CN110740748A - 肿瘤微环境中功能障碍的抗原特异性cd8+t细胞 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于检测和/或靶向肿瘤微环境中功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞以用于诊断、治疗和/或研究应用的组合物和方法。具体地，功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞通过它们的本文所述的细胞表面受体(诸如4‑1BB、LAG‑3)的表达或与4‑1BB和LAG‑3表达相关的另外标志物(诸如在T细胞表面上差异表达的标志物)而被检测和/或靶向。

Description

肿瘤微环境中功能障碍的抗原特异性CD8+T细胞

相关申请的交叉引用

本发明要求2017年1月17日提交的美国临时专利申请序列号62/447,199的优先权，该美国临时专利申请的全文以引用方式并入。

政府支持声明

本发明根据美国国立卫生研究院颁发的第R01 CA161005号拨款在政府支持下进行。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本文提供了用于检测和/或靶向肿瘤微环境中功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞以用于诊断、治疗和/或研究应用的组合物和方法。具体地，功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞通过它们的本文所述的细胞表面受体(诸如4-1BB、LAG-3)的表达或与4-1BB和LAG-3表达相关的另外标志物(诸如在T细胞表面上差异表达的标志物)而被检测和/或靶向。

背景技术

免疫***在保护宿主免于癌症中起关键作用(Vesely等人，2011；该文献全文以引用方式并入)。肿瘤的先天感知通过呈递肿瘤相关抗原(TAA)而导致适应性T细胞应答，所述肿瘤相关抗原(TAA)源自促成癌变的突变和表观遗传改变(Gajewski等人，2013；该文献全文以引用方式并入)。自发致敏的CD8+ T细胞归巢于小鼠肿瘤模型中的肿瘤部位(Harlin等人，2009；Fuertes等人，2011；该文献全文以引用方式并入)和一部分晚期癌症患者中的肿瘤部位(Harlin等人，2006；该文献全文以引用方式并入)。这些肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)具有识别肿瘤抗原的能力，并且基于活化的CD8+ T细胞浸润与改善的预后和对免疫疗法的响应之间的相关性，而被认为有助于癌症患者的肿瘤控制(Fridman等人，2012；Tumeh等人，2014；这些文献全文以引用方式并入本文)。然而，在没有额外操纵的情况下，该内源性抗肿瘤响应通常不足以介导对已建立肿瘤的完全排斥(Gajewski，2007b；Pardoll，2012；Baitsch等人，2011；Gajewski等人，2006；Larkin等人，2015)。过去几年积累的数据表明，具有自发抗肿瘤T细胞应答的肿瘤具有破坏应答的效应阶段的免疫抑制途径的高度表达。这些免疫抑制途径包括PD-L1/PD-1相互作用(Pardoll，2012；该文献全文以引用方式并入)、CD4+Foxp3+调节性T(Treg)细胞的募集(Gajewski，2007a；该文献全文以引用方式并入)，以及通过吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)使代谢调节异常(Spranger等人，2013；该文献全文以引用方式并入)。然而，即使当远离这些外在免疫抑制因子从肿瘤中分离出肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞时，它们仍然在体外显示出改变的功能特性(Harlin等人，2006；Baitsch等人，2011；这些文献全文以引用方式并入)。

PD-1的表达已经被描述为用以鉴定肿瘤特异性耗竭的T细胞(Ahmadzadeh等人，2009；Fourcade等人，2012；Wu等人，2014；Gros等人，2014；这些文献全文以引用方式并入)。然而，在慢性感染的情况下表达PD-1的T细胞仍然可以保留效应功能(Wherry和Kurachi，2015；该文献全文以引用方式并入)，并且PD-1不是诱导T细胞耗竭所必需的(Odorizzi等人，2015；该文献全文以引用方式并入)。除PD-1外，还有一些其他共抑制受体，包括CD223(LAG-3)、CD244(2B4)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、甲型肝炎病毒细胞受体2(TIM-3)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)也在功能障碍的T细胞上表达，并且较多数量的抑制性受体的表达与细胞因子(特别是IFN-g和TNF-a)分泌和增殖能力减少有关(Blackburn等人，2009；该文献全文以引用方式并入)。已经在病毒和癌症模型中观察到这些受体的表达，然而，缺乏在肿瘤情形中对相同群体上的共抑制和共刺激受体的完整分析。

发明内容

本文提供了用于检测和/或靶向肿瘤微环境中功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞以用于诊断、治疗和/或研究应用的组合物和方法。具体地，功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞通过它们的本文所述的细胞表面受体(诸如4-1BB、LAG-3)的表达或与4-1BB和LAG-3表达相关的另外标志物(诸如在T细胞表面上差异表达的标志物(例如，PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205，以及TMEM126A，CRTAM和Sema7a))而被检测和/或靶向。

在一些实施方案中，本文提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用特异性靶向功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞的剂。在一些实施方案中，受试者患有实体肿瘤癌症。在一些实施方案中，肿瘤允许T细胞浸润，但对免疫疗法具有抗性。在一些实施方案中，肿瘤环境包含功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞。在一些实施方案中，使功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞与抗4-1BB和/或抗LAG3剂接触。在一些实施方案中，抗4-1BB和/或抗LAG3剂是抗体、抗体片段，或抗体模拟分子。在一些实施方案中，方法还包括共施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是化学治疗剂或免疫治疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是选自由以下项组成的列表的免疫治疗剂：基于细胞的疗法、单克隆抗体(mAb)疗法、细胞因子疗法以及辅助治疗。在一些实施方案中，免疫治疗剂是选自由以下项组成的列表的mAb疗法：抗CTLA-4单克隆抗体和/或抗PD-L1单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫治疗剂是选自由以下项组成的列表的基于细胞的疗法：树突细胞疗法和T细胞疗法。在一些实施方案中，另外的治疗剂靶向表2中列出的标志物/受体中的一种。在一些实施方案中，另外的治疗剂靶向在T细胞表面上表达的标志物/受体。在一些实施方案中，另外的治疗剂靶向PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205和TMEM126A、CRTAM或Sema7a。在一些实施方案中，另外的治疗剂靶向Nrn1、Sema7a或CRTAM。

在一些实施方案中，本文提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用特异性靶向功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞的治疗剂，其中所述剂靶向表2中列出的受体中的一种受体。在一些实施方案中，治疗剂靶向在T细胞表面上表达的标志物/受体。在一些实施方案中，治疗剂靶向PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205和TMEM126A、CRTAM或Sema7a。在一些实施方案中，治疗剂靶向Nrn1、Sema7a或CRTAM。在一些实施方案中，治疗剂是结合靶标志物/受体的抗体、抗体片段或抗体模拟分子。在一些实施方案中，治疗剂是抗Nrn的抗体、抗体片段或抗体模拟分子。在一些实施方案中，治疗剂是抗Sema7a抗体、抗体片段或抗体模拟分子。在一些实施方案中，治疗剂是抗CRTAM的抗体、抗体片段或抗体模拟分子。

在一些实施方案中，本文提供的组合物包含：(a)抗4-1BB剂、抗LAG-3剂、抗Nrn1剂、抗Sema7a剂和抗CRTAM剂中的一种或多种；以及(b)免疫治疗剂，所述组合物被配制成用于向受试者治疗递送。在一些实施方案中，抗-4-1BB剂，抗LAG-3剂，抗-Nrn1剂，抗Sema7a剂和/或抗CRTAM剂是抗体，抗体片段或抗体模拟分子。

在一些实施方案中，本文提供的组合物包含：(a)靶向和/或结合PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205和TMEM126A中的一种的剂；和(b)免疫治疗剂，所述组合物经被配制成用于向受试者治疗递送。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括：(a)测试来自细胞群体的CD8⁺ T细胞以确定CD8+ T细胞是否共表达LAG-3和4-1BB；和(b)施用靶向和/或结合PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205和TMEM126A中的一种的一种或多种剂。在一些实施方案中，所述剂是抗Nrn1剂，抗Sema7a剂和抗CRTAM剂。在一些实施方案中，抗Nrn1剂、抗Sema7a剂和/或抗CRTAM剂是抗体、抗体片段或抗体模拟分子。在一些实施方案中，体外执行测试。

在一些实施方案中，本文提供了通过测试功能障碍的T细胞共表达4-1BB和LAG-3来鉴定所述细胞的方法。在一些实施方案中，本文提供通过测试功能障碍的T细胞表达表2中的标志物/受体(例如，T细胞表面标志物/受体(例如，PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205、TMEM126A))中的一种或多种来鉴定所述细胞的方法。

附图说明

图1A至图1J.4-1BB和LAG-3的共表达鉴定了在进展中的肿瘤中存在很大一部分的CD8⁺ TIL隔室。(A)对来自肿瘤皮下接种后第7天、第14天和第21天的荷瘤小鼠的B16.SIY肿瘤、脾和TdLN的CD8⁺ T细胞上4-1BB和LAG-3表达的代表性分析。(B-D)组合物的纵向总结，n＝5；每个时间点进行四至五次独立实验，(C)绝对细胞数，n＝5；每个时间点进行七至九次独立实验，以及(D)CD8⁺ 4-1BB/LAG-3TIL亚群的细胞密度，n＝5；每个时间点进行两至五次独立实验。通过用流式细胞术获得完整的肿瘤样品来确定绝对细胞数。(E)第14天对CD8⁺4-1BB/LAG-3TIL亚群为Ki67⁺的比例的总结。n＝3-5；两次独立实验。(F)对24小时BrdU脉冲后CD8⁺ 4-1BB/LAG-3TIL亚群中第13天的BrdU摄取的总结。n＝5；三次独立实验。(G-I)其他肿瘤模型中4-1BB/LAG-3群体的代表性流式图(G和H)和总结(I)。将小鼠用2×10⁶的C1498.SIY、MC38.SIY、EL4.SIY、B16亲本、MC57.SIY或1969.SIY皮下接种，并在肿瘤接种后第14天分析4-1BB和LAG-3表达。n＝3-5；每个时间点进行2至5次独立实验。(J)将小鼠用2×10⁶的MC57.SIY或B16.SIY在两侧腹上接种，在指定的时间点合并来自每只小鼠的肿瘤并分析CD8⁺ TIL隔室中4-1BB和LAG-3的共表达，n＝3-5；每个时间点进行两次独立实验。所有的误差条指示±SEM。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。使用双因素方差分析和Bonferroni事后检验来进行(B、C、D、H)纵向研究，并使用Kruskal-Wallis(非参数)检验来进行一个时间点处的(E和F)分析。

图2A至图2G.Egr2和Egr2转录网络的组分在4-1BB⁺LAG-3⁺CD8⁺ TIL中富集。(A)Egr2^EGFP表达的代表性流式图和总结。将Egr2^EGFP小鼠皮下接种2×10⁶的B16.SIY肿瘤。在第7天和第14天分析来自肿瘤、TdLN和脾的CD8⁺ T细胞的Egr2^EGFP表达。n＝4-5；两次独立实验。(B)Egr2靶基因的表达(Zheng等人，2013)。将来自第14天荷瘤小鼠的CD8⁺ TIL基于Egr2^EGFP的高或低表达对进行分选，并通过qRT-PCR直接分析Egr2靶标的表达。合并每只小鼠的相对侧腹上的两个肿瘤。n＝3；两次独立实验。(C)在第7天和第14天对CD8⁺Egr2GFP^高和Egr2GFP^低TIL中4-1BB/LAG-3亚群的代表性流式图和总结。n＝4-5。每个时间点进行两次独立实验。(D)4-1BB⁺LAG-3⁺和4-1BB^–LAG-3^–亚群中Egr2靶标的表达。将亚群分选并通过qRT-PCR直接分析靶表达。合并每只小鼠的相对侧腹上的两个肿瘤。n＝4；两次独立实验。(E)将Egr2^{flox /flox} x pLCKCreERT2 x YFP-Rosa26小鼠通过灌胃给予5剂量的它莫西芬，并在3天后接种2×10⁶个B16.SIY细胞。将YFP⁺或YFP^–CD8⁺ TIL分选，并直接和在体外刺激后进行Egr2转录物分析。合并每只小鼠的相对侧腹上的两个肿瘤。n＝3；两次独立实验。(F)在第7天和第14天YFP⁺或YFP^–CD8⁺ TIL中的4-1BB/LAG-3共表达的代表性流式图和总结。n＝3；两次独立实验。(G)在来自第7天从Egr2GFP小鼠分离的CD8⁺ TIL的Egr2GFP^高和Egr2GFP^低中Egr3和Hif1α的表达。n＝5；两次独立实验。误差条指示±SEM。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。使用双因素方差分析和Bonferroni事后检验进行纵向研究(A和C)，并使用Mann-Whitney检验计算(B、D、E、F和G)的显著性。

图3A至图3H.4-1BB和LAG-3的共表达鉴定进展中肿瘤中的肿瘤抗原特异性TIL。(A)来自不同4-1BB/LAG-3亚群和从脾分离出的CD8⁺ T细胞的代表性CDR3β分布。加框区域代表4-1BB⁺LAG-3⁺CD8⁺ TIL亚群中的优势峰。(B)作为偏斜的度量，计算在同一小鼠内的每个TIL亚群与CD8⁺ T细胞脾群体之间的每个Vβ谱型的汉明距离(Hamming Distance,HD)。作为对照，计算小鼠之间来自CD8⁺脾细胞群体的HD(灰色条)。n＝3；一次独立实验。(C-D)在B16.SIY和MC38.SIY或(D)MC57.SIY和1969.SIY肿瘤接种后第14天对H-2K^b/SIY⁺和H-2K^b/SIY^–CD8⁺ TIL中4-1BB/LAG-3亚群的代表性流式分析。n＝3-4；三至五次独立实验。(E)在肿瘤接种后第14天对共表达4-1BB和LAG-3的H-2K^b/SIY⁺和H-2K^b/SIY^–CD8⁺ TIL的组成进行总结，从而比较B16.SIY、MC38.SIY、MC57.SIY和1969.SIY肿瘤。n＝5；三至四次独立实验。(F-H)在肿瘤接种后第7天，将1×10⁶个P14/CD45.2和2C/CD45.1/2Tg T细胞通过尾静脉过继转移到荷有CD45.1同系肿瘤的宿主中，并分析(F)肿瘤中回收细胞的总数、(G和H)2C、P14和宿主CD8⁺ TIL中4-1BB和LAG-3表达的分布。n＝5；两次独立实验。所有的误差条指示±SEM。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。使用Kruskal-Wallis(非参数)检验来进行(B)谱型分析和(E和F)H-2K^b/SIY分析。使用双因素方差分析和Bonferroni事后检验进行(H)2C、宿主和P14组成分析。

图4A至图4G.4-1BB和LAG-3但不是PD-1的共表达定义功能障碍的CD8⁺ TIL，具有减少的IL-2。(A和B)将从第14天B16.SIY荷瘤小鼠分选的细胞用抗CD3ε和抗CD28进行体外刺激12小时，并(A)通过qRT-PCR分析Il-2转录物和(B)通过ELISA分析IL-2蛋白。合并每只小鼠的相对侧腹上的两个肿瘤。n＝4-5；三次独立实验。(C)从第14天荷有B16.SIY肿瘤的Egr2^GFP小鼠中分选Egr2GFP^高和Egr2GFP^低TIL，并且体外刺激12小时，并通过qRT-PCR分析Il-2转录物。合并每只小鼠的相对侧腹上的两个肿瘤。n＝5；两次独立实验。(D)在肿瘤接种后第7天将1×10⁶个2C/CD45.1/2Tg T细胞转移到小鼠中，7天后对从肿瘤分选的宿主4-1BB⁺LAG-3⁺ T细胞和从肿瘤或TdLN分选的2C T细胞进行体外刺激，并通过qRT-PCR分析Il-2转录物的表达。合并每只小鼠的相对侧腹上的两个肿瘤。n＝3；两次独立实验。(E和F)对4-1BB/LAG-3 CD8⁺ TIL亚群上的PD-1表达的代表性流式分析，以及(F)对第14天和第21天在CD8⁺ TIL隔室中的4-1BB^–LAG-3^–PD-1⁺亚群的组成的总结。n＝5；三次独立实验。(G)从第14天荷瘤小鼠中分选4-1BB^–LAG-3^–PD-1⁺和LAG-3⁺4-1BB⁺ CD8⁺ TIL，进行体外刺激，并通过qRT-PCR分析Il-2转录物。合并每只小鼠的相对侧腹上的两个肿瘤。n＝3；两次独立实验。所有的误差条指示±SEM。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001****：P<0.0001。使用Kruskal-Wallis(非参数)检验进行多重比较分析(A、B和D)，并且使用Mann-Whitney检验进行成对比较(C和G)。

图5A至图5E.功能障碍的CD8⁺ TIL保持IFN-γ产生、细胞溶解能力并产生Treg募集趋化因子。(A)纵向分析CD8⁺ TIL亚群的细胞因子产生能力。分选出CD8⁺ TIL亚群，并用抗CD3ε和抗CD28刺激10-12小时，并测量IL-2、IFN-γ和TNF-α的浓度。将浓度归一化为细胞数。在第7天和第14天合并相对侧腹上的两个肿瘤。n＝4-5；两次独立实验。(B)直接离体分析4-1BB/LAG-3亚群中的Ifn-γTnf-α和Gzmb转录物水平。合并每只小鼠的相对侧腹上的两个肿瘤。n＝3-5；三次独立实验。(C)直接离体分析的IFN-γ产生的代表性流式图和总结。简言之，在肿瘤接种后第14天，在肿瘤内注射100μl含有2mg/mL GolgiPlug的PBS。8小时后，分离出TIL。所有步骤均用含有1mg/mL的GolgiStop的培养基在冰上执行，直至固定。n＝5；两次独立实验。(D)将指定时间点的CD8⁺ TIL亚群进行分选，并与50,000个P815靶细胞和1μg/mL抗CD3ε一起铺板。通过碘化丙锭和/或活/死可固定的活力染料的阳性染色来测量裂解的靶细胞。将在没有CTL的情况下铺板的P815靶细胞用作阴性对照(黑色条)。将致敏的OTI细胞用作阳性对照。将来自在相对侧腹上具有2个肿瘤的10只小鼠的肿瘤合并，以获得足够量的CD8⁺ TIL。数据代表3次独立实验。(E)通过qRT-PCR直接离体分析的4-1BB/LAG-3亚群中的Ccl1和Ccl22转录物水平。n＝4；两次独立实验。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001。使用Kruskal-Wallis(非参数)测试进行(A-C、E)细胞因子/趋化因子分析，并使用双因素方差分析和Bonferroni事后检验来进行(D)细胞溶解测定。

图6A至图6D.功能障碍的CD8⁺ TIL表达广泛的共抑制和共刺激受体。(B)4-1BB/LAG-3 CD8⁺ TIL亚群中的细胞表面受体的基因表达谱。显示了这样的探针组，所述探针组揭示4-1BB⁺LAG-3⁺群体中相对于4-1BB^–LAG-3^–PD-1^–群体的1.5倍增长。列显示经log₂转换的信号强度。(C)对所选上调的细胞表面受体的纵向研究。流式图表示第14天的CD8⁺ TIL子集。n＝5；每个时间点进行两至五次独立实验。(D)肿瘤接种后第14天4-1BB/LAG-3亚群中KLRG-1和IL-7Rα表达的代表性流式图和总结。n＝5；两次独立实验。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001。将双因素方差分析和Bonferroni事后检验用于所有分析。

图7A至图7G.抗4-1BB和抗LAG-3协同作用以控制肿瘤生长并恢复TIL功能。(A)以mm²测量的肿瘤生长。箭头指示小鼠在哪些天接受抗体治疗。将指示时间点的统计学显著性与抗4-1BB+抗LAG-3治疗进行比较。n＝5；两次独立实验。(B)在第14天H-2K^b/SIY⁺CD8⁺ TIL的组成。小鼠在第7天、第10天、第13天和第16天接受抗体剂量(每次100μg)。n＝5；两次独立实验。(C-F)在肿瘤接种后第14天在没有FTY720(C和D)和具有FTY720(E和F)的情况下H-2K^b/SIY⁺ CD8⁺ TIL中的NRP1/2B4(C和E)和KLRG-1/IL-7Rα(D和F)表达的代表性流式图和总结。小鼠接受如(A和B)中的抗体治疗，并且在治疗前一天开始通过灌胃以25μg/小鼠的剂量施用FTY720，并且每天继续一个剂量直至分析(第6天至第13天)。n＝5；两次独立实验。(G)治疗后的IL-2产生。对从治疗或未治疗的第14天B16.SIY荷瘤小鼠分选出的细胞进行体外刺激12小时，并通过qRT-PCR分析Il-2转录物。通过基于珠粒的LEGENDplex免疫测定法测定蛋白质浓度，并将所述蛋白质浓度归一化为细胞数。合并每只小鼠的相对侧腹上的两个肿瘤。n＝2-3；两次独立实验。将双因素方差分析和Bonferroni事后检验用于所有分析。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

图8.用于图3B中的分析的光谱型图。

图9.施用FTY720后第14天的CD3+ T细胞。

图10A至10B.基因表达谱的交叉研究比较的统计分析。(A)每次成对比较的等级间超几何图。(B)每个数据集之间的表达值的成对相关性。Rho(ρ)是斯皮尔曼等级相关系数。

图11A至11E。Nrn1，CRTAM和Sema7a是抗肿瘤免疫的调节剂。(A)以mm2测量的肿瘤生长。对Nrn1^–/–或Sema7a^–/–和同窝对照小鼠皮下植入2×106个B16.SIY细胞。(B)对脾、TdLN和肿瘤的T细胞亚群中的Nrn1的基因表达分析。(C)第7天WT、Nrn1^–/–或(D)CRTAM^–/–2C T细胞的IFN-g产生的代表性流式图和总结。简而言之，在肿瘤接种的同一天，通过尾静脉注射将1×10⁶个Cell Trace Violet标记的2C T细胞转移至小鼠中。在第7天，用SIY肽重新刺激整个TdLN悬浮液12小时，并分析细胞痕量稀释和IFN-g产量。(E)接受1×10⁶个Nrn1^–/– 2C T细胞的小鼠与接受相同数量的WT 2C T细胞的小鼠相比，更可能表现出完全的肿瘤控制。以与(C)中相同的方式执行T细胞的过继转移。

图12.示例性实验方案和数据。

定义

尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用于本文描述的实施方案的实践或测试，但本文描述了一些优选的方法、组合物、装置和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，应理解本发明不限于本文所述的特定分子、组合物、方法或方案，因为这些可根据常规实验和优化而变化。还应当理解，在描述中使用的术语仅用于描述特定版本或实施方案的目的，并不意欲限制本文描述的实施方案的范围。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。然而，在发生冲突的情况下，以本说明书(包括其中定义)为准。因此，在本文描述的实施方案的上下文中，以下定义适用。

如本文中和所附权利要求书中使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括多个指代物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种抗体”是提及一种或多种抗体及本领域中技术人员已知的其等同物，等等。

如本文所用，术语“包括”及其语言变型表示存在所述一种或多种特征、一种或多种元素、一种或多种方法步骤等，但不排除存在附加一种或多种特征、一种或多种元素、一种或多种方法步骤等。相反地，术语“由......组成”及其语言变型表示存在所述一种或多种特征、一种或多种元素、一种或多种方法步骤等，并且排除了除了通常相关的杂质之外的任何未叙述的一种或多种特征、一种或多种元素、一种或多种方法步骤等。短语“基本上由......组成”表示所述的一种或多种特征、一种或多种元素、一种或多种方法步骤等，以及任何附加的一种或多种特征、一种或多种元素、一种或多种方法步骤等，所述任何附加的特征、元素、方法步骤等不会实质影响组合物、***或方法的基本性质。本文的许多实施方案使用开放的“包含”语言来描述。此类实施方案包括多个封闭的“由......组成”和/或“基本上由......组成”实施方案，其可替代地使用这种语言来要求保护或描述。

如本文所用，术语“受试者”广泛地指任何动物，包括但不限于人和非人动物(例如，狗、猫、牛、马、绵羊、家禽、鱼、甲壳类动物等)。如本文所用，术语“患者”通常是指正在针对疾病或病症(例如，癌症、实体肿瘤癌症等)进行治疗的受试者。

如本文所用，“免疫应答”是指免疫***的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞等)和由这些细胞或肝脏中的任一者产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致从受试者中选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除入侵病原体、被病原体感染的细胞或组织、或癌症细胞或其他异常细胞。

如本文所用，术语“免疫调节剂”是指调节免疫应答的物质、剂、信号传导途径或它们的组分。“调节”、“修饰”或“调控”免疫应答是指免疫***的细胞或此类细胞的活性的任何改变。这种调节包括刺激或抑制免疫***，所述调节可以通过各种细胞类型的数量的增加或减少、这些细胞的活性增强或减弱，或免疫***内可能发生的任何其他变化来表现。已经鉴定了抑制性和刺激性免疫调节剂，所述抑制性和刺激性免疫调节剂中一些可能在癌症微环境中具有增强的功能。

如本文所用，术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法来治疗或预防疾病或病症。

如本文所用，“增强内源性免疫应答”意指增加受试者中现有免疫应答的有效性或效力。例如通过克服抑制内源性宿主免疫应答的机制或通过刺激增强内源性宿主免疫应答的机制，可以实现有效性和效力的这种增加。

如本文所用，术语“抗体”是指完整抗体分子或其片段(例如，片段，诸如Fab、Fab'和F(ab')₂)，除非另外指明(例如，“完整抗体”、“抗体片段”)。抗体可以是多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等。

天然抗体通常具有四聚体结构。四聚体通常包含两对相同的多肽链，每对多肽链具有一条轻链(在某些实施方案中，约25kDa)和一条重链(在某些实施方案中，约50-70kDa)。在天然抗体中，重链包含可变区V_H，以及三个恒定区C_H1、C_H2和C_H3。V_H结构域位于重链的氨基末端，而C_H3结构域位于羧基末端。在天然抗体中，轻链包含可变区V_L，以及恒定区C_L。轻链的可变区位于轻链的氨基末端。在天然抗体中，每个轻/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。恒定区通常负责效应功能。

在天然抗体中，可变区通常表现出相同的一般结构，其中相对保守的骨架区(FR)通过三个高变区接合，该三个高变区也称为互补决定区(CDR)。每对的两条链的CDR通常通过骨架区对齐，该骨架区可允许与特定表位结合。从N末端至C末端，轻链和重链可变区二者通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。因此，重链上的CDR称为H1、H2和H3，而轻链上的CDR称为L1、L2和L3。通常，CDR3为抗原结合位点内分子多样性的最大来源。例如，在某些情况下，H3可短到两个氨基酸残基或超过26个氨基酸残基。氨基酸到每个结构域的分配通常符合Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(美国国立卫生研究院，公开号91-3242，第1-3卷，Bethesda,Md.)；Chothia,C.和Lesk,A.M.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；或者Chothia,C.等人，Nature 342:878-883(1989)的定义。在本申请中，除非另有说明，否则术语“CDR”是指来自轻链或重链的CDR。

如本文所用，术语“重链”是指这样的多肽，所述多肽包含足够的重链可变区序列，以单独或与轻链组合赋予抗原特异性。

如本文所用，术语“轻链”是指这样的多肽，所述多肽包含足够的轻链可变区序列，以单独或与重链组合赋予抗原特异性。

如本文所用，当抗体或其他实体“特异性识别”或“特异性结合”抗原或表位时，其优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的抗原，并以亲和力结合该抗原或表位，所述亲和力显著高于不展示该抗原或表位的其他实体。在这方面，“显著高于……的亲和力”是指亲和力高到足以使得能够使用所需测定或测量装置来检测与实体不同的抗原或表位。通常，这意味着结合亲和力具有的结合常数(K_a)为至少10⁷M^-1(例如，>10⁷M^-1、>10⁸M^-1、>10⁹M^-1、>10¹⁰M^-1、>10¹¹M^-1、>10¹²M^-1、>10¹³M^-1等)。在某些此类实施方案中，抗体能够结合不同的抗原，只要不同的抗原包含该特定的表位即可。在某些情况下，例如，来自不同物种的同源蛋白质可包含相同的表位。

如本文所用，术语“抗4-1BB抗体”或“4-1BB抗体”是指特异性识别由4-1BB呈递的抗原和/或表位的抗体。类似地，术语“抗LAG-3抗体”和“LAG-3抗体”是指特异性识别由LAG-3呈递的抗原和/或表位的抗体，术语“抗Nrn1抗体”和“Nrn1抗体”是指特异性识别由Nrn1呈递的抗原和/或表位的抗体，术语“抗CRTAM抗体”和“CRTAM抗体”是指特异性识别由CRTAM呈递的抗原和/或表位的抗体，并且术语“抗Sema7a抗体”和“Sema7a抗体”是指特异性识别由Sema7a呈递的抗原和/或表位的抗体。识别其他分子实体上的表位的抗体可以根据类似的方案来提及(例如，抗CTLA-4、抗PD-L1等)。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指这样的抗体，所述抗体是特异性结合相同表位的基本上同质的抗体群体的成员。在某些实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤分泌。在某些此类实施方案中，根据本领域技术人员已知的某些方法来产生杂交瘤。参见例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495-499；该文献全文以引用方式并入本文。在某些实施方案中，使用重组DNA方法产生单克隆抗体(参见例如美国专利号4,816,567)。在某些实施方案中，单克隆抗体是指从噬菌体展示文库中分离的抗体片段。参见例如Clackson等人，(1991)Nature 352:624-628；和Marks等人，(1991)J.Mol.Biol.222:581-597；这些文献全文以引用方式并入本文。修饰词“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的性质，而不将产生抗体的方法限制于特定方法。关于各种其它单克隆抗体生产技术，参见例如Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)；该文献全文以引用方式并入本文。

如本文所用，术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，该部分包括至少一部分抗原结合区或可变区。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、scFv、Fd、双体抗体，以及保留完整抗体可变区的至少一部分的其它抗体片段。参见例如Hudson等人，(2003)Nat.Med.9:129-134；该文献全文以引用方式并入本文。在某些实施方案中，通过对由重组DNA技术或化学多肽合成产生的完整抗体进行酶促或化学切割(例如，对抗体进行木瓜蛋白酶消化和胃蛋白酶消化)来产生抗体片段。

例如，“Fab”片段包括一条轻链，以及一条重链的C_H1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab'”片段包含一条轻链和一条重链，所述重链包含在C_H1结构域与C_H2结构域之间延伸的另外的恒定区。可以在Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成“F(ab')₂”分子。

“Fv”片段包含来自重链和轻链两者的可变区，但缺少恒定区。单链Fv(scFv)片段包含通过柔性接头连接的重链和轻链可变区，以形成具有抗原结合区的单一多肽链。示例性的单链抗体在WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论；这些专利全文以引用方式并入本文。在某些情况下，单个可变区(例如，重链可变区或轻链可变区)可具有识别和结合抗原的能力。

技术人员将理解其他抗体片段。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指由来自至少两种不同来源的组分组成的抗体。在某些实施方案中，嵌合抗体包含来源于第一物种的抗体的一部分，该部分与另一分子(例如，来源于第二物种的抗体的一部分)融合。在某些此类实施方案中，嵌合抗体包含来源于非人动物的抗体的一部分，该部分与来源于人的抗体的一部分融合。在某些此类实施方案中，嵌合抗体包含来源于非人动物的抗体的可变区的全部或一部分，该全部或一部分与来源于人的抗体的恒定区融合。

“人源化”抗体是指这样的非人抗体，所述非人抗体经修饰而使得其与人抗体更密切地匹配(在氨基酸序列方面)。因此，人源化抗体是一种嵌合抗体。在某些实施方案中，对非人抗体可变区的抗原结合残基之外的氨基酸残基进行修饰。在某些实施方案中，通过以下方式来构建人源化抗体：用来自具有所需抗原结合特异性的另一抗体(诸如非人抗体)的CDR的全部或一部分替换人抗体的互补决定区(CDR)的全部或一部分。在某些实施方案中，人源化抗体包含可变区，在所述可变区中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有骨架区(FR)对应于人抗体的FR。在某些此类实施方案中，人源化抗体还包含人抗体的恒定区(Fc)。

术语“人抗体”是指含有人抗体序列并且不含来自非人动物的抗体序列的单克隆抗体。在某些实施方案中，人抗体可含有天然抗体中未发现的合成序列。该术语不受制备抗体的方式的限制。例如，在各种实施方案中，可以通过噬菌体展示、通过人B淋巴细胞或通过重组方法在转基因小鼠中制备人抗体。

如本文所用，术语“天然抗体”是指这样的抗体，在所述抗体中所述抗体的重链和轻链已由多细胞生物的免疫***制备和配对。例如，由从用抗原免疫的第一动物分离的抗体产生细胞产生的抗体是天然抗体。天然抗体含有天然成对的重链和轻链。术语“天然人抗体”是指这样的抗体，在所述抗体中所述抗体的重链和轻链已由人受试者的免疫***制备和配对。

天然人轻链通常被分类为κ轻链和λ轻链。天然人重链通常被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA具有亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在天然人轻链和重链内，可变区和恒定区通常由具有约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链也包括具有约10个或更多个氨基酸的“D”区。参见例如Fundamental Immunology(1989)第7章(Paul,W.编辑，第2版，Raven Press,N.Y.)；该文献全文以引用方式并入本文。

术语“中和抗体”或“中和……的抗体”是指降低包含抗体特异性结合的表位的多肽的至少一种活性的抗体。在某些实施方案中，中和抗体降低了体外和/或体内活性。在一些实施方案中，通过中和包含表位的多肽，中和抗体抑制展示表位的细胞的能力。

如本文所用，如本文所用的术语“糖基改造的”对包括天然存在的或重组的蛋白质、多肽或其片段的糖基化模式的任何操纵。

术语“抗原结合位点”是指抗体的一部分，该部分能够特异性结合抗原。在某些实施方案中，抗原结合位点由一个或多个抗体可变区提供。

术语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体或B细胞受体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位是抗原中由抗体特异性结合的区域。在某些实施方案中，表位可包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在某些实施方案中，表位可具有特定的三维结构特征(例如，“构象”表位)和/或特定的电荷特征。

如果特定抗体特异性结合一个表位和另一个表位，则这两个表位被定义为“相同”。在某些实施方案中，具有不同一级氨基酸序列的多肽可包含相同的表位。在某些实施方案中，相同的表位可具有不同的一级氨基酸序列。如果不同的抗体竞争与相同表位的特异性结合，则认为它们与该表位结合。

“保守”氨基酸取代是指多肽中的氨基酸被具有相似性质(诸如大小或电荷)的另一种氨基酸取代。在某些实施方案中，包含保守氨基酸取代的多肽保持未取代多肽的至少一种活性。保守氨基酸取代可以包括非天然存在的氨基酸残基，所述非天然存在的氨基酸残基通常通过化学肽合成而不是通过生物***中的合成来掺入。这些非天然存在的氨基酸残基包括但不限于肽模拟物和氨基酸部分的其他反向或倒置形式。天然存在的残基可以基于常见的侧链特性进行分类，例如：疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu和Ile；中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn和Gln；酸性的：Asp和Glu；碱性的：His、Lys和Arg；影响链取向的残基：Gly和Pro；以及芳香族的：Trp、Tyr，以及Phe。非保守取代可涉及将这些类别中的一个类别的成员交换为来自另一个类别的成员；而保守取代可涉及将这些类别中的一个类别的成员交换为同一类别中的另一个成员。

如本文所用，术语“序列同一性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)具有相同的单体亚基序列组成的程度。术语“序列相似性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)具有相似聚合物序列的程度。例如，类似的氨基酸是这样的氨基酸，所述氨基酸共享相同生物物理特征并且可以分组成家族(参见上文)。“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)通过以下方法计算：(1)在比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定窗口等)上比较两个最佳比对的序列，(2)确定含有相同(或相似)单体(例如，两个序列中出现的相同氨基酸，两个序列中出现的相似氨基酸)的位置数以产生匹配位置的数目，(3)将匹配的位置数除以比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定窗口)中的位置总数，以及(4)将结果乘以100以产生序列同一性百分比或序列相似性百分比。例如，如果肽A和B的长度均为20个氨基酸并且除了1个位置以外具有完全相同的氨基酸，则肽A和肽B具有95％序列同一性。如果非相同位置处的氨基酸共享相同的生物物理特征(例如，两者都是酸性的)，则肽A和肽B将具有100％序列相似性。作为另一个实例，如果肽C的长度为20个氨基酸且肽D的长度为15个氨基酸，并且肽D中的15个氨基酸中的14个与肽C的一部分的氨基酸相同，则肽C和D具有70％序列同一性，但肽D与肽C的最佳比较窗口具有93.3％序列同一性。为了计算本文中的“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)，将比对序列中的任何空位视为该位置处不匹配。

术语“有效剂量”或“有效量”是指引起患者症状减轻或引起所需生物学结局的剂(例如，抗体)的量。在某些实施方案中，有效剂量或有效量足以治疗或减轻疾病或病症的症状。

如本文所用，术语“施用”和“向……施用”是指向受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官给予药物、前药或其它剂或治疗剂的行为。向人体施用的示例性途径可以通过脑或脊髓的蛛网膜下的空间(鞘内)、眼部(眼用)、口腔(口服)、皮肤(局部或经皮)、鼻(经鼻)、肺部(吸入)、口腔粘膜(经颊)、耳、直肠、***、通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)，等等。

除非另有说明，否则术语“治疗”包括治疗和预防/防范性措施。需要治疗的人包括但不限于已经患有特定病症的个体，以及有风险获得特定病症或疾患的个体(例如，基于年龄、性别、生活方式等具有遗传或表观遗传易感性的个体)。术语“治疗”是指将剂施用于受试者以用于治疗和/或预防/防范性目的。

“治疗剂”是指可以体内施用以产生治疗和/或预防/防范性效果的剂。

“治疗性抗体”是指可以体内施用以产生治疗和/或预防/防范性效果的抗体。

如本文用，术语“共同施用”是指向受试者施用至少两种剂或疗法。在一些实施方案中，两种或更多种剂或疗法的共同施用是同时的。在其它实施方案中，第一剂/疗法在第二剂/疗法之前施用。本领域的技术人员理解，所用的各种剂或疗法的配制和/或施用途径可以变化。用于共同施用的适当剂量可由本领域的技术人员容易地确定。在一些实施方案中，当剂或疗法共同施用时，各剂或疗法以低于适合其单独施用的剂量施用。因此，在其中共同施用剂或疗法降低潜在有害(例如，毒性)剂的必需剂量的实施方案中和/或当共同施用两种或更多种剂导致受试者通过所述剂中的一种剂的共同施用而对另一种剂的有益效应敏感时，共同施用是尤其期望的。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂(例如，结合剂)与惰性或活性载体组合，使得该组合物特别适用于体外、体内或离体诊断或治疗用途。

如本文所用的术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于受试者时，基本上不产生不良反应，例如毒性反应、***反应或免疫反应的组合物。

如本文中所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准药物载体，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如，油/水或水/油乳液)和各种类型的润湿剂，任何和所有溶剂、分散介质、包衣、硫酸月桂酯钠、等渗和吸收延迟剂、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠)等。所述组合物还可包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,Pa.(1975)，该文献全文以引用方式并入本文。

如本文所用，“诊断”或“诊断测试”包括检测、鉴定或表征受试者的疾病状态或状况。例如，可以表征疾病或病症以确定患有疾病或病症的受试者将对特定疗法作出响应的可能性，确定患有疾病或病症的受试者的预后(或其可能的进展或消退)，确定治疗对患有疾病或病症的受试者的影响，或确定未来的治疗过程。

具体实施方式

本文提供了用于检测和/或靶向肿瘤微环境中功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞以用于诊断、治疗和/或研究应用的组合物和方法。具体地，功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞通过它们的本文所述的细胞表面受体(诸如4-1BB、LAG-3)的表达或与4-1BB和LAG-3表达相关的另外标志物(诸如在T细胞表面上差异表达的标志物(例如，PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205，以及TMEM126A，CRTAM和Sema7a))而被检测和/或靶向。

在本文的实施方案的开发过程中进行的实验鉴定了与肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞功能障碍相关和/或负责其的标志物/受体。在一些实施方案中，标志物/受体在功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞中过表达。在此类实施方案中，检测此类标志物的水平(例如，高于阈值)提供了用于检测肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞功能障碍的诊断。此外，在此类实施方案中，靶向此类标志物/受体(例如，抑制(例如，表达和/或活性))提供了治疗剂。在其他实施方案中，标志物/受体在功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞中表达不足。在此类实施方案中，检测此类标志物的水平(例如，低于阈值)提供了用于检测肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞功能障碍的诊断。此外，在此类实施方案中，靶向此类标志物/受体(例如，增强(例如，表达和/或活性))提供了治疗剂。

转录因子Egr2是体外操纵的CD4⁺ T细胞克隆中的无反应状态的关键调节因子(Zheng等人，2013；2012；该文献全文以引用方式并入)。Egr2还已显示为参与几种体内模型***中T细胞活化的负调节(Sumitomo等人，2013；该文献全文以引用方式并入)。Egr2有助于DGKα和-z的上调，所述上调起到钝化TCR介导的Ras途径活化的作用(Zha等人，2006；该文献全文以引用方式并入)。通过比较无反应性细胞的基因表达谱以及进行Egr2 ChIP-Seq分析，鉴定出了多个额外的Egr2驱动的基因靶标(Zheng等人，2013；该文献全文以引用方式并入)。这些基因靶包括4-1BB(Tnfrsf9或CD137)、Lag3、Nrn1、Sema7a、Crtam和Rank1，它们编码细胞表面蛋白。

4-1BB是在TCR接合后瞬时表达的共刺激分子。Lag3(淋巴细胞活化基因3或CD223)是CD4同源物并且起抑制性受体的作用。4-1BB和Lag3的表达在TCR接合后被调节，并在整个分化过程中继续。在人中，4-1BB和LAG-3在来自人黑素瘤肿瘤的CD8+ TIL上表达(Gros等人，2014；Baitsch等人，2012；这些文献全文以引用方式并入)。在小鼠和人中，任一种单独分子都在活化的T细胞群上表达。然而，共表达更受限制并且在循环T细胞中很少观察到。共表达这些标志物的CD8+ TIL的功能是未知的。

在开发本文的实施方案期间进行实验以使用小鼠肿瘤模型研究表达4-1BB和LAG-3的CD8+ TIL的详细特征。发现4-1BB和LAG-3的共表达足以鉴定富含Egr2靶基因表达的肿瘤抗原特异性功能障碍CD8+ TIL。这些CD8+ TIL在体外刺激后未能产生IL-2，但仍然产生IFN-g和Treg募集趋化因子，并离体裂解靶细胞，表明它们不是完全功能惰性的。用抗LAG-3/抗4-1BB的组合治疗恢复了该群体的功能并促进了KLRG-1hi效应细胞的原位获得。另外的基因表达谱分析提供了该T细胞亚群的完整表型分析，这揭示了广泛的抑制性受体和共刺激受体(例如，表2的受体(例如Nrn1、Sema7a、CRTAM等))的表达。在T细胞表面上展示的在该谱分析中鉴定出的抑制性受体和共刺激受体包括PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205，以及TMEM126A。因此，这些方法使得能够表征在具有改变的功能特性的肿瘤微环境中特异性产生的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞群。在一些实施方案中，该群体是用于恢复所需功能和促进肿瘤消退的免疫治疗方法的靶标。在一些实施方案中，本文鉴定的受体/标志物(例如，4-1BB、LAG-3、表2的受体/标志物(例如，表面标志物/受体(例如Nrn1、Sema7a、CRTAM等)等)等)被靶向(例如，通过免疫治疗方法)，以恢复所需的免疫应答性，促进肿瘤消退和/或用于治疗癌症。

在本文的实施方案的开发期间进行的实验应用了Egr2靶标的知识来评估这些标志物对于理解体内肿瘤内的功能障碍T细胞的适用性。数据确实证实LAG-3和4-1BB的共表达足以鉴定肿瘤微环境内的大多数肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞。在荷瘤小鼠的外周淋巴器官中未观察到这些标志物的共表达，表明肿瘤情形特有的性质驱动4-1BB和LAG-3表达。此外，在经历成功排斥的肿瘤中未观察到LAG-3和4-1BB表达的获得，表明在不完全抗原清除的条件下发生该表型的获得。

在一些实施方案中，本文所述的癌症治疗方法包括施用(或与一种或多种另外的疗法/治疗剂共同施用)一种或多种抗4-1BB和/或抗LAG-3试剂(例如，抗体、抗体片段、抗体模拟分子(例如，DARPin、亲和体、适体、纳米抗体等)等)。在一些实施方案中，施用抗4-1BB和/或抗LAG-3剂以使癌细胞、肿瘤和/或肿瘤微环境易接近或易感于用其他疗法/治疗剂(例如，免疫治疗剂)进行治疗。可用于本文所述实施方案的抗4-1BB和/或抗LAG-3剂不受它们的作用机制的限制。剂可以是小分子、肽、多肽、蛋白质、核酸(例如，反义、RNAi等)、抗体、抗体片段等。

在一些实施方案中，本文所述的癌症治疗方法包括增强本文鉴定的与肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞功能障碍负相关的标志物/受体的活性或表达。

在本文的实施方案的开发期间进行的实验鉴定了在功能障碍的CD8+ TIL中差异表达的受体/标志物(参见表2)。对在该筛选中鉴定出的感兴趣的靶标的测试表明，至少神经突蛋白1(Nrn1)、细胞毒性和调节性t细胞分子(CRTAM)和脑信号蛋白7A(Sema7a)是抗肿瘤免疫的调节剂，其中Nrn1和CRTAM阻断与肿瘤面积增大相关，并且Sema7a阻断与肿瘤面积减小相关。

在一些实施方案中，本文所述的癌症治疗方法包括施用(或与一种或多种另外的疗法/治疗剂共同施用)靶向表2的一种或多种受体/标志物(例如PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205，以及TMEM126A、Nrn1、CRTAM、Sema7a等)的剂(例如，抗体、抗体片段、抗体模拟分子(例如，DARPin、亲和体、适体、纳米抗体等)等)。在一些实施方案中，施用剂以使癌细胞、肿瘤和/或肿瘤微环境易接近或易感于用另外的疗法/治疗剂(例如，免疫治疗剂)治疗。可用于本文所述实施方案中的靶向表2的一种或多种受体/标志物(例如PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205，以及TMEM126A、Nrn1、CRTAM、Sema7a等)的剂不受它们的作用机制的限制。剂可以是小分子、肽、多肽、蛋白质、核酸(例如，反义、RNAi等)、抗体、抗体片段等。在一些实施方案中，施用Nrn1的拮抗剂。在一些实施方案中，施用CRTAM的拮抗剂。在一些实施方案中，施用Sema7a的激动剂。

在一些实施方案中，提供了靶向4-1BB、LAG-3和/或表2的一种或多种受体/标志物(例如PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205，以及TMEM126A、CRTAM、Sema7a等)的抗体、抗体片段、抗体模拟分子(例如，DARPin、亲和体、适体、纳米抗体等)，或它们的片段。这些剂可以是裸露的，通过靶结合(例如，中和靶标)来获得它们的作用，或者可以与功能部分(例如，药物、毒素、效应部分等)缀合。

在一些实施方案中，用(i)靶向4-1BB、LAG-3和/或表2的一种或多种受体/标志物(例如PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205，以及TMEM126A、CRTAM、Sema7a等)的一种或多种剂(例如，抗体、抗体片段、抗体模拟分子(例如，DARPin、亲和体、适体、纳米抗体等)等)以及(ii)一种或多种另外的癌症疗法来治疗受试者。此类疗法包括化疗、免疫疗法、放射、手术等。在一些实施方案中，将靶向本文所述受体/标志物的剂与一种或多种另外的剂共同施用以治疗癌症。

在一些实施方案中，适用于本文所述的组合物和方法的示例性抗癌剂包括但不限于：1)生物碱，包括微管抑制剂(例如，长春新碱、长春碱和长春地辛等)、微管稳定剂(例如，紫杉醇(红豆杉醇)和多西紫杉醇等)，以及染色质功能抑制剂，包括拓扑异构酶抑制剂，诸如表鬼臼毒素(例如，依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等)，以及靶向拓扑异构酶I的剂(例如，喜树碱和伊立替康(isirinotecan)(CPT-11)等)；2)共价DNA结合剂(烷化剂)，包括氮芥(例如，二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、环磷酰氮芥、异环磷酰胺和白消安(MYLERAN)等)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀等)和其他烷化剂(例如，达卡巴嗪、羟甲基三聚氰胺、噻替派和丝裂霉素等)；3)非共价DNA结合剂(抗肿瘤抗生素)，包括核酸抑制剂(例如，放线菌素(放线菌素D)等)、蒽环霉素(例如，柔红霉素(道诺霉素和盐酸佐柔比星)、阿霉素(亚德里亚霉素)和伊达比星(伊达霉素)等)、蒽二酮类(例如，蒽环霉素类似物，诸如米托蒽醌类等)、博来霉素(BLENOXANE)等，以及普卡霉素(光神霉素)等；4)抗代谢物，包括抗叶酸剂(例如，甲氨蝶呤、FOLEX和MEXATE，等等)、嘌呤抗代谢物(例如，6-巯基嘌呤(6-MP,PURINETHOL)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、阿昔洛韦、更昔洛韦、氯脱氧腺苷、2-氯脱氧腺苷(CdA)，以及2'-脱氧助间型霉素(喷司他丁)等)、嘧啶拮抗剂(例如，氟嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脱氧尿苷(FdUrd)(氟尿苷))等)，以及胞嘧啶***糖苷(例如，CYTOSAR(ara-C)和氟达拉滨等)；5)酶，包括L-天冬酰胺酶和羟基脲等；6)激素，包括糖皮质激素、抗***(例如，它莫西芬等)、非甾体抗雄激素(例如，氟他胺等)，以及芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑(ARIMIDEX)等)；7)铂化合物(例如，顺铂和卡铂等)；8)单克隆抗体(例如，与抗癌药物、毒素和/或放射性核素等缀合；中和抗体；等)；9)生物反应调节剂(例如，干扰素(例如，IFN-α等)和白细胞介素(例如，IL-2等)等)；10)过继免疫疗法；11)造血生长因子；12)诱导肿瘤细胞分化的剂(例如，全反式维甲酸等)；13)基因治疗技术；14)反义治疗技术；15)肿瘤疫苗；16)针对肿瘤转移的疗法(例如，(巴马司他等)；17)血管生成抑制剂；18)蛋白体抑制剂(例如，VELCADE)；19)乙酰化和/或甲基化的抑制剂(例如，HDAC抑制剂)；20)NFκB的调控剂；21)细胞周期调节的抑制剂(例如，CDK抑制剂)；以及22)p53蛋白功能的调节剂。

在一些实施方案中，施用靶向4-1BB、LAG-3和/或表2的一种或多种受体/标志物(例如Nrn1、Sema7a、CRTAM等)的试剂以克服癌细胞、肿瘤、肿瘤微环境等的免疫侵袭。在一些实施方案中，采用一种或多种另外的癌症免疫疗法(例如，同时或连续)以利用经治疗的细胞/肿瘤的免疫应答性。合适的免疫疗法可包括但不限于：基于细胞的疗法(例如，树突细胞或T细胞疗法等)、单克隆抗体(mAb)疗法(例如，裸mAb、缀合的mAb)、细胞因子疗法(例如，干扰素、白细胞介素等)、辅助治疗(例如，多糖K)等。

在一些实施方案中，将靶向4-1BB、LAG-3和/或表2的一种或多种受体/标志物(例如PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205，以及TMEM126A、CRTAM、Sema7a等)的剂与靶向一种或多种癌细胞或肿瘤)标志物或组分的剂(例如，小分子、肽、抗体、抗体片段等)共同施用。在一些实施方案中，此种共同施用使得癌细胞、肿瘤和/或肿瘤微环境易感于和/或易接近用另外的试剂治疗。

在一些实施方案中，用于本文所述方法和组合物的剂靶向和/或结合癌症或肿瘤细胞标志物或组分，所述癌症或肿瘤细胞标志物或组分选自包括但不限于以下的组：表皮生长因子受体(EGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)。ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFR配体家族；***受体(IGFR)家族、IGF结合蛋白(IGFBP)、IGFR配体家族(IGF-1R)；血小板来源的生长因子受体(PDGFR)家族、PDGFR配体家族；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、FGFR配体家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族、VEGF家族；HGF受体家族：TRK受体家族；肝配蛋白(EPH)受体家族：AXL受体家族；白细胞酪氨酸激酶(LTK)受体家族；TIE受体家族，血管生成素1、2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)受体家族；盘状结构域受体(DDR)家族；RET受体家族；KLG受体家族；RYK受体家族；MuSK受体家族；转化生长因子α(TGF-α)、TGF-α受体；转化生长因子-β(TGF-β)、TGF-β受体；白细胞介素β受体α2链(IL13Rα2)、白细胞介素-6(IL-6)、1L-6受体、白细胞介素-4、IL-4受体、细胞因子受体、I类(血细胞生成素家族)和II类(干扰素/1L-10)家族)受体、肿瘤坏死因子(TNF)家族、TNF-α、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNTRSF)、死亡受体家族、TRAIL受体；癌症-睾丸(CT)抗原、谱系特异性抗原、分化抗原、α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、断点簇区域-Abelson(Bcr-abl)融合产物、B-RAF、半胱天冬酶-5(CASP-5)、半胱天冬酶-8(CASP-8)、β-连环蛋白(CTNNB1)、细胞***周期27(CDC27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD-2、延长因子2(ELF2)、Ets变体基因6/急性髓细胞白血病1基因ETS(ETC6-AML1)融合蛋白、纤连蛋白(FN)、GPNMB、低密度脂质受体/GDP-L岩藻糖：β-D-半乳糖2-α-L岩藻糖转移酶(LDLR/FUT)融合蛋白、HLA-A2、MLA-A11、热休克蛋白70-2突变(HSP70-2M)、KIAA0205、MART2、黑色素瘤泛在突变1、2、3(MUM-1、MUM-2、MUM-3)、***酸性磷酸酶(PAP)、neo-PAP、肌球蛋白1类、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras(KRAS2)、N-ras(NRAS)、HRAS、RBAF600、SIRT12、SNRPD1、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、磷酸丙糖异构酶、BAGE、BAGE-1、BAGE-2、BAGE-3、BAGE-4、BAGE-5、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8，GnT-V(异常N-乙酰葡糖胺基转移酶V，MGAT5)、HERV-K MEL、KK-LC、KM-HN-1、LAGE、LAGE-1，CTL识别的黑素瘤抗原(CAMEL)，MAGE-A1(MAGE-1)。MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-AS、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10。MAGE-All、MAGE-A12、MAGE-3、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B5。MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、粘蛋白1(MUC1)、MART-1/Melan-A(MLANA)、gp100、gp100/Pme117(S1LV)、酪氨酸酶(TYR)、TRP-1、HAGE、NA-88、NY-ESO-1、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17。SSX-1、SSX-2、SSX-3、SSX-4、TRP2-1NT2、癌胚抗原(CEA)、激肽释放酶4、乳腺珠蛋白-A、OA1、***特异性抗原(PSA)、***特异性膜抗原，TRP-1/,75。TRP-2脂肪分化相关蛋白、在黑素瘤2中不存在的干扰素诱导蛋白(AIM-2)。BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、EpbA3、成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)、糖蛋白250(gp250肠羧酸酯酶(iCE)、α-胎蛋白(AFP)、M-CSF、mdm-2、MUCI、p53(TP53)、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RNF43、RU2AS、SOX10、STEAP1、存活蛋白(BIRCS)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、端粒酶、Wilms的肿瘤基因(WT1)、SYCP1、BRDT、SPANX、XAGE、ADAM2、PAGE-5、LIP1、CTAGE-1、CSAGE、MMA1、CAGE、BORIS、HOM-TES-85、AF15q14、HCA66I、LDHC、MORC、SGY-1、SPO11、TPX1、NY-SAR-35、FTHLI7、NXF2 TDRD1、TEX 15、FATE、TPTE、免疫球蛋白个体基因型、Bence-Jones蛋白、***受体(ER)、雄激素受体(AR)、CD40、CD30、CD20、CD19、CD33、CD4、CD25、CD3、癌抗原72-4(CA 72-4)、癌抗原15-3(CA 15-3)、癌抗原27-29(CA 27-29)、癌抗原125(CA 125)、癌抗原19-9(CA 19-9)、β-人绒毛膜***、1-2微球蛋白、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇化酶、热休克蛋白gp96。GM2、沙莫司亭、CTLA-4、707丙氨酸脯氨酸(707-AP)、T细胞识别的腺癌抗原4(ART-4)、癌胚抗原肽1(CAP-1)、钙激活氯通道2(CLCA2)、亲环素B(Cyp-B)、人印戒指肿瘤-2(HST-2)等。

可掺入本文公开的组合物和方法中的抗体的实例包括但不限于诸如以下抗体：曲妥单抗(抗HER2/neu抗体)；帕妥珠单抗(抗HER2mAb)；西妥昔单抗(表皮生长因子受体EGFR的嵌合单克隆抗体)；帕尼单抗(抗EGFR抗体)；尼妥珠单抗(抗EGFR抗体)；扎鲁妥木单抗(抗EGFR mAb)；耐昔妥珠单抗(抗EGFR mAb)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；MDX-210(人源化抗HER-2双特异性抗体)；MDX-447(人源化抗EGF受体双特异性抗体)；利妥昔单抗(嵌合鼠/人抗CD20 mAb)；阿妥珠单抗(抗CD20 mAb)；奥法木单抗(抗CD20 mAb)；托西莫单抗-1131(抗CD20 mAb)；替坦异贝莫单抗(抗CD20 mAb)；贝伐单抗(抗VEGF mAb)；雷莫卢单抗(抗VEGFR2 mAb)；兰尼单抗(抗VEGF mAb)；阿柏西普(与IgG1 Fc融合的VEGFR1和VEGFR2的细胞外结构域)；AMG386(与IgG1 Fc融合的血管生成素-1和血管生成素-2结合肽)；戴妥珠单抗(抗IGF-1R mAb)；吉妥珠单抗奥唑米星(抗CD33 mAb)；阿仑单抗(抗Campath-1/CD52mAb)；本妥昔单抗(抗CD30 mAb)：卡妥索单抗(靶向上皮细胞粘附分子和CD3的双特异性mAb)；他那莫单抗(抗5T4 mAb)；吉瑞妥昔单抗(抗碳酸酐酶ix)；或法勒珠单抗(抗叶酸受体)。其他实例包括抗体，诸如Panorex^TM(17-1A)(鼠单克隆抗体)；Panorex(@(17-1A))(嵌合鼠单克隆抗体)；BEC2(抗独特性mAb，模拟GD表位)(具有BCG)；Oncolym(Lym-1单克隆抗体)；SMART M195 Ab，人源化13'1 LYM-1(Oncolym)。Ovarex(B43.13，抗独特性小鼠mAb)；3622W94 mAb与腺癌上的EGP40(17-1A)泛癌抗原(pancarcinoma antigen)结合；Zenapax(SMART抗Tac(IL-2受体)；SMART M195 Ab，人源化Ab，人源化)；NovoMAb-G2(泛癌特异性Ab)；TNT(组蛋白抗原的嵌合mAb)；TNT(组蛋白抗原的嵌合mAb)；胶质瘤-H(单克隆-人源化Ab)；GNI-250 Mab；EMD-72000(嵌合-EGF拮抗剂)；LymphoCide(人源化IL.L.2抗体)；以及MDX-260双特异性，靶向GD-2、ANA Ab、SMART IDIO Ab、SMART ABL 364 Ab或ImmuRAIT-CEA。

在一些实施方案中，可用于本文实施方案中的剂特异性结合调节性T细胞、骨髓抑制细胞或树突细胞的组分。在另一个方面，靶向部分特异性结合以下分子中的一种：CD4；CD25(IL-2α受体；IL-2αR)；细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4；CD152)；白细胞介素-10(IL-10)；转化生长因子-β受体(TGF-βR)；转化生长因子-β(TGF-β)；程序性死亡-1(PD-1)；程序性死亡-1配体(PD-L1或PD-L2)；核因子-κB的受体激活剂(RANK)；核因子-κB受体激活剂(RANK)的配体(RANKL)；LAG-3；糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR；TNFRSF18)；或白细胞介素-4受体(IL-4R)。在一些实施方案中，所述剂是增强靶向分子功能的激动剂。在其他实施方案中，所述剂是抑制靶向分子功能的拮抗剂。

在一些实施方案中，可用于本文实施方案的剂结合调节免疫***的特定细胞因子、细胞因子受体、共刺激分子、共抑制分子或免疫调节受体。在另一方面，靶向部分特异性结合以下分子中的一种：肿瘤坏死因子(TNF)超家族；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族；白细胞介素-12(IL-12)；IL-12受体；4-1BB(CD137)；4-1BB配体(4-1BBL；CD137L)；OX40(CD134；TNR4)；OX40配体(OX40L；CD40；CD40配体(CD40L)；CTLA-4；程序性死亡-1(PD-1)；PD-1配体I(PD-L1：B7-H1)；或PD-1配体2(PD-L2；B7-DC)；B7家族；B7-1(CD80)；B7-2(CD86)；B7-H3；B7-H4；GITR/AITR：GITRL/AITRL；BTLA；CD70；CD27；LIGHT；HVEM：Toll样受体(TLR)(TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5,、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10)。在一些实施方案中，所述剂是增强靶向分子功能的激动剂。在其他实施方案中，所述剂是抑制靶向分子功能的拮抗剂。

在一些实施方案中，将靶向4-1BB、LAG-3和/或表2的一种或多种受体/标志物(例如PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205，以及TMEM126A、CRTAM、Sema7a等)的剂(例如，免疫治疗剂)与一种或多种佐剂共同施用(例如，连续或顺序地)。合适的佐剂包括但不限于以下项中的一种或多种：油乳剂(例如，弗氏佐剂)；皂苷配方；病毒体和病毒样颗粒；细菌和微生物衍生物；免疫刺激性寡核苷酸；ADP核糖基化毒素和解毒衍生物；明矾；BCG；含矿物质的组合物(例如，矿物盐，诸如铝盐和钙盐、氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等)；生物粘合剂和/或粘膜粘合剂；微粒；脂质体；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯配方；聚磷腈；胞壁酰肽；咪唑喹诺酮类化合物；表面活性物质(例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔戚血蓝蛋白和二硝基苯酚)。

佐剂还可包括免疫调节剂，诸如细胞因子、白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如，干扰素γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。除了变体B7-DC多肽之外，还可以施用其他共刺激分子，包括B7家族的其他多肽。蛋白质佐剂可以作为全长多肽或其活性片段提供，或以DNA的形式提供，诸如质粒DNA。

本文所述的药物和免疫治疗组合物可通过任何合适的施用途径(例如，口服递送、肠胃外递送、粘膜递送、肺部递送、静脉内递送等)来递送。用于此类递送途径的合适制剂在本领域中是可理解的。

可以用本文所述的组合物和方法治疗的癌症的非限制性实例包括但不限于：黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、***癌(例如，激素难治性***腺癌)、胰腺癌(例如，腺瘤)、乳癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、***、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤及其它赘生性恶性疾病。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤癌症。

本文描述的一些实施方案特别可用于治疗对免疫治疗方法无响应的肿瘤。在一些实施方案中，本文提供了对T细胞或抗原呈递细胞(例如，树突细胞(例如，CD103⁺DC等)，等等)没有响应(或具有降低的响应)的癌症的治疗。在一些实施方案中，本文提供的是治疗尽管T细胞浸润，但对治疗无响应的癌症。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗这样的癌症，在所述癌症中T细胞未针对肿瘤相关抗原进行适当的致敏。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗包含在树突细胞(例如，CD103⁺DC等)募集方面有缺陷的肿瘤或细胞的癌症。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗包含在趋化因子CCL4产生方面有缺陷的肿瘤或细胞的癌症。

在一些实施方案中，本文的治疗组合物和方法可用于例如WO2016/141312中描述的那些；该专利全文以引用方式并入。

在一些实施方案中，提供了用于测试来自受试者的样品(例如，细胞、组织、细胞群、肿瘤、血液、尿液、唾液等)的一种或多种生物标志物(例如，功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞的生物标志物)的方法。此类生物标志物可包括核酸、小分子、蛋白质、肽等，并且可使用任何合适的技术测定法进行检测。在一些实施方案中，本文提供基于DNA-、RNA-、小分子和/或基于蛋白质的诊断方法，所述诊断方法直接或间接检测癌细胞或肿瘤逃避免疫应答或免疫疗法的生物标志物。本发明还提供用于此类诊断目的的组合物、试剂和试剂盒。

在一些实施方案中，在核酸(例如，RNA)水平上检测生物标志物。例如，测定样品中生物标志物核酸(例如，mRNA)的存在或量(例如，以测定生物标志物表达的存在或水平)。可以使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术来检测/定量生物标志物核酸(例如，RNA、扩增的cDNA等)，所述核酸技术包括但不限于核酸测序、核酸杂交、核酸扩增(例如，通过PCR、RT-PCR、qPCR等)、微阵列、Southern和Northern印迹、测序等。可以通过任何常规手段检测未扩增或扩增的核酸。例如，在一些实施方案中，通过与可检测标记的探针杂交并测量所得杂交体来检测核酸。核酸检测试剂可以是标记的(例如，荧光的)或未标记的，并且可以在溶液中游离或固定(例如，在珠粒、孔、表面、芯片等上)。

在一些实施方案中，在蛋白质水平上检测生物标志物。例如，测定样品中生物标志物蛋白的存在或量(例如，以测定生物标志物表达的存在或水平或定位)。在一些实施方案中，提供试剂以检测和/或定量生物标志物蛋白。合适的试剂包括一抗(例如，结合生物标志物)、二抗(例如，结合一抗)、抗体片段、适体等。蛋白质检测试剂可以被标记(例如，荧光)或未标记，并且可以在溶液中游离或固定(例如，在珠粒、孔、表面、芯片等上)。

在一些实施方案中，提供生物标志物捕获试剂以对生物标志物进行定位、浓缩、聚集等。例如，在一些实施方案中，与生物标志物相互作用的生物标志物捕获试剂与固体支持物(例如，珠粒、表面、树脂、柱等)连接，这允许使用者在宏观尺度上进行操纵。通常，固体支持物允许使用机械手段从异质溶液中分离和纯化生物标志物。例如，当与珠粒连接时，通过例如通过物理移动从异质溶液中去除珠粒来实现分离。在珠粒是磁性或顺磁性的实施方案中，使用磁场来实现捕获试剂(并因此靶标)与异质溶液的物理分离。用于分离靶标的磁珠在本领域中描述于例如欧洲专利申请号87309308中，该专利申请出于所有目整体并入本文。

用于本文所述的诊断方法或测试步骤的组合物包括但不限于探针、扩增寡核苷酸和抗体。本文描述的实施方案中使用的任何检测和/或诊断试剂可以单独提供或与试剂盒形式的其他组合物组合提供。试剂盒可以包括测定所必需或足够的任何和所有组分，包括但不限于检测试剂、缓冲液、对照试剂(例如，组织样品、阳性和阴性对照样品等)、固体支持物、标签、书写和/或图示说明和产品信息、抑制剂、标记和/或检测试剂、包装环境控制(例如，冰、干燥剂等)等。在一些实施例中，试剂盒提供所需组分的子组，其中预期使用者将提供剩余的组分。在一些实施例中，试剂盒包括两个或更多个单独的容器，其中每个容器容纳待递送的组分的2。

在一些实施方案中，使用基于计算机的分析程序来将通过检测测定生成的原始数据(例如，生物标志物的存在、不存在或表达量)转化成临床医生的预测值数据。在一些实施方案中，计算机分析将各种数据组合成单个分数或值，该单个分数或值为预测性的和/或诊断性的。临床医生可以使用任何合适的手段访问预测性数据。因此，在一些优选的实施方案中，本发明提供了以下进一步的益处：不太可能接受遗传学或分子生物学训练的临床医生不需要理解原始数据。数据以最有用的形式直接呈现给临床医生。然后，临床医生能够立即利用该信息以优化受试者的护理。本文考虑的是能够从进行测定的实验室、信息提供者，医疗人员和受试者接收、处理信息并向所述实验室、信息提供者，医疗人员和受试者传送信息的任何方法。例如，在本发明的一些实施方案中，从受试者获得样品((例如，活检，细胞或血液样品)，并提交给谱分析服务(例如，医疗机构的临床实验室、第三方检测服务、基因组分析业务等，以生成原始数据。在样品包括组织或其他生物样品的情况下，受试者可以访问医疗中心以获得样品并将其发送到分析中心，或者受试者可以自己收集样品并直接将其发送到分析中心。在一些实施方案中，生成报告(例如，由临床医生、由测试中心、由计算机或其他自动分析***等)。报告可包含测试结果、诊断和/或治疗建议。

实验

材料和方法

小鼠和肿瘤接种

从Taconic Farms购买6至8周范围内的雌性C57BL/6小鼠。从Taconic Farms获得处于C57BL/6背景的CD45.1和Rag2^–/–小鼠，并在芝加哥大学繁殖。先前已经描述了2C/Rag2^–/–和P14/Rag2^–/–小鼠(Brown等人，2006；该文献全文以引用方式并入本文)。产生pLCK-CreERT2 x ROSA-YFP小鼠并且已经进行了描述(Evaristo等人，2016；该文献全文以引用方式并入本文)。将B16.SIY.dsRed(Kline等人，2012；该文献全文以引用方式并入本文)、C1498.SIY.GFP(Zhang等人，2009；该文献全文以引用方式并入本文)和MC57.SIY.GFP(Spiotto等人，2002；该文献全文以引用方式并入本文)肿瘤细胞工程改造以使dsRed或GFP与H2-K^b限制模型抗原SIYRYYGL同框表达。通过使用表达SIYRYYGL的cDNA的pLEGFP质粒(Spiotto等人，2002；该文献全文以引用方式并入)对1969细胞系进行逆转录病毒转导(Diamond等人，2011；该文献全文以引用方式并入)，而将1969.SIY.GFP细胞系工程改造。对于实验，使6至9周龄小鼠在左侧腹上或左侧腹和右侧腹两侧上皮下接受2×10⁶个肿瘤细胞。根据国立卫生研究院动物护理指南维护所有小鼠，并根据IACUC批准的方案进行研究。

为了产生Egr2^EGFP敲入报告小鼠的靶向构造，将包含egr2基因的12.6kb小鼠基因组DNA片段用SacII切下并克隆到pEasy-Flox载体中与胸苷激酶(TK)选择标记相邻。将含有IRES2-eGFP和LoxP侧翼新霉素选择标记的盒***egr2基因的翻译终止密码子(TGA)与聚腺苷酸化信号之间的NheI位点。对来自129只小鼠的ES细胞克隆进行电穿孔并选择新霉素抗性。通过PCR和使用5'和3'探针进行southern印迹，验证了ES细胞克隆在内源基因座中的同源***。将小鼠与C57BL/6回交超过8代。

TIL分离

在指定的时间点从小鼠收获肿瘤。将肿瘤通过50μm过滤器解离并用PBS洗涤。通过在细胞悬浮液下层叠泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)，然后以400×g无间断地离心30min，来进一步富集TIL。分离血沉棕黄层(buffy-layer)并用PBS洗涤两次，然后染色。为了通过FACS分离特定细胞群，在指示时合并肿瘤，并通过泛影葡胺离心两次来重新纯化细胞层。对于第28天肿瘤，在泛影葡胺分离后，根据制造商的说明书(MAGNISORT,eBiosciences)通过负性珠粒选择来进一步纯化T细胞。然后用PBS洗涤细胞，在4℃下染色15分钟，然后重悬于完全DMEM(cDMEM：10％FBS、100U/mL青霉素-链霉素、1％MEM非必需氨基酸、50μMβ-ME、0.01MMOPS)中，并根据实验测定分选到RLT裂解缓冲液(QIAGEN)或cDMEM中。一旦分选完成，就将分选到RLT缓冲液中的细胞直接放在干冰上。

流式细胞术和抗体

将细胞悬浮液在PBS中洗涤两次，然后在FACS缓冲液(10％FBS、2mM EDTA、0.001％NaN₃)中染色。将细胞在冰上染色30min并在1％PFA中固定。使用针对以下分子的抗体：CD3(17A2、AX700)、2B4(2B4、FITC)、CD127(A7R34、PE)、OX-40(OX-86、PE)、4-1BB(17B5、生物素、APC)、CD160(7H1、PE-Cy7)、LAG-3(C9B7W、PerCPeFluor710)、PD-1(RMP1-30、PE-Cy7)、NRP1(3E12、BV421)、GITR(DTA-1、FITC)、ICOS(7E.17G9、BV421)、KLRG-1(2F1、eF450、BV605)、TIGIT(1G9、APC)、TIM-3(RMT3-23、PE)、CD4(RM4-5、BV605)、CD45.1(A20、FITC)、CD45.2(104、PE)、CD8α(53-6.7、BV711)。使用可固定活力染料506(eBioscience)进行活/死辨别。利用SIYRYYGL五聚体(PE)(Proimmune)执行SIY特异性T细胞的染色；将SIINFEKL五聚体(PE)用作非特异性对照。所有流式细胞术分析均在LSRFortessa(BD)上进行，并使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。

定量实时PCR

使用RNEasy Micro Kit(QIAGEN)按照制造商的方案从分选的细胞群体中提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)根据制造商的说明书来合成cDNA。使用引物-探针组(表1a和表1b)测定转录物水平，所述引物-探针组是通过在线ProbeFinder软件和通用探针库(Roche)开发的，IL-2(Mm00434256_m1)和18S(Hs99999901_s1)除外。为了使批次影响最小化，在可能的情况下，将探测的基因的所有样品都在相同的96孔qRT-PCR板上运行。所有引物-探针组均含有跨越外显子-外显子边界的引物或跨越内含子的引物。将转录物的表达水平归一化为18S表达。

表1a.引物序列

表1b.引物/探针

体内增殖测定

在流式细胞术分析之前24小时通过BrdU脉冲测量体内增殖。在肿瘤接种后第12天，每只小鼠i.p.(腹膜内)注射0.8mg BrdU。分离TIL并如上所述执行表面染色。表面染色后，根据制造商的方案，使用Foxp3染色试剂盒(BD)固定并透化细胞，并在37℃下用100μl的PBS/DNA酶溶液(300μg/ml)孵育30分钟。洗涤细胞并在室温下用抗BrdU(FITC,Bu20a)孵育30分钟，然后用PBS洗涤并重悬于PBS中。

体外刺激测定

将经组织培养处理的96孔圆底板在DPBS中用抗CD3ε(1μg/ml；2C11)在4℃下包被过夜或在37℃下包被2小时。将细胞分选到冷的cDMEM培养基中，并在分选完成后立即放到冰上。然后沉淀细胞，重悬于50μl的cDMEM中，并与可溶性抗CD28(2μg/ml；PV-1)一起孵育10-12小时，最终体积为100μl。刺激后，取出上清液用于ELISA或基于珠粒的免疫测定(LegendPlex)，并将细胞用DPBS洗涤一次并重悬于15μl的RNAlater稳定溶液(QIAGEN)或300μl的RLT缓冲液中。将细胞保存在-80℃直至执行RNA分离。

蛋白质定量

通过标准ELISA或基于珠粒的免疫测定(LEGENDplex,BioLegend)来测定蛋白质浓度的测量值。根据制造商的方案(Ready-SET-Go ELISA；eBioscience)对来自体外刺激的上清液执行ELISA。使用Emax酶标仪(Molecular Devices)获得在450nm处的吸光度值，并通过标准曲线确定IL-2浓度。将蛋白质浓度值归一化为铺板的分选细胞的数目。根据制造商的方案进行LEGENDplex测定。在单独的实验中通过两种方法来确认IL-2浓度(图4B)，其中该两种方法之间无显著的IL-2浓度差异。

谱型分析和测序

对小鼠注射2×10⁶个B16.SIY.dsRed肿瘤细胞。14天后，收获肿瘤，并将特异性CD8⁺TIL亚群分选到RLT缓冲液(QIAGEN)中并立即冷冻。从分选的细胞群合成cDNA，并用与FAM-Cβ1.1引物配对的21种不同Vβ-5'引物，通过PCR扩增CDR3区(表1)。三次VβPCR反应未达到用于分析的显著扩增，所以被从分析中去除。为了测序，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化Cβ-VβPCR产物，并在芝加哥大学基因组学核心设施(University of ChicagoGenomics Core Facility上进行测序。在芝加哥大学基因组学核心(the University ofChicago Genomics core)通过毛细管电泳分析Cβ-VβPCR产物，并使用Liz500梯比对CDR3峰。使用GeneiousR9软件(Kearse等，2012)显示光谱型图。为了生成每个Vβ谱型的频率谱，使用peak studio(fodorlab.uncc.edu/software/peakstudio)测量每个峰下的面积。计算给定小鼠内来自每个CD8⁺脾和TIL群体的各个Vβ谱型之间的汉明距离(Currier和Robinson，2001；该文献全文以引用方式并入)。为了确定来自每次比较的HD之间的显著性，对来自小鼠的各个Vβ的HD进行平均，并且执行具有Dunn校正的单因素方差分析以进行多重比较。

TCR转基因T细胞转移实验

从来自同源2C/Rag2^–/–/CD45.1/2和/或P14/Rag2^–/–/CD45.2小鼠的脾和***产生细胞悬浮液，并通过根据制造商的方案在磁柱上进行CD8⁺阴性选择(MiltenyiBiotechnologies)来纯化T细胞。用PBS洗涤TCR转基因(Tg)T细胞，以10×10⁶/ml的浓度重悬，并将1×10⁶个TCR Tg细胞通过尾静脉转移以0.1mL的体积过继转移到荷有CD45.1肿瘤的小鼠中。在指定的时间后，对2C T细胞和相应的宿主CD8⁺ T细胞进行分选和刺激，如上所述。

体外细胞毒性测定

每次单独实验，对10只C57BL/6小鼠在左侧腹和右侧腹s.c.(皮下地)注射2×10⁶个B16.SIY细胞。在第14天，合并所有20个肿瘤，并按照制造商的方案使用肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec)进行解离。用PBS洗涤肿瘤细胞悬浮液3-5次，并通过Ficoll-Hypaque梯度离心富集TIL。将TIL染色，分选并直接置于冰上。滴定TIL并直接加入含有50,000个P815肥大细胞瘤细胞和1μg/mL抗CD3的96孔板中。对于阳性对照，从OT-I/Rag2^–/–小鼠分离OT-I细胞，并用板结合的抗CD3(0.25μg/mL)、抗CD28(2μg/mL)和100U/mL的IL-2刺激2-3天。对于阴性对照，将P815细胞单独培养，或与从***分离的初始CD8⁺ T细胞一起培养。温育12小时后，对细胞进行Thy1、CD45、CD8α、可固定活力染料450(eBioscience)和/或碘化丙啶的染色。

基因表达分析

将CD8⁺ TIL亚群的总RNA按照制造商的方案(RNEasy Micro Kit:QIAGEN)，从自10只小鼠合并的分选细胞中分离出来。使用Illumina MouseRef8微阵列芯片通过芝加哥大学基因组学设施(University of Chicago Genomics Facility)分析样品。进行两次实验重复，并且结果为经过log₂转化和平均的。鉴定出揭示相对于CD8⁺4-1BB^–LAG-3^–PD-1^–细胞的1.5倍差异abs(log₂(比率)>1.5))的探针组并用于后续分析。微阵列数据可在GeneExpression Omnibus数据库(ncbi.nlm.nih.gov/gds)中以登录号GSE79919获得。对于交叉研究比较，使用GEO2R在线软件从功能减退的CD8⁺ TIL数据集、GSE79858((GSM2107353、GSM2107353和GSM2107355)对比(GSM2107350、GSM2107351、GSM210732))和CD8⁺ T细胞耗竭数据集、GSE41870((GSM1026819、GSM1026820、GSM1026821)对比(GSM1026786、GSM1026787、GSM1026788、GSM1026789))提取log2倍数变化值。将显示2倍差异的上调基因用于分析。鉴定来自GEO2R提取数据的多个基因名称，并与来自Illumina数据集的基因名称进行匹配。在systems.crump.ucla.edu/rankrank/index.php和相关的生物导体包“RRHO”(Rosenblatt和Stein，2014；该文献全文以引用方式并入本文)处进行秩-秩超几何重叠分析(Plaisier等人，2010；该文献全文以引用方式并入本文)。

基因本体富集分析

以成对方式将共享的上调基因用作具有Cytoscape应用程序的ClueGO软件的输入(Shannon等人，2003；该文献全文以引用方式并入本文)。生物过程和免疫***过程基因本体注释都用于分析。当产生途径节点时，仅考虑Bonferroni逐步减低校正p值>0.01的途径。将在每个节点内发现具有最多基因数的非冗余途径用作图6A中的示例。

抗体和FTY720治疗

用100μg/小鼠的抗4-1BB(Bio-X-Cell；LOB12.3)抗体和/或100μg/小鼠抗LAG-3(Bio-X-Cell；C9B7W)腹膜内治疗小鼠。对于肿瘤生长实验，在肿瘤接种后第7天、第10天、第13天和第16天治疗小鼠。对于离体功能实验，将小鼠在第7天、第10天和第13天进行治疗，并在第14天对细胞进行分选。对于阻断***出口的实验，在第一抗体治疗前一天(第6天)通过灌胃给予25μg的FTY720，并且每天持续直至第14天的终点。

结果

4-1BB和LAG-3鉴定了CD8⁺ TIL的主要群体

为了确定4-1BB和LAG-3是否能鉴定功能障碍的CD8⁺ TIL，使用充分表征的B16.SIY黑素瘤模型来检查LAG-3和4-1BB的表达模式。在肿瘤接种后第7天，4-1BB⁺LAG-3⁺群体占所有CD8⁺ TIL的15.8％。到第21天，该群体的频率显著增长到44％。从第7天到第14天，4-1BB^–LAG-3⁺(4^–L⁺)群体的频率也增加1.9倍，变成占CD8⁺TIL隔室的25％。相比之下，到第21天，4-1BB^–LAG-3^–(4^–L^–)群体的频率降低2.7倍。在实验的时间范围内，4-1BB⁺LAG-3^–CD8⁺TIL的比例或数量没有显著的增长(图1A和图1B)。在分析细胞亚群的绝对数量时，可以看到类似的模式(图1C和图1D)。获得这些表型对于肿瘤微环境是特异性的，因为它们在脾或肿瘤引流***(TdLN)中未观察到(图1A)。这些数据表明肿瘤微环境优先支持诱导的LAG-3和4-1BB的共表达。

肿瘤进展期间朝向4-1BB^–LAG-3⁺和4-1BB⁺LAG-3⁺群体的细胞数量选择性增加和比例偏移表明这些群体的扩增发生在肿瘤微环境中。在肿瘤接种后第14天对CD8⁺ TIL进行Ki67染色，并通过流式细胞术分析。81％的4-1BB^–LAG-3⁺细胞和85％的4-1BB⁺LAG-3⁺细胞是Ki67⁺，相比之下4-1BB^–LAG-3^–TIL的仅为32％(图1E)。在第12天用BrdU脉冲小鼠，并在24小时后分析CD8⁺ TIL亚群的BrdU掺入。的确，4-1BB^–LAG-3⁺和4-1BB⁺LAG-3⁺群体与4-1BB^–LAG-3^–群体相比掺入了更多的BrdU(图1F)。这些数据表明曾一旦CD8⁺ T细胞到达肿瘤部位，一部分TIL就在肿瘤内扩增，并且这些扩增的TIL通过4-1BB和LAG-3的表达增加来鉴定。

为了确定LAG-3和4-1BB的上调是否仅仅是B16.SIY肿瘤模型的产物，或者它是否是肿瘤内的CD8⁺ T细胞的更一般特征，分析来自另外三个逐渐生长的肿瘤模型C1498.SIY、MC38.SIY、EL4.SIY和B16F10亲本的T细胞。在第14天分析TIL的4-1BB和LAG-3的表达。发现表达模式与在从B16.SIY肿瘤分离出的CD8⁺ TIL中观察到的相似(图1G和图1I)、来自B16F10亲本肿瘤的结果证实，不需要SIY的存在来观察到4-1BB和LAG-3的共表达。为了确定4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL亚群是仅在进展中的肿瘤中产生还是也在被排斥的肿瘤中产生，分析了1969.SIY和MC57.SIY纤维肉瘤肿瘤模型中的T细胞表型，所述T细胞表型更具免疫原性并且经历自发排斥。明显更少的4-1BB⁺LAG-3⁺细胞在1969.SIY和MC57.SIY肿瘤中的CD8⁺ TIL隔室中被发现(图H和图I)。随着时间的推移，4-1BB和LAG-3的共表达在B16.SIY肿瘤中维持，而不在MC57.SIY肿瘤中维持(图1J)。这些数据表明，LAG-3⁺4-1BB⁺TIL表型的获得优先发生在肿瘤微环境内，并且仅在肿瘤进展而不是消退的条件下发生。

CD8⁺4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL表达Egr2和多个Egr2基因靶标

在本文的实施方案的开发期间进行实验以确定Egr2表达本身是否也是CD8⁺ TIL隔室内的T细胞的特征；利用Egr2-IRES-GFP(Egr2^GFP)敲入报告小鼠。在第7天和第14天，所有CD8⁺ TIL的约14％是GFP⁺(图2A)。为了确认Egr2被忠实地报告，对表达高水平和低水平EGFP的CD8⁺ TIL进行分选，并通过qRT-PCR筛选Egr2和几个Egr2靶标。Egr2-GFP^高群体表达更高水平的Egr2和许多先前使用体外无反应性模型定义的Egr2靶基因。这些靶基因包括Tnfrsf9、Lag3、Ngn、Sema7a、Crtam、Ccl1和Nrn1(图2B)。通过流式细胞术确认4-1BB和LAG-3在Egr2-GFP^高CD8⁺ TIL中的表达。大部分Egr2-GFP^高细胞表达LAG-3和/或4-1BB。在第14天，在亚群上，Egr2GFP^低细胞也显示为表达4-1BB和LAG-3(图2C)。该结果表明表达Egr2的CD8⁺TIL仅包含表达LAG-3和/或4-1BB的TIL的子集，或者Egr2被瞬时表达并且随后在诱导LAG-3和4-1BB后下调。

使用来自体外无反应性CD4⁺ T细胞克隆(Zheng等人，2013；该文献全文以引用方式并入)的Egr2靶基因，在分选的4-1BB^–LAG-3^–和4-1BB⁺LAG-3⁺细胞中通过qRT-PCR来检查Egr2驱动的转录程序。在所检查的43个Egr2靶基因中，10个在4-1BB⁺LAG-3⁺群体中显示出可检测的增加的表达，同时相似基因子集的表达在4-1BB^–LAG-3⁺群体中增长(图2D)。总的来说，这些数据表明Egr2在表达LAG-3和/或4-1BB的CD8⁺ TIL亚群中表达，并且在这些较大的T细胞群体中检测到了作为整体的已知Egr2靶的子集。

接下来检查在体内CD8⁺ TIL中表达LAG-3和4-1BB是否需要Egr2。为此目的，利用Egr2^flox/flox X pLCK-CreERT2 x ROSA-YFP小鼠，其中口服他莫昔芬施用导致一部分CD8⁺ T细胞缺失Egr2并表达YFP(图2E)。这允许比较同一肿瘤内的Egr2足量(YFP^–)和Egr2缺陷(YFP⁺)CD8⁺。为了确定Egr2事实上从YFP⁺部分中缺失，分选出YFP⁺和YFP^–CD8⁺ TIL两者，并直接离体测量并且在离体刺激后测量Egr2转录物。与YFP^–对应物相比，YFP⁺ CD8⁺ TIL表达明显较少的Egr2转录物(图2E)。为了确定4-1BB和LAG-3表达是否需要Egr2，在肿瘤接种后第7天和第14天分析CD8⁺ TIL，并比较YFP⁺和YFP^–群体与没有用他莫昔芬治疗的小鼠。在第7天，YFP⁺部分与YFP^–群体和WT CD8⁺ TIL相比表达较少的4-1BB和LAG-3。然而，在第14天，4-1BB和LAG-3的表达没有显著差异(图2F)。这表明其他转录调节因子补偿并促成LAG-3和4-1BB的表达，尤其是在稍后的时间点。

Egr3已显示与Egr2具有重叠功能(Safford等人，2005；该文献全文以引用方式并入)并且HIF1α可有助于4-1BB表达(Palazón等人，2012)。为了研究这些转录因子是否可以补偿4-1BB和/或LAG-3表达，我们在第7天对表达4-1BB和LAG-3的Egr2GFP^高和Egr2GFP^低CD8⁺TIL进行分选，并通过qRT-PCR分析Egr3和HIF1α的表达。Egr3和HIF1α确实在Egr2GFP^高和Egr2GFP^低群体中都表达。确认Egr2和CCL1在Egr2GFP^高和Egr2GFP^低群体之间的差异表达以确保分选纯度(图2G)。总之，这些数据表明Egr2有助于在早期时间点上调4-1BB和LAG-3表达，但随着T细胞-肿瘤相互作用的进展，其他转录调节因子补偿并驱动LAG-3和4-1BB的表达。

CD8⁺4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL是寡克隆的并且富含肿瘤抗原特异性

并非肿瘤微环境中的所有T细胞都对肿瘤相关抗原具有特异性，因为在TIL中经常发现对无关抗原特异的记忆T细胞，并且已经记录了体内非特异性T细胞运输(Harlin等人，2006；该文献全文以引用方式并入)。在本文的实施方案的开发期间进行实验以确定4-1BB⁺LAG-3⁺ CD8⁺ TIL是否为肿瘤抗原特异性的。TCR刺激后LAG-3、4-1BB和Egr2上调，并且实验表明该群体在肿瘤微环境中原位扩增。采用了三种互补技术。首先，基于LAG-3和4-1BB表达，通过细胞分选来分离CD8⁺ TIL，并执行TCRβ谱型分析。相比于4-1BB^–LAG-3^–TIL和CD8⁺脾细胞，4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL具有非高斯分布并共享一个或两个主峰(图3A)。对显示一个主导峰的几个Vβ的分析显示，Vβ7含有在4-1BB^–LAG-3⁺与4-1BB⁺LAG-3⁺群体之间共享的单个CDR3β序列，表明克隆关系(图3A)。为了测量CDR3β库的寡克隆性，计算三只独立小鼠中在CD8⁺TIL亚群与脾CD8⁺群体之间的各个Vβ的汉明距离(HD)(图8)。通过将每个谱型转换为曲线频率谱下的面积，汉明距离计算频率的变化并报告0和1之间的比较值，其中0表示完全相同的频率谱，1表示完全不一致的谱。作为对照，计算不同小鼠之间的脾CD8⁺群体的HD(图3B，黑色条)。因为脾CD8⁺谱型主要是高斯分布，所以该值代表两个相似分布之间的HD。对CD8⁺ TIL亚群之间的HD的分析揭示，4-1BB⁺LAG-3⁺和4-1BB^–LAG-3⁺，而不是4-1BB^–LAG-3^–CDR3β的分布与脾CD8⁺群体显著不同(较低的高斯分布)(图3B)。这些数据表明4-1BB⁺LAG-3⁺和4-1BB^–LAG-3⁺群体是TIL的寡克隆扩增子集，表明了这些亚群中的抗原特异性。

作为第二种方法，利用B16.SIY黑素瘤和MC38.SIY腺癌模型。对特异于H-2K^b受限的SIY表位(SIYRYYGL)的CD8⁺ T细胞进行监测。在肿瘤接种后第14天，发现SIYRYYGL/K^b五聚体⁺(H-2K^b/SIY)细胞在B16.SIY和MC38.SIY肿瘤内为扩增的数目(图3C)。几乎47％的H-2K^b/SIY⁺细胞表达4-1BB和LAG-3，相比之下32％的H-2K^b/SIY^–群体表达4-1BB和LAG-3(图3C和图3E)。抗原特异性CD8⁺ TIL在4-1BB⁺LAG-3⁺群体中的这种富集指示这些标志物鉴别肿瘤抗原特异性TIL。H-2K^b/SIY^–细胞也含有大量的4-1BB⁺LAG-3⁺细胞，这与SIY以外的肿瘤抗原也被体内CD8⁺ TIL亚群识别的观点一致(图3C)。脾或TdLN中的H-2K^b/SIY⁺细胞不共表达4-1BB和LAG-3，表明该表型是在肿瘤微环境中获得的。

还在肿瘤抗原特异性CD8⁺ TIL的情形中在两个自发排斥的肿瘤模型中分析了这些特征。为此，评估来自MC57.SIY和1969.SIY肿瘤的H-2K^b/SIY特异性CD8⁺ TIL细胞。在肿瘤接种后第14天，在4-1BB⁺LAG-3⁺部分中发现约5％的H-2K^b/SIY特异性CD8⁺ TIL。与B16.SIY肿瘤一样，在TdLN或脾(未示出)中没有H-2K^b/SIY特异性CD8 T细胞共表达4-1BB和LAG-3(未示出)(图3D)。与B16.SIY和MC38.SIY肿瘤不同，没有观察到4-1BB⁺LAG-3⁺H-2K^b/SIY特异性CD8⁺ TIL的明显富集(图3D和图3E)。这些数据表明肿瘤抗原特异性本身不能确定功能障碍，并且这是进展性肿瘤的微环境所特有的特征。

作为确定肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞需要4-1BB⁺LAG-3⁺表型的第三种措施，将从2C/Rag2^–/–和P14/Rag2^–/–小鼠分离出的先天性标记的2C和P14转基因(Tg)T细胞转移到荷有肿瘤的宿主中。2C TCR特异于B16.SIY肿瘤细胞表达的SIY模型抗原，而P14是特异于LCMV来源的gp_33-41表位的无关TCR；两种TCR都是H-2K^b受限的。在肿瘤接种后7天通过尾静脉将2C和P14 Tg CD8⁺ T细胞进行转移。转移后7天，提取肿瘤和TdLN，并分析转移群体的表型谱。该***允许分析在相同肿瘤微环境中具有确定的抗原特异性的两个T细胞群体，以及多克隆宿主CD8⁺ T细胞。与P14 T细胞相比，2C T细胞在肿瘤微环境中更有效地募集和扩增，并且包含较大部分的总CD8⁺TIL群体(图3F)。在2C T细胞中，几乎所有细胞均表达LAG-3和/或4-1BB，而这仅适用于较少百分比的P14细胞(图3G和图3H)。与SIY-K^b五聚体分析一致，在TdLN中未观察到LAG-3和4-1BB在2C T细胞上的共表达。总之，这些结果证明了4-1BB⁺LAG-3⁺表型是肿瘤抗原特异性TIL在肿瘤进展条件下的特性。

表达LAG-3和4-1BB的CD8⁺ TIL表现出IL-2产生缺陷但产生IFN-γ和Treg-募集趋化因子

基于体外T细胞无反应性模型导致鉴定Egr2作为重要调节因子的特征，在本文实施方案的开发过程中进行实验以确定肿瘤抗原特异性4-1BB⁺LAG-3⁺ CD8⁺ TIL群体在其产生IL-2的能力方面是否为功能障碍的。为此，将每个亚群分选，并用抗CD3和抗CD28 mAb刺激，并通过qRT-PCR和ELISA分析IL-2产量。因为几乎所有的CD8⁺TIL显示激活的表型，所以将CD8⁺CD44⁺脾细胞用作阳性对照。的确，4-1BB⁺LAG-3⁺细胞显示为与4-1BB^–LAG-3^–群体相比降低100倍的Il-2mRNA，以及降低多至40倍的IL-2蛋白水平(图4A和图4B)。作为第二种方法，通过利用Egr2-GFP报告小鼠来检查Egr2^高TIL(其也大部分为4-1BB⁺LAG-3⁺)。确实，与Egr2-GFP^低细胞相比，离体刺激的Egr2-GFP^高CD8⁺ TIL也表现出减少的Il-2转录物(图4C)。作为最终方法，将先天性标记的2C T细胞静脉内过继转移到荷瘤宿主中，并在7天后从肿瘤和TdLN中回收2C T细胞。与从TdLN分离的2C CD44⁺ T细胞相比，从肿瘤中分离的2C T细胞表现出降低的产生Il-2转录物的能力，该能力的水平与4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL的水平相当(图4D)。在慢性感染模型中，已经提出PD-1的表达以鉴定本质上功能障碍或“耗尽”的CD8⁺ T细胞。为了确定单独的PD-1是否足以鉴定缺乏产生IL-2的能力的细胞，分离出缺乏LAG-3和4-1BB表达的CD8⁺TIL，并测试PD-1⁺部分产生IL-2的能力。在第14天和第21天，约10％的CD8⁺ TIL为4-1BB^–LAG-3^–PD-1⁺(图4E和图4F)。在离体刺激后，该群体保留了以与4-1BB^–LAG-3^–细胞相当的水平产生ll-2mRNA的能力(图4G)。这些结果表明单独的PD-1表达不足以鉴定肿瘤微环境中功能障碍的TIL。

为了进一步检查肿瘤进展期间的功能改变，在TCR刺激后测试IL-2、IFN-γ和TNF-α的蛋白质水平。由于CD8⁺ TIL丧失产生细胞因子的能力被认为是被报道为在进入肿瘤微环境后起始的时域过程(Waugh等人，2016；Schietinger等人，2016；这些文献全文以引用方式并入本文)或者在慢性LCMV模型中30天后逐渐发生的(Wherry等人，2007；该文献全文以引用方式并入本文)，所以在第7天、第14天、第21天和第28天测试细胞因子产生。4-1BB⁺LAG-3⁺群体早在第7天就丧失了产生IL-2的能力，而4-1BB^–LAG-3⁺群体在在第7天与第14天之间丧失IL-2产生(图5A)。4-1BB^–LAG-3^–群体在任何测试的时间点都没有丧失产生IL-2的能力(图5A)，支持该群体不具有肿瘤抗原特异性并且分化为功能障碍状态是抗原依赖性过程的观点(Schietinger等人，2016；该文献全文以引用方式并入本文)。4-1BB⁺LAG-3⁺群体与其阴性对应物相比，在第7天后的所有时间点产生更多的IFN-γ，尽管随着时间推移IFN-γ产量略微减少。虽然IFN-γ的增加维持到稍后的时间点，但到第28天TNF-α的产生丧失(图5A)。

在本文的实施方案的开发过程中进行实验以在不进行体外重新刺激的情况下直接评估肿瘤中细胞因子的产生，这可以更接近地反映哪些T细胞正在接受原位TCR刺激。每个T细胞群体在不进行任何培养的情况下直接离体分选，并通过qRT-PCR测量mRNA水平。与4-1BB^–LAG-3^–细胞相比，从4-1BB⁺LAG-3⁺亚群中观察到了Ifn-γ和Gzmb转录物的增多，以及略有下降的Tnf-α水平(图5B)。在通过细胞内细胞因子染色分析之前，通过用布雷菲德菌素A注射肿瘤来确认原代TIL中IFN-γ的产生。与mRNA表达一致，4-1BB⁺LAG-3⁺群体产生显著更大量的IFN-γ蛋白质(图5C)。因此，4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL并非完全缺乏功能，因为尽管缺乏IL-2的产生，它们仍继续产生IFN-γ。该表型与体外T细胞无反应性模型(Jenkins等人，1987；该文献全文以引用方式并入)一致。

为了测试4-1BB⁺LAG-3⁺是群体是否仍然保留细胞毒性能力，通过在分选后直接将抗CD3结合的P815肥大细胞瘤靶细胞与不同的CD8⁺ TIL亚群共培养来执行重定向裂解。从第14天肿瘤分离的4-1BB⁺LAG-3⁺ CD8⁺ TIL能够以与体外致敏的OT-I细胞相当的功效来裂解靶细胞。从第21天肿瘤分离的4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL仍然能够裂解靶细胞，尽管与致敏的OT-I细胞相比程度较小(图5D)。

肿瘤中的CD8⁺ T细胞可以是将FoxP3⁺调节性T细胞(Treg)募集到肿瘤微环境中的趋化因子CCL22的来源(Spranger等人，2013；该文献全文以引用方式并入)。此外，趋化因子Ccl1是无反应性的T细胞中的Egr2靶标(Zheng等人，2013；该文献全文以引用方式并入)，并且已经认为CCL1也有助于体内肿瘤环境中的Treg募集(Hoelzinger等人，2010；该文献全文以引用方式并入)。然而，是否肿瘤中的所有CD8⁺ T细胞都产生这些趋化因子，或者所述趋化因子是否仅由T细胞亚群产生尚未确定。为了解决这个问题，通过qRT-PCR直接离体分析CD8⁺ TIL表型亚群的Ccl1和Ccl22 mRNA表达。的确，4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL群体与其阴性对应物或脾CD8⁺CD44⁺ T细胞相比产生显著更多的Ccl1和Ccl22(图4K)。作为对照，发现不同趋化因子Ccl5的表达没有差异表达。

总之，这些数据显示4-1BB和LAG-3的共表达描绘了肿瘤抗原特异性CD8⁺ TIL缺乏产生IL-2的能力，但仍保留产生IFN-γ、体外杀伤靶细胞和分泌能够进行Treg募集的趋化因子的能力。鉴于IFN-γ负责肿瘤微环境中PD-L1和IDO的上调，并且由CD8⁺ TIL产生的趋化因子有助于Treg募集的事实(Spranger等人，2013；该文献全文以引用方式并入)，这些数据表明4-1BB⁺LAG-3⁺群体有助于肿瘤微环境中限制抗肿瘤免疫功效的免疫抑制机制的网络。

基因表达谱分析显示CD8⁺4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL表达广泛的额外共刺激和共抑制受体

在具有定义肿瘤抗原特异性功能障碍的CD8⁺ TIL的表面标记物的情况下，在本文的实施方案的开发期间进行实验以比较该群体的基因表达谱与功能障碍的CD8⁺ T细胞的其他公开的表达谱，以确定在这种功能障碍状态下的细胞中调节或差异表达的基因。为此目的，对来自利用鼠CT26肿瘤模型(Waugh等人，2016；该文献全文以引用方式并入)和LCMV“耗竭的”GP33特异性CD8⁺ T细胞(Doering等人，2012；该文献全文以引用方式并入)的研究的“功能障碍的”4-1BB⁺LAG-3⁺ CD8⁺ TIL、“功能减退的”CD8⁺ TIL的转录谱进行交叉研究比较。结果描绘于表2中。仅考虑每个研究中相对于对照独立地增加2倍的基因。发现与耗尽的T细胞谱相比，在功能障碍的TIL数据集与之前公开的功能减退的CD8⁺ TIL数据之间共享超过2倍数目的基因(图6A)。此外，秩-秩超几何重叠(RRHO)分析表明，与病毒诱导耗竭的CD8⁺T细胞的基因表达谱相比，当前功能障碍的TIL的基因表达谱与公布的功能减退的CD8⁺ TIL的基因表达谱之间具有更大的统计学上显著的重叠(图10A)和更大的相关性(图10B)，表明相较于慢性病毒感染，从肿瘤中分离的CD8⁺ T细胞之间存在更相似的分子程序。

表2.CD8⁺4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL中差异调节的基因

*Log2倍数变化＝log2(4+L+/4–L–)

为了研究这三个群体之间的分子途径，将基因本体网络分组成节点并确定每个节点内最重要的途径(图6A)。在我们的功能障碍的T细胞数据集与已公开的功能减退的T细胞数据集之间共享的基因本体(GO)项在细胞周期基因中极其富含的，与观察到功能障碍的群体主要是Ki67⁺是一致的。在功能障碍和耗竭的基因集之间共享的GO项包括效应程序，诸如对细胞杀伤的调节、趋化、干扰素-γ产生。在功能减退和耗竭的基因集之间共享的GO项由细胞周期途径、对淋巴细胞的负性调节和干扰素-γ产生组成。这些数据表明，虽然一些保守的分子程序可能存在于这些功能障碍的分化状态中，但许多途径可在慢性病毒感染与肿瘤环境中之间差异调节。

虽然许多抑制性受体，包括Pdcd1(PD-1)、Havcr2(TIM-3)、Cd244(2B4)、Klre1和Lag3在内，在所有数据集之间共享；但是共刺激受体Tnfrsf4(OX-40)和Tnfrsf9(4-1BB)在功能障碍和功能减退的CD8⁺TIL数据集中上调。因此，为了富集肿瘤特异性CD8⁺ TIL上的潜在标志物和治疗靶标，对4-1BB⁺LAG-3⁺ CD8 TIL群体的完整细胞表面表型进行了表征。通过比较不同的CD8⁺ TIL亚群，发现了几种另外的上调共刺激受体：Tnfrsf18(GITR)、Nkg2d(KLRK1)和Cd27。Nrp1(神经纤毛蛋白-1)的转录物也被高度表达，该转录物编码参与CD4⁺Treg功能(Sarris等人，2008；该文献全文以引用方式并入)的细胞表面受体蛋白。在肿瘤接种后第7天、第14天和第21天时通过流式细胞术证实了许多这些分子的表达(图6C)。将所述分析扩展为包括共刺激分子ICOS和CD160和具有Ig和ITIM结构域(TIGIT)的抑制性受体T细胞免疫受体，这是因为ICOS和CD160接近截止值并且基因阵列中没有针对TIGIT的探针存在。此外，最近的报道表明，靶向这些受体可以在癌症鼠模型中为治疗性的(Johnston等人，2014；Fan等人，2014；该文献全文以引用方式并入)。PD-1、TIGIT、TIM-3、CD27和NRP1在4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL群体中的大部分中表达，并且表达随着时间推移被维持。2B4、CD160、CTLA4、OX-40和GITR细分了4-1BB⁺LAG-3⁺群体中的较小部分。在该3周的时间范围内，几种抑制性受体2B4、TIM3和CD160的表达增加，而共刺激受体ICOS和OX-40的表达降低(图6C)。

为了解决功能障碍的CD8⁺ TIL是终末分化的短期效应细胞还是记忆样细胞，表达KLRG-1和IL-7Rα(Joshi等人，2007)。CD8⁺ TIL中的大部分是对KLRG-1表达呈阴性的，并且在4-1BB⁺LAG-3⁺和4-1BB^–LAG-3^–群体之间没有差异。然而，4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL中的大部分与它们的阴性对应部分相比不表达IL-7受体(IL-7Rα)(图6D)。这些结果表明，对肿瘤微环境中表达的抗原没有明显特异性的4-1BB^–LAG-3^–TIL是更记忆样的，但同时肿瘤抗原特异性LAG-3⁺4-1BB⁺子集尚未完全获得末端效应表型。

CD8⁺4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL中差异调节的基因的功能相关性

表2中的基因阵列结果提供了表征CD8⁺4-1BB⁺LAG-3⁺ TIL的基因的列表。该列表包括抗肿瘤免疫的治疗靶标和其他标志物。在本文的实施方案的开发期间进行实验以测试这些另外的靶标/标记物的功能相关性(图11)。数据表明阵列已经使用敲除小鼠(例如，PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205和TMEM126A、CRTAM、Sema7a等)鉴定了免疫疗法的靶标。实验证明Nrn1和CRTAM是抗肿瘤免疫应答的负调节因子，因为缺乏这些分子中的任一种的敲除小鼠在体内显示出改善的免疫介导的肿瘤控制。相比之下，Sema7a是抗肿瘤免疫应答的正调节因子，因为缺乏该分子的敲除小鼠在体内显示出减少的免疫介导的肿瘤控制(图11)。这些实验表明，Sema7a信号传导的激动剂和Nrn1和/或CRTAM的拮抗剂应该是治疗癌症的有用治疗剂。

靶向4-1BB和LAG-3在体内发挥抗肿瘤活性并使CD8⁺ TIL的功能和表型组成归一化

在开发本文的实施方案期间进行实验以评估靶向这些受体是否具有治疗效用。为此，在荷有已建立的B16.SIY肿瘤的小鼠中单独或与阻断性抗LAG-3 mAb组合地施用激动性抗4-1BB mAb。虽然单独的每种抗体治疗具有如由较慢的肿瘤生长所反映的一些治疗效果，但该组合为特别有效的(图7A)。对肿瘤微环境的分析表明，使用联合治疗改善的肿瘤控制伴随着特异于SIY抗原的CD8⁺ TIL的数量增加(图7B)，这与先前报道的使用抗PD-L1+抗CTLA-4 mAb的结果一致(Spranger等人，2014b；Twyman-Saint Victor等人，2015；这些文献的全文以引用方式并入)。

接下来检查抗4-1BB+抗LAG-3 mAb的治疗效果是否与稳定状态下限定功能障碍的T细胞的表型标志物的丧失相关。由于担心重新分析T细胞的LAG-3和4-1BB表达可能是有问题的，因为施用的Ab在理论上可以调控来自细胞表面的靶受体，所以利用如上所述通过基因表达谱来鉴定的另外受体的协调表达。对大量TIL亚群的初步分析显示，在抗LAG-3+抗4-1BB治疗后NRP1和2B4的表达降低(数据未显示)。分析通过五聚体染色鉴定的2B4和NRP1在SIY反应性CD8⁺TIL上的共表达。在抗4-1BB+和抗LAG-3 mAb治疗后观察到了2B4和NRP1的共表达的2.7倍降低(图7C)，表明与T细胞功能障碍相关的表面表型的丧失。为了确定这种变化是否伴随向效应表型的转变，检查了KLGR-1的表达。实际上，治疗后在SIY反应性TIL上观察到KLGR-1表达显著增加，并且观察到在KLRG-1^高IL-7RΑ^低群体中增加了3.7倍(图7D)。

为了消除用抗LAG-3+抗4-1BB mAb治疗不改变已经在肿瘤内的T细胞的表型，而是支持从次级淋巴器官中募集新致敏的功能性T细胞的可能性，利用S1PR抑制因子FTY720，该S1PR抑制因子FTY720防止T细胞从***中流出(Halin等人，2005；该文献全文以引用方式并入)。基于抗PD-L1的免疫疗法的功效在FTY720存在下被保留，支持TIL的再功能化是主要作用机制(Spranger等人，2014a；该文献全文以引用方式并入)。在肿瘤接种后第6天，在抗LAG-3+抗4-1BB治疗开始前24小时开始FTY720施用，并且每天持续直至在第14天进行TIL分析。在同一时间点分析的外周血显示出循环T细胞的显著耗尽(图9)。尽管有循环T细胞的该丧失，2B4和NRP1的下调以及向KLRG1^高IL-7RΑ^低表型的转变仍被保留(图7E和图7F)。

为了检查TIL的功能恢复，在治疗后第14天从B16.SIY肿瘤中分选KLRG-1^低IL-7RΑ^低和KLRG-1^高IL-7RΑ^低CD8⁺ TIL群体，并在体外重新刺激后分析IL-2。确实，KLRG-1^低IL-7RΑ^低和KLRG-1^高IL-7RΑ^低群体表现为在刺激后产生IL-2的能力增强(图7G)。Il-2mRNA的相对水平在两个CD8⁺ TIL群体和对照CD8⁺CD44⁺ TdLN T细胞之间是相当的。总之，这些数据表明抗4-1BB/抗LAG-3组合治疗诱导表型谱的显著变化，并促进已经存在于肿瘤微环境中的肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞的功能恢复。

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序列表

<110> 芝加哥大学(THE UNIVERSITY OF CHICAGO)

<120> 肿瘤微环境中功能障碍的抗原特异性CD8+ T

细胞

<130> UCHI-35120/WO-1/ORD

<150> US 62/447,199

<151> 2017-01-17

<160> 60

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

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ccgatgtcca tcacattctc t 21

<210> 57

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成引物/探针

<400> 57

ttgagatcca tgccgttg 18

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成引物/探针

<400> 58

tggggaatgc attttaccat 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成引物/探针

<400> 59

agcagcagct attggagacc 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成引物/探针

<400> 60

gcagagggtg acggatgtag 20

Claims (24)

1.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用特异性靶向功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞的剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有实体肿瘤癌症。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述肿瘤允许T细胞浸润，但对免疫疗法具有抗性。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述肿瘤环境包含功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞。

5.如权利要求1的方法，其包括使所述功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞与抗4-1BB和/或抗LAG3剂接触。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述抗4-1BB和/或抗LAG3剂是抗体、抗体片段或抗体模拟分子。

7.如权利要求1所述的方法，其还包括共施用另外的治疗剂。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述另外的治疗剂是化学治疗剂或免疫治疗剂。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述另外的治疗剂是选自由以下项组成的列表的免疫治疗剂：基于细胞的疗法、单克隆抗体(mAb)疗法、细胞因子疗法以及辅助治疗。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述免疫治疗剂是选自由以下项组成的列表的mAb疗法：抗CTLA-4单克隆抗体和/或抗PD-L1单克隆抗体。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述免疫治疗剂是选自由以下项组成的列表的基于细胞的疗法：树突细胞疗法和T细胞疗法。

12.如权利要求7所述的方法，其中所述另外的治疗剂靶向表2中列出的受体中的一种。

13.如权利要求7所述的方法，其中所述另外的治疗剂靶向PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205、TMEM126A、CRTAM和/或Sema7a。

14.如权利要求1所述的方法，其包括使所述功能障碍的肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞与靶向表2中列出的所述受体中的一种的治疗剂接触。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述治疗剂靶向PD-1、TIM-3、OX-40ICOS、TIGIT、CD244、TNFRSF18、Nrn1、Nrp1、KLRG1、GM156、GPNMB、GPR65、TMEM205、TMEM126A、CRTAM和/或Sema7a。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述治疗剂是抗Nrn1抗体、抗体片段或抗体模拟分子。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述治疗剂是抗Sema7a抗体、抗体片段或抗体模拟分子。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述治疗剂是抗CRTAM抗体、抗体片段或抗体模拟分子。

19.一种组合物，其包含：(a)抗4-1BB剂、抗LAG-3剂、抗Nrn1剂、抗Sema7a剂和抗CRTAM剂中的一种或多种；和(b)免疫治疗剂，所述组合物被配制成用于向受试者治疗递送。

20.如权利要求19所述的组合物，其中所述抗4-1BB剂、抗LAG-3剂、抗Nrn1剂、抗Sema7a剂和/或抗CRTAM剂是抗体、抗体片段或抗体模拟分子。

21.一种方法，其包括：(a)测试来自细胞群体的CD8⁺T细胞以确定它们是否共表达LAG-3和4-1BB；和(b)施用抗Nrn1剂、抗Sema7a剂和抗CRTAM剂。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述抗Nrn1剂、抗Sema7a剂和/或抗CRTAM剂是抗体、抗体片段或抗体模拟分子。

23.如权利要求21所述的方法，其中体外执行所述测试。

24.一种鉴定功能障碍的T细胞的方法，所述方法通过测试所述细胞共表达4-1BB和LAG-3来进行。

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