CN110747288A - 水稻大粒基因功能标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水稻大粒基因功能标记及应用。功能标记选自GS2功能标记、GW2功能标记、GL3.1功能标记、GW2启动子标记中的一种或几种，其中，GS2功能标记为针对GS2基因第三外显子的TC/AA突变开发的dCaps标记；GW2功能标记为针对GW2基因第五外显子的核苷酸A缺失突变开发的dCaps标记；GL3.1功能标记为针对GL3.1基因第十外显子的单碱基C/A突变开发的dCaps标记；GW2启动子标记为针对GW2翻译起始位点上游858bp处T/A突变开发的dCaps标记。本发明针对水稻大粒基因关键变异位点，开发了有效的dCaps标记，可以有效鉴定大粒水稻种质，应用于水稻分子育种。

Description

水稻大粒基因功能标记及应用
技术领域
本发明涉及水稻育种，尤其涉及一种水稻大粒基因功能标记及其应用。
背景技术
水稻是重要粮食作物，其高产决定粮食生产安全及社会稳定。水稻产量主要由穗数、每穗粒数和千粒重决定。在不影响另外两个产量因素的前提下，增加千粒重可以快速提高水稻产量；此外，在杂交稻制种过程中，可以有目的的创制大粒型恢复系，而不育系则培育成小粒型，可实现两种株系混种混收，最终根据粒重再将大粒和小粒株系分开，可极大降低制种成本。因此，培育大粒型水稻品种具有极高生产应用前景。然而当前水稻育种仍然依赖于表型观察技术进行粒型筛选，虽然也可找到大粒品系，但需要种植的群体量较大，且只能在植株完全成熟后进行筛选，得到的大粒品系往往无法兼顾其它产量性状。分子标记辅助选择技术可以在植株秧苗期即开展基因型鉴定，寻找与大粒性状连锁的基因型，在插秧移栽时只需将包含目标基因型的植株群体种植即可，所得植株在成熟时几乎全部为大粒株系，此时只需兼顾穗数和每穗粒数性状即可获得综合性状平衡的高产株系。
开展大粒性状分子筛选的前提是寻找相关种质资源及挖掘其调控基因，目前水稻中已经成功克隆了三个大粒基因，分别为GS2、GW2和GL3.1，三个基因的基因号分别为Os02g0701300、Os02g0244100和Os03g0646900，其中GS2克隆自大粒品种“宝大粒”，GW2和GL3.1克隆自大粒品种“WY3”。如图1所示，GS2基因包含五个外显子，大粒品种第三外显子的TC突变成AA导致大粒表型产生；GW2基因包含8个外显子，大粒品种第五外显子的核苷酸A缺失导致大粒表型产生；GL3.1基因包含21个外显子，大粒品种第十外显子的单碱基C替换成A导致大粒表型产生。采用Sanger测序方法可以对上述关键变异进行直接鉴定，但测序成本较高，当前市场价一个测序反应为13元，三个位点鉴定费用约为39元。相比测序，基因PCR扩增和凝胶电泳技术的分子标记成本较低，但由于三个变异都属于碱基替换或单碱基缺失，PCR扩增产物凝胶电泳无法直接区分，同时三个变异没有产生酶切位点差异，无法利用PCR产物酶切方法进行鉴定，目前针对这三个关键变异尚无有效分子标记产生，极大地限制了水稻大粒性状的分子育种改良。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明提供了一种水稻大粒基因功能标记，为大粒基因GS2、GW2、GL3.1关键变异提供了有效的功能性分子标记。
技术方案：本发明所述的水稻大粒基因功能标记，选自GS2功能标记、GW2功能标记、GL3.1功能标记、GW2启动子标记中的一种或几种，其中，
所述的GS2功能标记为针对GS2基因第三外显子的TC/AA突变开发的dCaps标记；
所述的GW2功能标记为针对GW2基因第五外显子的核苷酸A缺失突变开发的dCaps标记；
所述的GL3.1功能标记为针对GL3.1基因第十外显子的单碱基C/A突变开发的dCaps标记；
所述的GW2启动子标记为针对GW2翻译起始位点上游858bp处T/A突变开发的dCaps标记。
其中，
所述的GS2功能标记的引物为：
正向引物：5’-AGCGCCACATGCACCGCGGCCGCATACGT-3’
反向引物：5’-TTGCCTGTTCCACCACCAACAGC-3’；
所述的GW2功能标记的引物为：
正向引物：5’-CACGATACTCCACAGCATAACTGGGAGTCT-3’
反向引物：5’-CTCACACTGCTCAGCCTACA-3’；
所述的GL3.1功能标记的引物为：
正向引物：5’-TGCACGATTCTATCTGGTTCAGTGGTCGA-3’
反向引物：5’-CTAAACAAACAGGTTTTCTTAC-3’；
所述的GW2启动子标记的引物为：
正向引物：5’-AAAACCAAAACCTAACACGTGGATACAACA-3’
反向引物：5’-GGCGGTGAAGATAGATGTACT-3’。
本发明还提供了所述的水稻大粒基因功能标记在辅助选择水稻粒型或粒重中的应用。其中，GS2功能标记、GW2功能标记、GL3.1功能标记可用于辅助选择水稻粒型，GW2启动子标记可用于辅助选择粒重。
本发明还提供了一种水稻选育方法，其特征在于，包括：在育种过程中采用所述的功能标记辅助选择水稻粒型的性状或粒重。
其中，水稻粒型为大粒。
有益效果：
针对水稻基因GS2、GW2、GL3.1的关键变异位点，本发明开发了有效的dCaps标记，可实现有效扩增、酶切，可以有效鉴定大粒水稻种质，应用于水稻分子育种。
利用本发明的分子标记，可以对粒型、粒重性状进行辅助选择，加快育种进程和目的性。
本发明开发的dCaps标记，引物特异性好，所选酶都是价格较低的常用内切酶，可极大降低鉴定成本，适用于大量群体基因型分析。
附图说明
图1为三个大粒基因结构及关键变异示意图；
图2为GS2基因关键变异功能型分子标记设计示意图；
图3为GL3.1基因关键变异功能型分子标记设计示意图；
图4为GW2基因关键变异功能型分子标记设计示意图；
图5为八个标记验证品种粒型示意图；
图6为GS2标记凝胶电泳图；
图7为GL3.1标记凝胶电泳图；
图8为GW2标记凝胶电泳图；
图9为GW2启动子SNP标记设计示意图；
图10为GW2启动子标记凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
一、功能标记开发
GS2、GW2和GL3.1三个基因的基因号分别为Os02g0701300、Os02g0244100和Os03g0646900，其中GS2基因第三外显子的TC突变成AA导致大粒表型产生；GW2基因第五外显子的核苷酸A缺失导致大粒表型产生；GL3.1基因第十外显子的单碱基C替换成A导致大粒表型产生。
首先我们从水稻日本晴参考基因组数据库分别下载了GS2、GW2、GL3.1三个基因的基因组DNA序列，为野生型序列，随后利用三个变异突变型分别替换对应位置的野生型变异，即GS2基因的TC替换成AA，GW2基因的A碱基删除，GL3.1基因的C替换成A，获得三种突变型序列。我们还同时对两个品种(WY3、宝大粒)中的三个基因的突变类型进行了Sanger测序明确，证实相关突变确实存在。我们首先对每个基因的突变型和野生型进行了酶切位点差异对比，发现三种突变类型都无法产生酶切位点差异，因此无法发展成基于PCR扩增后直接酶切的Caps标记。因此，我们采用了衍生的Caps标记设计方法，其正向引物直接位于突变位点左侧或右侧，通过在引物中引入1-2个碱基突变，与原有突变结合可以产生酶切位点差异。基于这一设计思想，我们利用dCapsFinder2.0工具辅助进行引物突变及酶切位点寻找，方法为分别将野生型及突变型变异及其两侧29-30bp，共计60bp序列复制到对应序列框中，引物突变数目设置为2，运行后获得一系列带突变碱基的引物序列。采用该方法，我们成功获得了GS2和GL3.1变异的正向扩增引物，其中GS2标记的正向扩增引物为AGCGCCACATGCACCGCGGCCGCATACGT，相比原有序列，该引物第25位碱基由A替换为T，第26位碱基由C替换为A，与突变型SNP的A碱基组合可形成一个SnaBI酶切位点TACGTA(图2)；GL3.1标记的正向扩增引物为TGCACGATTCTATCTGGTTCAGTGGTCGA，相比原有序列，该引物序列第25位碱基由C替换为G，第27位碱基分别由A替换为C，与野生型SNP的C碱基可形成一个SalI酶切位点GTCGAC(图3)。GW2基因属于碱基缺失突变类型，无法用dCapsFinder 2.0工具寻找合适突变及酶切位点，我们采用直接观察缺失碱基附近序列特征进行潜在酶切位点寻找，发现单碱基缺失处存在TGCAG序列特征，而PstI酶切位点的识别序列为CTGCAG，野生型变异对应的TTTTGCAG，而缺失单碱基后的序列特征为TTTGCAG，因此可将第二个T置换成C，则野生型序列变为TCTTGCAG，依然不存在酶切位点，突变型序列变为TCTGCAG，产生PstI突变位点，基于此设计直接选取左侧30bp序列作为正向引物，序列为CACGATACTCCACAGCATAACTGGGAGTCT(图4)。至此，我们成功获得三个引入特定酶切位点的正向引物，随后进行反向配对引物设计，设计方法为将正向引物及其下游300bp序列拷贝到PremierPrimer 5.0软件，正向引物范围仍为原来的30bp区间，反向引物设置在30bp区间范围之外，运行后得分最高一条引物作为反向引物，最终我们分别获得了GS2标记的反向引物序列TTGCCTGTTCCACCACCAACAGC、GL3.1标记的反向引物序列CTAAACAAACAGGTTTTCTTAC和GW2标记的反向引物序列CTCACACTGCTCAGCCTACA，与三条正向引物组成三对分子标记(图2、3、4)。根据引物位置及酶切位点信息，GS2标记扩增大小为286bp，酶切后大小约为258bp，突变型位点可被酶切；GL3.1标记扩增大小为225bp，酶切后大小约为197bp，野生型位点可被酶切；GW2标记扩增大小为其中159/158bp，酶切后大小约为126bp，突变型位点可被酶切。三个标记所使用的限制性内切酶价格相对较低，根据三种酶的市场价格，SnaBI酶鉴定一个反应的成本约为2.7元，SalI酶鉴定一个反应的成本约为0.5元，而PstI酶鉴定一个反应的成本约为0.16元，远远低于Sanger测序的价格，可极大降低鉴定成本，实现对大量种质及群体的分子鉴定。
二、功能标记的扩增酶切效果验证
为了验证(一)中三对标记的PCR扩增和酶切效果，我们挑选了八个品种进行了验证，分别为YYP1，日本晴(NIP)，珍汕97(ZS97)，稻花香(DHX)，Kasalath(Kasa)，WY3，宝大粒(BDL)和Katy，由图5可知WY3和宝大粒的粒型明显超过其它品种。苗期对8个不同水稻品种叶片取样，放入带钢珠的2ml离心管中，采用TPS小量抽提法提取DNA，具体步骤为：1、将叶片用球磨仪震荡破碎，加入500ulTPS缓冲液，65℃放置45分钟；2、12000转速离心10分钟，吸300ul上清液到新的离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置45分钟；3、12000转速离心10分钟，获得DNA沉淀，倒掉上清液，加入500ul 75％乙醇；4、7500转速离心5分钟，倒掉上清液并吸干残液，室温放置30分钟后加入100ul双蒸水获得DNA溶液。
随后以提取的DNA为模板分别对三对引物进行PCR扩增，反应体系为20ul包含DNA模板2ul、PCR buffer(北京鼎国生物)2ul、正向引物0.5ul、反向引物0.5ul、Taq聚合酶(北京鼎国生物)0.3ul及14.7ul双蒸水。PCR反应条件为：94℃变性3分钟，随后进行35个循环的“94℃变性20秒-55℃退火30秒-72℃延伸20秒”，最后72℃延伸5分钟完成反应。PCR扩增产物条带差异几乎无差异，需进一步对其酶切才可识别，酶切反应体系20ul，包括PCR产物10ul、内切酶(内切酶购自Thermo Scientific公司)0.5ul、对应buffer 2ul、双蒸水7.5ul，37摄氏度酶切1小时。
PCR及酶切完成后吸取10ul进行3％浓度的琼脂糖凝胶电泳，电泳20分钟后进行拍照，比较不同品种PCR带型差异，如图6、图7、图8所示，三个标记在八个品种中都能扩增出清晰条带，其中GS2标记在8个品种中有七个品种条带扩增大小为286bp，无法被酶切，对应野生型变异，只有宝大粒品种PCR产物可被酶切，条带大小约为258bp，对应突变型变异，与预期一致(图6)；GL3.1标记在8个品种中仅有WY3品种无法被酶切，条带大小为225bp，对应突变型，与预期一致，而其余七个品种都可被酶切，大小约为197bp，为野生型(图7)；GW2标记在8个品种中有七个品种条带扩增大小为159bp，无法被酶切，对应野生型，仅有WY3品种可被酶切，条带大小约为126bp，对应突变型(图8)。由此可知，三对标记能够有效并准确区分品种中的大粒变异类型，且三个标记的扩增效果非常好，条带清晰，有助于借助自动化图片分析***进行基因型统计。三、功能标记对水稻群体进行鉴定分析
我们利用上述(一)中三对功能标记采用与(二)相同扩增酶切方法对分布于世界各地的280份水稻品种进行了变异类型鉴定，其中包含六个亚种，分别为香稻(AROMATIC)、秋稻(AUS)、籼稻(IND)、温带粳稻(TEJ)、热带粳稻(TRJ)和混合类群(ADMIX，基因组构成包含不同亚种血缘)，对应品种数目分别为10、43、58、55、65和49。结果显示280份品种全部不包含三种大粒突变类型，说明这三种突变尚未广泛应用到水稻育种中，具有极高的育种利用价值，而本发明设计的三个标记可加速其在水稻大粒性状改良中的应用。
四、GW2启动子变异分子标记对水稻群体进行鉴定分析
已有研究显示GW2启动子变异也与粒重表型有关，上述280份品种中没有找到GW2编码区单碱基缺失型突变，我们推测其中可能包含促进粒重产生的启动子区变异，因此我们决定进一步设计GW2启动子区变异的分子标记。通过水稻多态性数据库网站(http://ricevarmap.ncpgr.cn/v2)，我们对GW2的2Kb启动子区序列变异进行了搜索，发现了大量的SNP变异，通过比较我们筛选了编号为vg0208114649的SNP进行标记设计，数据库显示该SNP在不同亚种中都表现为较为平衡的分布，可以有效用于不同亚种基因分型及粒型效应评估，其位于GW2翻译起始位点上游858bp处。该SNP为T到A的碱基替换，其侧翼序列为CCTAACACGTGGATACAAAA[T/A]GCAACCTGGACCCCACGTAA，为了便于引物设计，我们下载了GW2的启动子序列，并利用上述侧翼序列锁定SNP位置。标记设计方法为同上述三个功能标记类似，即在正向引物中引入突变位点与SNP结合产生酶切位点，并获得反向引物与之配对。首先我们获得了该标记的正向引物AAAACCAAAACCTAACACGTGGATACAACA，如图9所示，相比原始序列，该引物的第29个碱基由A替换成C，与SNP中的T碱基形成NspI酶切位点，该酶的识别序列为RCATGY，其中R代表A或G，Y代表C或T，反向引物为GGCGGTGAAGATAGATGTACT，该标记的PCR扩增大小为116bp，酶切后大小约为86bp，参考基因组品种日本晴对应SNP碱基T，可被酶切。我们利用该标记对YYP1，日本晴(NIP)，珍汕97(ZS97)，稻花香(DHX)，Kasalath(Kasa)，WY3，宝大粒(BDL)和Katy八个品种的DNA进行PCR扩增及酶切分析，结果显示该标记在八个品种中都可扩增出条带(图10)，但条带亮度比上述三个功能标记略弱，在八个品种中YYP1、Kasa和Katy三个品种PCR条带大小为116bp，无法被酶切，对应A突变类型，日本晴等剩余五个品种PCR条带大小约为86bp，可被酶切，对应T突变类型，因此该标记能够有效区分GW2启动子区858bp的T到A变异。
利用上述GW2启动子区鉴定标记，我们对280份世界各地品种进行了鉴定，结果显示包含T变异类型的品种为107个，包含A变异类型的品种数目为169个，4个品种为杂合类型，说明该标记也可用于杂交稻及分离群体基因型分析。该标记两种基因型在不同亚种中都有分布，其中ADMIX、IND和TRJ三个亚种每种基因型至少包含10个品种。
表1.GW2启动子标记鉴定280份品种基因型分布
Figure BDA0002273248550000071
进一步，我们对ADMIX、IND和TRJ三个亚种开展了基因型与粒型的相关性分析。粒型及粒重性状表现易受环境影响，因此我们在上海和海南两个完全不同的种植环境进行了性状测量，在植株完全成熟后对不同品种进行单株收种并晒干，随后采用万深SC-G自动种子考种分析及千粒重仪进行分析，自动获得粒长、粒宽、长宽比和千粒重数据，随后比较亚种内两种突变型的性状差异。具体方法为根据每个标记的两种基因型对表型数据进行分组，计算每组平均值并进行Student’sT-test差异检测，若P<0.05则认为该标记与对应粒型性状显著相关。在上海种植条件下，我们发现两种基因型对粒长、粒宽无显著影响，在TRJ亚种内T类型可增加长宽比，而在IND亚种内T类型可增加粒重，尽管在ADMIX和TRJ亚种内粒重差异没有达到显著水平，但其粒重变化趋势与IND亚种一致，证明T类型有增加多个亚种粒重的潜力；在海南种植条件下，IND亚种内的T类型变异可显著粒重，而在其它两个亚种中的效应不明显，说明该变异对粒重的调控受遗传背景和环境变化影响，利用该标记可以有效排除上述干扰，准确筛选目标基因型。
表2.上海种植条件下GW2启动子标记的粒型鉴定效果
Figure BDA0002273248550000072
Figure BDA0002273248550000081
表3.海南种植条件下GW2启动子标记的粒型鉴定效果
Figure BDA0002273248550000082
至此，我们成功获得了三个基因的功能型分子标记和一个粒重连锁分子标记，其中三个功能标记仅在大粒品种中存在，两个大粒品种可以作为供体与当前生产主栽品种杂交，并连续回交，利用本发明设计的分子标记可以准确筛选多个目标基因，从而快速改良大粒性状，而T类型的粒重连锁标记可主要用于改良A突变类型占大多数的籼稻和AUS稻品种，如本发明中所使用的YYP1、Kasalath和Katy品种，这些品种粒重较小，通过该标记改良可增加其产量潜力。

Claims (6)

1.一种水稻大粒基因功能标记，其特征在于，选自GS2功能标记、GW2功能标记、GL3.1功能标记、GW2启动子标记中的一种或几种，其中，
所述的GS2功能标记为针对GS2基因第三外显子的TC/AA突变开发的dCaps标记；
所述的GW2功能标记为针对GW2基因第五外显子的核苷酸A缺失突变开发的dCaps标记；
所述的GL3.1功能标记为针对GL3.1基因第十外显子的单碱基C/A突变开发的dCaps标记；
所述的GW2启动子标记为针对GW2翻译起始位点上游858bp处T/A突变开发的dCaps标记。
2.根据权利要求1所述的水稻大粒基因功能标记，其特征在于，
所述的GS2功能标记的引物为：
正向引物：5’-agcgccacatgcaccgcggccgcatacgt-3’
反向引物：5’-ttgcctgttccaccaccaacagc-3’；
所述的gw2功能标记的引物为：
正向引物：5’-cacgatactccacagcataactgggagtct-3’
反向引物：5’-ctcacactgctcagcctaca-3’；
所述的gl3.1功能标记的引物为：
正向引物：5’-tgcacgattctatctggttcagtggtcga-3’
反向引物：5’-ctaaacaaacaggttttcttac-3’；
所述的gw2启动子标记的引物为：
正向引物：5’-aaaaccaaaacctaacacgtggatacaaca-3’
反向引物：5’-ggcggtgaagatagatgtact-3’。
3.根据权利要求1或2所述的水稻大粒基因功能标记在辅助选择水稻粒型或粒重中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，水稻粒型为大粒。
5.一种水稻选育方法，其特征在于，包括：在育种过程中采用权利要求1或2所述的功能标记辅助选择水稻粒型的性状或粒重。
6.根据权利要求5所述的水稻选育方法，其特征在于，水稻粒型为大粒。
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