgcattgagttgcacggtttcgttttgcactattgtctgatatg 540

ctgagtcgagatctggtagaggtatttgtgcacagatttgtgatcgtacggagctatgta 600

cttcatcaagaccaaacagaaaatcatgaacacgaatggtttcacgttcagtatcatgag 660

cgttgaccaaatcgcattcacactttccgcagctacaggt 700

<210>2

<211> 871

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400>2

gtcacactacggggcgtttaaagatttaaggaaagagattagctatctcgactctgcaat 60

tcttctttatttttatattttggtattgaaattttagtttatgttcttattattctttac 120

aaatatcagttgtcctatggtagtaaaataaggttcctacatcttactattacgaaaatt 180

gtgtttccgaacgtgtctaaaaagttaatactacatttaattttgctatcattaaaagat 240

tattcaagacgttcaaatcgattttgaccgctatgctcaaaaactttgaattatgagcga 300

tgtctagattctcaggatttaacatatatttcatatcagagtgactgcgaaccgagtccc 360

acgcaaaatagagaagacttaatgatcttcttcgtctggagttttcagtagagcatgtaa 420

ttacgggggtgcaagagtagatatctaagaagttagggcgaccaaatcaaagaaagaaaa 480

agataaaggatgataagtaaataacttgtaatgatcccctgaagcacagatagaacattt 540

gttgtcccctatctcccataaaggattcaggtactaggagaagttgataccagtttaaca 600

tgcacgtctcttttatcgcatatccatattttatcgcacctatatatctctatttgtata 660

tcctggccatctactctctcatgaatacttaaaattttcgtttcctactatttttgcaat 720

tttcctttatttatttacaaatattaattttagtttgatctatatatgtcccaagtttta 780

attatataataaatatgcatgtcactatgtcaaatatggctataaatcatcttcattttt 840

ttcatttttcggatgatgctctcagatcaa a 871

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

tatccaggatccacacggga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

acctgtagctgcggaaagtg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

gtcacactacggggcgttta 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

tttgatctgagagcatcatc cg 22

Claims

1.针对SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示序列差异性设计的引物组在甘蓝型油菜育种中的应用，其特征在于，

所述引物组为：PF4-F:TATCCAGGATCCACACGGGA、PF4-R:ACCTGTAGCTGCGGAAAGT

G、PF5-F:GTCACACTACGGGGCGTTTA和PF5-R:TTTGATCTGAGAGCATCATCCG；

所述应用具体为：在甘蓝型油菜抗裂角性状筛选和/或甘蓝型油菜抗裂基因型R1、R2、R1R2鉴定中的应用，具体应用方法如下：

对待测植株进行检测，若获得单一的700bp条带，则认为是抗裂角品种；若获得单一的871bp条带，则认为是裂角品种；

对待测植株进行检测，若获得单一的700bp条带，则认为是R1基因型；若获得单一的871bp条带，则认为是R2基因型；若同时获得700bp条带和871bp条带两条条带，则认为是R1R2基因型；

其中使用所述引物组进行PCR反应时的反应程序为：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，循环10次；95℃30s，50℃30s，72℃1min，循环25次；72℃5min。