CN114561389A - Vrk1表达抑制剂及其应用 - Google Patents

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CN114561389A CN202210255062.1A CN202210255062A CN114561389A CN 114561389 A CN114561389 A CN 114561389A CN 202210255062 A CN202210255062 A CN 202210255062A CN 114561389 A CN114561389 A CN 114561389A
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胡宝英
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Nantong Tumor Hospital
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了VRK1表达抑制剂及其应用。shRNA分子，其序列中正义链序列为5'‑GCAAGGAACCTGGTGTTGA‑3'(SEQ ID NO：1)，反义链序列为5'‑TCAACACCAGGTTCCTTGC‑3'(SEQ ID NO：2)。重组质粒或构建体，包含SEQ ID NO：3序列，或由前述的shRNA分子与质粒组成。质粒在制备防治膀胱癌药物中的应用。质粒在制备防治VRK1过表达诱发疾病药物中的应用。防治膀胱癌药物，包含前述的VRK1基因表达抑制剂。本发明提供了一种新的shRNA分子，并研究发现其对VRK1基因表达具有较好的抑制作用；并且研究发现其对肿瘤(如膀胱癌)具有较好的治疗作用，可以对肿瘤细胞起到较好的调节作用。同时，也发现通过抑制VRK1基因表达对防治膀胱癌具有较好的治疗作用，能够控制膀胱癌细胞的转型。

Description

VRK1表达抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及VRK1表达抑制剂及其应用。
背景技术
VRK1是一种多功能蛋白，是牛痘相关激酶(VRK)家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的成员。它大部分位于核内具有非典型活性的Ser-Thr激酶，核小体激酶或染色质激酶，可以与不同的染色质蛋白直接稳定的相互作用，并与细胞周期进入、促进DNA损伤修复、耐药有密切关系；小部分位于质膜，与细胞迁移有关。它调控多种转录因子，包括SOX2、ATF2、p53和c-Jun。研究表明，VRK1与SOX2形成复合物共同激活CCND1的表达，促进细胞周期进程。电离辐射产生的DNA损伤会触发VRK1对NBS1的磷酸化，从而促进DNA修复过程。阿霉素诱导VRK1和53BP1之间形成复合物，从而启动DNA损伤修复，使细胞产生耐药。VRK1过表达在质膜上和PAK1-paxillin信号复合物的一部分，可通过调控转录抑制因子snail、slug和twist1促进乳腺癌细胞的转移。现有研究表明，过表达VRK1会诱发一些疾病，通过控制VRK1能够对相应疾病起到治疗作用，但VRK1作为膀胱癌治疗靶点的研究仍然是空白。
VRK家族的三个成员的结构已经确定，他们的激酶折叠有几个结构差异，预测他们应该对目前可用的大多数抑制剂不敏感。用针对VRK1 mRNA的shRNA可以抑制VRK1的翻译，并且毒性低，是极具潜能的靶向干预策略。
每年有超过43万名患者被诊断出患有膀胱癌，其中约16.5万人将因此死亡。虽然根治性全膀胱切除手术的应用在生存率方面已取得长足的进步，但其5年生存率仍然相对较低。术后肿瘤的复发和进展是影响这些患者预后的主要临床事件。近期分子谱研究证实其实一类具有高体细胞突变率的疾病，肿瘤细胞膜上表达蛋白的高突变负荷形成了多种肿瘤抗原，因此目前仍缺乏有效的临床治疗方案彻底杀死并清除肿瘤细胞，寻找能提示膀胱癌预后指标以及能一次干预多个肿瘤细胞行为学特征的靶点至关重要。
发明内容
针对上述问题，本发明提供VRK1表达抑制剂及其应用，主要涉及一种新的shRNA分子，以及在VRK1中的调节作用，同时还要解决肿瘤(包括膀胱癌)的防治调节问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
shRNA分子，其序列中
正义链序列为5'-GCAAGGAACCTGGTGTTGA-3'(SEQ ID NO：1)，
反义链序列为5'-TCAACACCAGGTTCCTTGC-3'(SEQ ID NO：2)。
一些方式中，其具有如下序列：
5'-tGCAAGGAACCTGGTGTTGAttcaagagaTCAACACCAGGTTCCTTGCtttttggaaac-3'(SEQID NO：3)。
重组质粒或构建体，包含SEQ ID NO：3序列，或由前述的shRNA分子与质粒组成。
VRK1基因表达抑制剂，至少包含下述之一
a.前述shRNA分子；
b.前述重组质粒。
VRK1基因沉默试剂盒，包含前述的抑制剂。
VRK1基因表达抑制剂在制备防治膀胱癌药物中的应用。
一种方式中，VRK1基因表达抑制剂至少为shRNA或siRNA或miRNA或多肽。
一些方式中，所述VRK1基因表达抑制剂至少包含下述之一
a.前述shRNA分子；
b.前述重组质粒。
一些方式中抑制剂对膀胱癌调节至少为下述任一
i)抑制膀胱癌细胞增殖、克隆形成；
ii)抑制膀胱癌细胞转移、侵袭。
质粒在制备防治膀胱癌药物中的应用，其中，所述质粒至少为下述之一
a.前述任一shRNA分子；
b.前述重组质粒。
质粒在制备防治VRK1过表达诱发疾病药物中的应用，其中，所述质粒至少为下述之一
a.前述任一shRNA分子；
b.前述重组质粒。
质粒在制备抑制肿瘤细胞向间质型转变疾病药物中的应用，其中，所述质粒至少为下述之一
a.前述任一shRNA分子；
b.前述重组质粒。
防治膀胱癌药物，包含前述的VRK1基因表达抑制剂。
VRK1蛋白表达抑制剂，包含下述中至少两种
I).siVRK1:5′-GCAAGGAACCTGGTGTTGA-3′，
5′-TCAACACCAGGTTCCTTGC-3′；
II).shVRK1-1:5′-tGAAAGAGAGTCCAGAAGTAttcaagagaTACTTCTGGACTCTCTTTCtttttggaa ac-3’(SEQ ID NO：4)；
III).shVRK1-2:5′-tGCAAGGAACCTGGTGTTGAttcaagagaTCAACACCAGGTTCCTTGCtttttggaaac-3′(SEQ ID NO：3)。
前述混合型VRK1蛋白表达抑制剂在制备防治膀胱癌药物中的应用。
术语“构建体”是指含有相应特定分子序列且用于构建质粒的中间体，比如构建重组质粒或蛋白表达载体。
术语“shVRK1”是指VRK1特异性shRNA分子。
术语“基因(蛋白)过表达诱发疾病”是指过表达对该病起到了致病性，并且可以通过抑制该种过表达机理实现对相应病症的抑制。
术语“防治”是指对患者进行的意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍的医疗管理。该术语包括积极治疗，即治疗特别指向疾病、病理状况或障碍的改善，并且还包括病因治疗，即治疗指向去除相关疾病、病理状况或障碍的病因。此外，该术语还包括姑息治疗，即为减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或障碍而设计的治疗；预防性治疗，即旨在尽量最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍发展的治疗；和支持治疗，即用于补充指向相关疾病、病理状况或障碍的改善的另一种特定疗法的治疗。
本发明的有益效果是：
提供了一种新的shRNA分子，并研究发现其对VRK1基因表达具有较好的抑制作用；并且研究发现其对肿瘤(如膀胱癌)具有较好的治疗作用，可以对肿瘤细胞起到较好的调节作用。同时，也发现通过抑制VRK1基因表达对防治膀胱癌具有较好的治疗作用，能够控制膀胱癌细胞的转型。
附图说明
图1为采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹实验检测膀胱癌和癌旁VRK1的表达水平；
图2为采用shRNA干扰的方式特异性抑制膀胱癌细胞系中VRK1基因的表达；
图3为CCK-8实验验证shVRK1抑制膀胱癌增殖；
图4为克隆形成实验验证shVRK1能抑制膀胱癌增殖；
图5为验证shVRK1能抑制膀胱癌转移能力；
图6为Transwell侵袭实验验证shVRK1能抑制膀胱癌侵袭；
图7为Western Blot实验验证shVRK1能抑制肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)信号通路中间质型标志性分子的表达。
具体实施方式
本部分第一方面介绍shRNA分子和相应质粒：
其一，涉及shRNA分子，其序列中
正义链序列为5'-GCAAGGAACCTGGTGTTGA-3'(SEQ ID NO：1)，
反义链序列为5'-TCAACACCAGGTTCCTTGC-3'(SEQ ID NO：2)。
正义链和反义链通过环形loop序列连接，由启动子控制，最后连上转录终止子。
一些方式中，其一具体的完整序列为如下序列：
5'-tGCAAGGAACCTGGTGTTGAttcaagagaTCAACACCAGGTTCCTTGCtttttggaaac-3'(SEQID NO：3)。
其二，涉及重组质粒或构建体，包含SEQ ID NO：3序列，或由前述的shRNA分子与质粒组成；
其中，重组质粒，就经过重组后形成的表达载体与目标序列组合的质粒。构建体为中间物，其负载有前述序列，但是还未能形成直接应用的质粒，仍需进一步处理，其中一种方式可为制备重组质粒过程中负载目标序列用于与质粒连接中间体。
本部分第二方面介绍shRNA分子及相应质粒和相关产品：
VRK1基因表达抑制剂，至少包含下述之一
a.前述shRNA分子；
b.前述重组质粒。
a\b两组分可以择其一也可共存，并且针对VRK1基因表达起到抑制作用。
VRK1基因沉默试剂盒，包含前述的VRK1基因表达抑制剂。基因沉默试剂盒主要用于对目标基因进行沉默，其一种应用场景为商业性实验中控制变量。
防治膀胱癌药物，包含前述的VRK1基因表达抑制剂。
本部分第三方面介绍shRNA分子及相应质粒的一些应用和相关产品应用：
其一，VRK1基因表达抑制剂在制备防治膀胱癌药物中的应用。其通过抑制VRK1基因表达来实现对膀胱癌中机理的调节。
一种方式中，VRK1基因表达抑制剂至少为shRNA或siRNA或miRNA或多肽。
更具体的是，所述VRK1基因表达抑制剂至少包含下述之一
a.前述shRNA分子；
b.前述重组质粒；
c.其他现有的抑制剂，如多肽等其他现有研究论证可行的抑制剂；在本发明已经论证抑制VRK1基因表达能防治膀胱癌前提下，针对其他类型抑制剂不做赘述。
VRK1多肽1–多肽1可以作为无活性多肽序列，拮抗内源性蛋白的激酶功能，使其无法对下游蛋白进行磷酸化修饰，其氨基酸序列为：
WKVGLPIGQGGFGCIYLADMNSSESVGSDAPCVVKVEPSDNGPLFTELKFYQRAAKPEQIQKWIRTRKLKYLGVPKYWGSGLHDKNGKSYRFMIMDRFGS DLQKIYEANA KRFSRKTVLQLSLR；
VRK1多肽2–多肽2可以与内源性VRK1竞争性结合下游效应分子，从而阻断其与下游分子的结合抑制其活性，其氨基酸序列为：
KPGEIAKYMETVKLLDYTEKPLYENLRDILLQGLKAIGSKDDGKLDLSVVENGGLKAKTITKKRKKEIEESKEPGVEDTEWSNTQTEEAIQTRSRTRKRV QK。
一些方式中抑制剂对膀胱癌调节作用至少为下述任一
i)抑制膀胱癌细胞增殖、克隆形成；
ii)抑制膀胱癌细胞转移、侵袭。
其二，质粒在制备防治膀胱癌药物中的应用，不严格限定必须通过抑制VRK1基因表达，其中，所述质粒至少为下述之一
a.前述重组所述shRNA分子；
b.前述重组质粒。
其三，质粒在制备防治VRK1过表达诱发疾病药物中的应用，其中，所述质粒至少为下述之一
a.前述任一shRNA分子；
b.前述重组质粒。
其四，质粒在制备抑制肿瘤细胞向间质型转变疾病药物中的应用，其中，所述质粒至少为下述之一
a.前述任一shRNA分子；
b.前述重组质粒。
本部分第四方面对一种混合型VRK1蛋白表达抑制剂作出介绍：
VRK1蛋白表达抑制剂，包含下述中至少两种
I).siVRK1:5′-GCAAGGAACCTGGTGTTGA-3′，
5′-TCAACACCAGGTTCCTTGC-3′；siRNA为直接化学合成，其可直接使用或与转染试剂混合使用。
II).shVRK1-1:5′-tGAAAGAGAGTCCAGAAGTAttcaagagaTACTTCTGGACTCTCTTTCtttttggaa ac-3’(SEQ ID NO：4)；
III).shVRK1-2:5′-tGCAAGGAACCTGGTGTTGAttcaagagaTCAACACCAGGTTCCTTGCtttttggaaac-3′(SEQ ID NO：3)；两个shRNA一般构建成质粒与其他物质混合。尤其是两个shRNA联用效果更优，效果优于两者独立使用产生效果之和。
前述混合型VRK1蛋白表达抑制剂在制备防治膀胱癌药物中的应用。
通过联用后，其能够产生的效果优于任一种，且使得抑制效果显著改善，甚至优于原单独使用效果之和。
本部分第五方面结合部分具体的研究项目作出介绍：
实验一：本实施例采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹实验检测膀胱癌和癌旁VRK1的表达水平。
膀胱癌患者癌旁和癌术后新鲜组织10对。以1ml Trizol裂解100mg组织的比例，提取组织总RNA。将1ug的总RNA逆转录为cDNA并进行实时荧光定量聚合酶链反应分析VRK1的mRNA在癌旁和癌组织中的表达。引物：VRK1，5'-CTTCAGAGTCAGTTGGCAGTG-3'；5'-CTTCAGCTTACGGGTACGAAT-3'；GAPDH，5'-CAT GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA-3'。
以1ml蛋白裂解液裂解100mg组织的比例，提取组织总蛋白。以100ug的蛋白上样量进行蛋白免疫印迹实验分析VRK1的蛋白在膀胱癌癌旁和癌组织中的表达。
结果分析：如图1所示，VRK1的mRNA水平和蛋白水平在膀胱癌组织中均表达明显高于癌旁组织。
实验二：本实施例采用siRNA和shRNA两种干扰的方式特异性抑制膀胱癌细胞系中VRK1基因的表达。
构建具体序列如下：
siVRK1:5′-GCAAGGAACCTGGTGTTGA-3′，
5′-TCAACACCAGGTTCCTTGC-3′；
shVRK1-1:5′-tGAAAGAGAGTCCAGAAGTAttcaagagaTACTTCTGGACTCTCTTTCtttttggaaac-3’；
shVRK1-2:5′-tGCAAGGAACCTGGTGTTGAttcaagagaTCAACACCAGGTTCCTTGCtttttggaaac-3′；
shRNA-NC:5′-tCAGTCGCGTTTGCGACTGGttcaagagaCCAGTCGCAAACGCGACTGtttttggaaac-3′。
在6孔板中融合度为50％-70％的T24和5637细胞系中，每孔分别转染(shRNA-NC、siVRK1、shVRK1-1和shVRK1-2)。转染8h之后将含有复合物的培养基弃去，更换新的培养基。转染后第三天，收集细胞样品利用蛋白免疫印迹实验分析VRK1的表达。
结果分析：如图2所示，shVRK1-1、shVRK1-2组细胞(T24、5637)的VRK1蛋白表达量明显低于对照shRNA-NC、siVRK1、shVRK1-1组。说明shVRK1-1和shVRK1-2序列对VRK1基因的抑制效果均优于siVRK1小干扰片段。说明两种干扰手段中，shRNA的方式比siRNA的方式效果更好。
实验三：shVRK1-2抑制膀胱癌增殖和克隆形成。
①CCK-8实验证明shVRK1-2抑制膀胱癌增殖。
将膀胱癌细胞T24和5637分别以2000个/孔的密度接种于96孔培养板，分别转染shRNA-NC、shVRK1-1和shVRK1-2，分别在0h、20h、40h、60h、80h后每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育2小时后，选择波长450nm，在酶联免疫检测仪上测定不同时间点每个孔的光吸收值，记录结果。吸收值大小反映了细胞活性。
结果显示：如图3所示，与对照组(shRNA-NC)和实验组(shVRK1-1)相比，实验组(shVRK1-2)显著抑制了T24和5637细胞的增殖。
②克隆形成实验证明shVRK1-2能抑制膀胱癌增殖。
将转染shRNA-NC、shVRK1-1和shVRK1-2的对数期膀胱癌细胞T24和5637消化成单个细胞悬液，每组分别取100个细胞接种于含2.5ml 37℃预温培养液的6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置于37℃、5％CO2培养箱中，静置培养2-3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃上清，PBS小心清洗2遍，加甲醇固定15min，弃甲醇，加Giemsa染色10-30min，用流水缓慢洗去染色液，静置干燥。显微镜拍照，计数大于10个细胞的克隆数。
结果显示：如图4所示，与对照组(shRNA-NC)和实验组(shVRK1-1)相比，实验组(shVRK1-2)显著抑制了T24和5637细胞的克隆形成能力。且针对T24细胞抑制能力明显优于其他。
实验四：shVRK1-2能抑制膀胱癌的转移和侵袭。
①将转染shRNA-NC、shVRK1-1和shVRK1-2的对数期膀胱癌细胞T24和5637进行血清饥饿12h后，消化成单细胞悬液用含0.1％BSA的无血清培养液重悬成2×105个/ml，取细胞悬液200ul接种至Transwell的上室，下层培养液含10％FBS完全培养基。培养板置于37℃的CO2培养基中，培养24h。取出小室，PBS清洗3遍，用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，使用4％多聚甲醛固定20min，0.1％结晶紫染色15min后，风干。倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数5个视野，取平均值，统计分析。
结果显示：如图5所示，与对照组(shRNA-NC和实验组(shVRK1-1))相比，实验组(shVRK1-2)显著抑制了T24和56373细胞的转移能力。
②Transwell侵袭实验证明shVRK1能抑制膀胱癌侵袭。
实验前一天，将Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜，使其从固体状态融化为液体状态。将基质胶以1：8稀释后包被Transwell小室底部基底膜的上室面，风干3h。吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul的无血清培养液，37℃，水化基底膜30min。将转染shRNA-NC、shVRK1-1和shVRK1-2的对数期的T24和5637膀胱癌细胞血清饥饿12h后消化成单细胞悬液，调整密度为5×105个/ml。取200ul细胞悬液加入Transwell小室上室。下室内加入600ul含10％FBS培养基。培养板置于37℃的CO2培养基中，培养48h。取出小室，PBS清洗3遍，用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，使用4％多聚甲醛固定20min，0.1％结晶紫染色15min后，风干。倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数5个视野，取平均值，统计分析。
结果显示：如图6所示，与对照组(shRNA-NC)和实验组(shVRK1-1)相比，实验组(shVRK1-2)显著抑制了T24和56373细胞的侵袭能力。
实验五：shVRK1-2能通过抑制膀胱癌细胞上皮间质转化(EMT)信号通路从而抑制膀胱癌的侵袭和转移。
在6孔板中融合度为50％-70％的T24和5637细胞系中，，每孔分别转染(shRNA-NC、siVRK1、shVRK1-1和shVRK1-2)。转染8h之后将含有复合物的培养基弃去，更换新的培养基。转染后第三天，收集细胞样品利用蛋白免疫印迹实验分析EMT信号通路中代表性的分子，如上皮型标志物(E-cadherin)、间质型标志物(N-cadherin、Vimentin和Fibronectin)的表达量。
结果显示：如图7所示，与对照组(shRNA-NC)相比，实验组(shVRK1-1和shVRK1-2)的上皮型标志物E-cadherin表达上调，shVRK1-2组表达最高；间质型标志物(N-cadherin、Vimentin和Fibronectin)的表达均下调，其中shVRK1-2组表达最低。说明shVRK1-2能使膀胱癌细胞向更不容易转移和侵袭的上皮型转变。且本部分已经验证了对肿瘤细胞转型调节作用，至于对其他类型肿瘤细胞的调节作用不多加赘述，凡是通过调节相应标志物能够实现防治的疾病均应在本发明范围内。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (10)

1.shRNA分子，其特征在于，其序列中
正义链序列为SEQ ID NO：1：5'-GCAAGGAACCTGGTGTTGA-3'，
反义链序列为SEQ ID NO：2：5'-TCAACACCAGGTTCCTTGC-3'。
2.根据权利要求1所述的shRNA分子，其特征在于，其具有如下序列SEQ ID NO：3：
5'-tGCAAGGAACCTGGTGTTGAttcaagagaTCAACACCAGGTTCCTTGCtttttggaaac-3'。
3.重组质粒或构建体，其特征在于，包含权利要求2中SEQ ID NO：3序列，或由权利要求1-2任一所述的shRNA分子与质粒组成。
4.VRK1蛋白表达抑制剂，其特征在于，至少包含下述之一
a.权利要求1或2所述shRNA分子；
b.权利要求3中所述重组质粒。
5.VRK1基因沉默试剂盒，其特征在于，包含权利要求4所述的抑制剂。
6.VRK1基因表达抑制剂在制备防治膀胱癌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，VRK1基因表达抑制剂至少为shRNA或siRNA或miRNA或多肽。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述VRK1基因表达抑制剂至少包含下述之一
a.权利要求1或2所述shRNA分子；
b.权利要求3中所述重组质粒。
9.根据权利要求6所述的应用，其中，抑制剂对膀胱癌调节至少为下述任一
i)抑制膀胱癌细胞增殖、克隆形成；
ii)抑制膀胱癌细胞转移、侵袭。
10.质粒在制备防治膀胱癌药物中的应用，其中，所述质粒至少为下述之一
a.权利要求1或2所述shRNA分子；
b.权利要求3中所述重组质粒。
质粒在制备防治VRK1过表达诱发疾病药物中的应用，其中，所述质粒至少为下述之一
a.权利要求1或2所述shRNA分子；
b.权利要求3中所述重组质粒。
质粒在制备抑制肿瘤细胞向间质型转变疾病药物中的应用，其中，所述质粒至少为下述之一
a.权利要求1或2所述shRNA分子；
b.权利要求3中所述重组质粒。
防治膀胱癌药物，其特征在于，包含权利要求4所述的VRK1基因表达抑制剂。
VRK1蛋白表达抑制剂，其特征在于，包含下述中至少两种
I).siVRK1:5′-GCAAGGAACCTGGTGTTGA-3′，
5′-TCAACACCAGGTTCCTTGC-3′；
II).shVRK1-1:5′-tGAAAGAGAGTCCAGAAGTAttcaagagaTACTTCTGGACTCTCTTTCtttttggaaac-3’(SEQ ID NO：4)；
III).shVRK1-2:5′-tGCAAGGAACCTGGTGTTGAttcaagagaTCAACACCAGGTTCCTTGCtttttggaaac-3′(SEQ ID NO：3)。
权利要求14所述VRK1蛋白表达抑制剂在制备防治膀胱癌药物中的应用。
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