CN110755408B

CN110755408B - 一种可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110755408B
Application number: CN201910905573.1A
Authority: CN
Inventors: 任建安; 陈灿文; 吴秀文; 王革非; 顾国胜
Original assignee: Eastern Theater General Hospital of PLA
Current assignee: Eastern Theater General Hospital of PLA
Priority date: 2019-09-23
Filing date: 2019-09-24
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2039-09-24
Also published as: CN110755408A

Abstract

本发明公开了一种可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球及其制备方法和应用。该壳聚糖抗菌微球由壳聚糖凝胶微球，以及壳聚糖凝胶微球多孔支架中灌入的搭载碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钙凝胶组成。该壳聚糖抗菌微球具有良好的抗菌、缓释及创面修复功能，能够在制备促进创面愈合的试剂或敷料中应用。

Description

一种可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医用新材料领域，涉及一种可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球及其制备方法和应用。

背景技术

随着社会发展，各种急性创伤和各种慢性疾病的患病率逐渐增加，导致相关的创面损伤患者逐渐增多，且创面修复一直以来是临床工作的重难点。临床现有治疗方法主要包括三类：物理治疗，化学和生物治疗以及活性创面敷料的治疗。物理治疗方面，以典型的负压创面治疗为例，虽然该治疗能够增加创面的氧张力，加速肉芽组织的形成，减轻微循环障碍，改善血供等效果，但使用后仍存在并发症的发生，造成创面的损伤。化学和生物治疗方面主要是指生物酶类和生长因子的使用，但它们作用时生物活性及作用时间、效果等问题需进一步验证。活性创面敷料是指相对于传统纱布(干性敷料，也叫惰性敷料)而言，具有保湿与促修复作用的生物活性敷料(包括藻酸盐类敷料、水胶体敷料以及水凝胶敷料等)，使创面保持一个微湿的环境，以利于坏死组织溶解。然而这类新型敷料的功能单一，促进创面修复的效果有限。

一旦遭受创伤，由于皮肤屏障的破坏和生理环境的改变，创面首先会经历止血和炎症期，随着炎症反应的消退和组织修复细胞的逐渐增殖，创面出现以肉芽组织增生和表皮细胞增殖移行为主的病理生理过程。因此，对创面修复过程微环境的调控是促进愈合的一个有效手段。

壳聚糖是一种天然抗菌材料，具有十分优异的生物相容性，且在临床上已有应用，但其开发手段单一，大都是仅起到保护创面作用的抗菌敷料。另外，生长因子等生物活性分子的缓释一直都是促进创面修复研究的热点，因为它能够适应创面修复的微环境，从本源促进创面修复。但是由于其直接应用于体内存在免疫反应和易被降解等问题，限制了其在生物医学方面的应用。而微球型制剂能够显著延长药物作用时间，对于蛋白或多肽类药物能够起到很好的保护作用。因此，急需开发一种可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球。

本发明的另一目的是提供该可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球的制备方法。

本发明的又一目的是提供该可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球的应用。

一种可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球，所述的壳聚糖抗菌微球由壳聚糖凝胶微球，以及壳聚糖凝胶微球多孔支架中灌入的搭载碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钙凝胶组成。

所述的壳聚糖抗菌微球优选主要通过以下步骤制备得到：

(1)利用双乳液微流控装置，以18％～20wt％的二氧化硅粒子溶液为内相，350CS的硅油为外相制备微球，微球经过马弗炉800～1000℃高温灼烧获得二氧化硅粒子微球模板；

(2)将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制备1％～4％壳聚糖溶液；将所述的二氧化硅粒子微球模板浸泡在所述的壳聚糖溶液中4～8小时；随后通过滴加碱性溶液将浸泡的微球和壳聚糖溶液固化成凝胶，并将凝胶浸泡在水中，揉搓并通过氢氟酸溶液洗涤，去除二氧化硅粒子微球模板，得到壳聚糖多孔凝胶微球；

(3)海藻酸钠粉末溶解于纯水中制备0.1％～0.5％的海藻酸钠溶液，然后将碱性成纤维细胞生长因子溶解于海藻酸钠溶液中制备1～1.5μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠溶液，将所述的壳聚糖多孔凝胶微球浸泡在所述的碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠溶液中4～8小时，滴加1.5％～2wt％氯化钙溶液聚合凝胶；最后将凝胶块放在纯水中，通过凝胶的溶胀作用取出载有碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖微球即为可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球。

本发明所述的壳聚糖抗菌微球的制备方法，包含以下步骤：

作为本发明制备方法的优选，步骤(1)中在高温灼烧前用正己烷清洗微球。

作为本发明制备方法的优选，步骤(1)内相二氧化硅粒子的粒径为300nm-500nm，流速10ml/h；外相为350CS的硅油，流速为0.5ml/h；利用盛装500CS硅油的容器收集制备的微球。

作为本发明制备方法的优选，将上一步盛装在500CS硅油中的微球连同容器放入75℃恒温箱中过夜。

作为本发明制备方法的优选，步骤(1)中在高温灼烧前用正己烷清洗并浸泡微球2-4天。

作为本发明制备方法的优选，步骤(1)所述的微球放在马弗炉经过800～1000℃高温灼烧2～4h。

作为本发明制备方法的优选，步骤(2)将壳聚糖粉末溶于2％的醋酸溶液制备1％～4％的壳聚糖溶液；将所述的二氧化硅粒子微球模板浸泡在壳聚糖溶液中4～8小时；随后通过滴加10％～15％的氢氧化钠溶液将浸泡的微球和壳聚糖溶液固化成凝胶，并将凝胶浸泡在水中，通过凝胶的溶胀作用揉搓取出二氧化硅粒子微球模板；最后通过4％～10％的氢氟酸溶液洗涤微球去除二氧化硅粒子微球模板，得到壳聚糖多孔凝胶微球；

作为本发明制备方法的优选，步骤(2)所述的壳聚糖粉末乙酰化程度85％，分子量50000-190 000Da；制备的壳聚糖溶液中壳聚糖浓度为4％。

作为本发明制备方法的优选，步骤(3)所述的海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的体积比为5：1。

本发明所述的可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球在制备促进创面愈合的试剂或敷料中的应用。

有益效果：

本发明可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球作为一个有机的整体，各成分相互配合，协同起效，壳聚糖骨架的多孔结构充当细胞的3D支架，显著促进细胞的增殖迁移与分化，从而促进组织的再生；壳聚糖能通过质子化氨基表面所带的正电荷与细菌表面细胞膜所带的负电荷所结合，限制细菌对营养物质的摄取，从而杀死细菌。随着壳聚糖浓度的升高，质子化氨基的数目逐渐增多，与细菌结合的能力越强，抗菌的效果也逐渐增强，当壳聚糖浓度达到4％时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀伤力几乎是100％。随着凝胶的溶胀和降解，壳聚糖抗菌凝胶微球能够对碱性成纤维细胞生长因子起到很好的保护作用和缓释效果，随着海藻酸钠凝胶浓度的升高，缓释的时间越长。

附图说明

图1本发明壳聚糖抗菌微球制备示意图

图2各种微球结构及形貌的扫描电镜照片

a-b，二氧化硅模板微球表面及内部结构展示；c，模板灌入壳聚糖凝胶；d-e，壳聚糖凝胶多孔支架表面及内部结构展示；f，壳聚糖多孔支架灌入搭载碱性成纤维细胞生长的海藻酸钙凝胶。

图3抗菌实验结果图，a-c分别为2％，3％，4％不同浓度壳聚糖溶液制备的壳聚糖多孔凝胶支架对大肠杆菌的抗菌效果荧光染色图；d-f分别为2％，3％，4％不同浓度壳聚糖溶液制备的壳聚糖多孔凝胶支架对金黄色葡萄球菌的抗菌效果荧光染色图；g,h分别为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的空白对照组；i为a-f抗菌结果的统计。

图4缓释曲线图

图5大鼠创面恢复情况图，a为空白对照组，b为实验组。

图6大鼠创面组织HE染色肉芽再生情况图，a为对照组肉，b为实验组

图7对照组和实验组的血管新生情况，a为对照组，b为实验组

图8免疫荧光法测定肉芽组织中成纤维细胞的量，a为对照组，b为实验组

图9对照组和实验组的炎症水平，a为对照组，b为实验组

具体实施方式

实施例1

1.制备二氧化硅模板微球

1)通过简单的双乳液微流控装置制备二氧化硅模板微球。双乳液中，内相为浓度20％质量分数的二氧化硅粒子溶液，二氧化硅粒子粒径300nm-500nm，流速10ml/h；外相为350CS的硅油，流速为0.5ml/h，由于油水不相容的原理，外相油相会对二氧化硅粒子有一个剪切力，从而在微流控管道内形成微球，再利用盛装500CS硅油的容器收集。

2)将上一步盛装500CS硅油的容器放入75℃恒温箱中过夜，然后将硅油尽量倒净。用吸管吸取正己烷(分子量86.18g·mol^-1)纯溶液将容器底部的微球洗出到5ml称量瓶中。微球在装有正己烷溶液的称量瓶中浸泡3天，每天更换3次正己烷溶液洗净硅油。

3)将洗净的二氧化硅微球置于石英坩埚中(内径70mm)，放入马弗炉经高温800℃煅烧3小时，然后取出得二氧化硅粒子微球模(图2a-b)。

2.制备壳聚糖多孔凝胶微球

1)将壳聚糖(乙酰化程度85％，分子量50 000-190 000Da)粉末溶于2％乙酸(分子量60.05g·mol^-1)溶液中制备质量分数分别为1％、2％、3％、4％的壳聚糖溶液。将氢氧化钠(分子量39.996g·mol^-1)粉末溶于纯水制备10％氢氧化钠溶液。

2)将二氧化硅微球模板浸泡在壳聚糖溶液中6小时，随后滴加10％的氢氧化钠溶液固化壳聚糖。将壳聚糖凝胶取出，置于纯水中，通过凝胶的溶胀性能轻轻揉搓取出灌入壳聚糖凝胶的二氧化硅微球，称为复合壳聚糖凝胶微球(图2c)。

3)将复合壳聚糖凝胶微球浸泡在4％～10％浓度体积的氢氟酸(分子量20.0063g·mol^-1)溶液中，腐蚀二氧化硅，去除模板，得到壳聚糖多孔凝胶微球(图2d-e)。

2.包埋bFGF的壳聚糖多孔凝胶微球制备

1)将不同质量的海藻酸钠(粘度200±20mpa.s)粉末溶解于纯水中制备不同质量分数(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％)海藻酸钠溶液，然后将1μg的碱性成纤维细胞生长因子溶解于1ml海藻酸钠溶液中。将氯化钙(分子量111g·mol^-1)粉末溶解于纯水中制备氯化钙溶液(2.5％质量分数)。

2)将制备的壳聚糖多孔凝胶微球浸泡于海藻酸钠荧光溶液中6小时，然后滴加氯化钙溶液固化海藻酸钠(海藻酸钠与氯化钙体积比为5：1)。

3)将海藻酸钙凝胶取出，置于纯水中，通过凝胶的溶胀性能轻轻揉搓取出灌入包埋bFGF的海藻酸钙凝胶的壳聚糖多孔凝胶微球即为可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球(图2f)。

实施例2抗菌效果

(一)实验前准备

1.培养基的准备：配置液体琼脂培养基40～50ml(25g/L)，倒入50ml离心管中并置于高压灭菌锅中灭菌4～6小时.

2.细菌菌液的制备：将临床分离鉴定后取得的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌接种于培养基中，并于36～37℃震荡(200rpm)培养24小时，然后用灭菌生理盐水洗脱成混悬液(菌液浓度为1：1000)。

3.材料制备：实施例1制备的步骤2制备的壳聚糖多孔凝胶微球

(二)抗菌实验

1.将制备的壳聚糖凝胶微球与菌液接种于无菌24孔板内，每孔板内分别置入1mg不同浓度壳聚糖凝胶微球与200ul细菌悬液，每种壳聚糖凝胶微球设置3组平行对照，共有12组，37℃恒温暗室下共培养24小时。

2.每孔板取出20-30ul细菌悬液，使用移液枪滴加1ul活细胞核染料-绿菁SYTO，10～15分钟后滴加1ul碘化丙啶，立即于共聚焦仪器中观察染色情况。结果见图3。由图3可见：随着壳聚糖浓度的升高，抗菌能力逐渐增强，壳聚糖浓度为4％时，抗菌效果极佳。并且该壳聚糖多孔凝胶微球对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌常见致病菌都有极佳的抗菌作用

实施例3缓释药物：

将实施例1制备的可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球置于含有PBS的小皿中，每种微球设置3组平行对照，一共15组。每隔12小时通过荧光显微镜观察微球荧光强度，最后通过ImageJ软件分析数据，制成曲线，结果见图4。由图4可见可选的海藻酸钠溶液的浓度是0.4％～0.5％,最佳浓度为0.5％。

实施例4促创面修复：

(一)实验前准备

1.动物准备：准备12只200-250g的SD雄性大鼠。

2.材料准备：大鼠创面修复实验一共两组，每组四只，其中磷酸缓冲液为空白对照组，实施例1制备的含有生长因子的壳聚糖凝胶微球为实验组。

(二)动物实验

1.造模：大鼠经腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉(0.5ml/100g)，然后在大鼠背部减去直径为1cm的圆形皮肤全层，进行伤口造模。

2.创面保护：将准备好的凝胶微球经注射器喷涂于创面，覆盖整个创面。并分别在术后第0，3，5，7天记录创面恢复情况。结果见图5，由图5可见，凝胶微球处理组的创面愈合速率明显较对照组快，第7天时凝胶微球组创面几乎已经痊愈，而对照组创面几乎没有愈合趋势。

实施例5

1.动物与分组：雄性SD大鼠12只(由东部战区总医院比较医学科购入),体重200～250g,随机分为2组。实验组：实施例1制备的含有生长因子的壳聚糖凝胶微球，空白对照组:磷酸盐缓冲液。

2.手术方法：2.手术方法：动物术前禁食8h,腹腔内注射10％水合氯醛0.5ml/100g。麻醉成功后,建立创面缺损模型，具体如下：首先用剃毛刀去除老鼠背面毛发，然后用手术镊提拉小鼠背面皮肤，接着使用组织剪减去直径为1cm左右的圆形皮肤。实验组用本发明微球覆盖创面，空白对照组用磷酸缓冲液冲洗创面。外面贴上医用透明敷料保护，于7d取标本进行病理，免疫荧光等相关检测，结果见图6～图9。图6显示实验组肉芽最厚。图7显示了对照组和实验组的血管新生情况，由图可见本发明微球能促进血管新生。图8为免疫荧光法测定肉芽组织中成纤维细胞的量，结果显本发明微球形成肉芽肿成纤维细胞含量更高。图9显示了对照组和实验组的炎症水平(TNF-α)，由图可见本发明微球能消除炎症。

Claims

1.一种可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球，其特征在于，所述的壳聚糖抗菌微球由壳聚糖凝胶微球，以及壳聚糖凝胶微球多孔支架中灌入的搭载碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钙凝胶组成;

所述的壳聚糖抗菌微球主要通过以下步骤制备得到：

（1）利用双乳液微流控装置，以18%~20wt%的二氧化硅粒子溶液为内相， 350CS的硅油为外相制备微球，微球经过马弗炉800~1000℃高温灼烧获得二氧化硅粒子微球模板；

（2）将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制备1%~4%壳聚糖溶液；将所述的二氧化硅粒子微球模板浸泡在所述的壳聚糖溶液中4~8小时；随后通过滴加碱性溶液将浸泡的微球和壳聚糖溶液固化成凝胶，并将凝胶浸泡在水中，揉搓并通过氢氟酸溶液洗涤，去除二氧化硅粒子微球模板，得到壳聚糖多孔凝胶微球；

（3）海藻酸钠粉末溶解于纯水中制备0.1%~0.5%的海藻酸钠溶液，然后将碱性成纤维细胞生长因子溶解于海藻酸钠溶液中制备1~1.5μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠溶液，将所述的壳聚糖多孔凝胶微球浸泡在所述的碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠溶液中4~8小时，滴加1.5%~2wt%氯化钙溶液聚合凝胶；最后将凝胶块放在纯水中，通过凝胶的溶胀作用取出载有碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖微球即为可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球。

2.权利要求1所述的壳聚糖抗菌微球的制备方法，其特征在于，包含以下步骤（1）利用双乳液微流控装置，以18%~20wt%的二氧化硅粒子溶液为内相， 350CS的硅油为外相制备微球，微球经过马弗炉高温灼烧获得二氧化硅粒子微球模板；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中内相二氧化硅粒子的粒径为300nm-500nm，流速10ml/h；外相为350CS的硅油，流速为0.5ml/h；利用盛装500CS硅油的容器收集制备的微球。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中在高温灼烧前用正己烷清洗并浸泡微球2-4天，所述的微球放在马弗炉经过800~1000℃高温灼烧2~4h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）将壳聚糖粉末溶于2%的醋酸溶液制备1%~4%的壳聚糖溶液；将所述的二氧化硅粒子微球模板浸泡在壳聚糖溶液中4~8小时；随后通过滴加10%~15%的氢氧化钠溶液将浸泡的微球和壳聚糖溶液固化成凝胶，并将凝胶浸泡在水中，通过凝胶的溶胀作用揉搓取出二氧化硅粒子微球模板；最后通过4%~10%的氢氟酸溶液洗涤微球去除二氧化硅粒子微球模板，得到壳聚糖多孔凝胶微球。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的壳聚糖粉末乙酰化程度85%，分子量 50 000−190 000 Da；制备的壳聚糖溶液中壳聚糖浓度为4%。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的体积比为5：1。

8.权利要求1所述的可缓释生长因子的壳聚糖抗菌微球在制备促进创面愈合的试剂或敷料中的应用。