CN110721344A - 一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶，所述可注射生物凝胶包括网膜脱细胞基质溶液、壳聚糖衍生物溶液和1,4‑丁二醇二缩水甘油醚溶液，本发明还公开了制备上述可注射生物凝胶的制备方法，本发明公开的技术方案可以促进心梗后损伤心肌的修复，减少纤维化并显著提高心脏功能。

Description

一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药材料技术领域，具体涉及一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶及其制备方法。
背景技术
心肌梗死是缺血性心脏病的常见类型，在冠状动脉闭塞急性发作后的几分钟内，病损中央区的心肌细胞便会缺氧而死亡，在缺血边缘残存的心肌细胞也将因血供及氧供不足而逐步凋亡，引起梗死区逐渐扩大，导致梗死区域室壁厚度变薄，左心室扩大，并引起左心室舒张末压增高，心功能持续下降，最终导致充血性心力衰竭。我国作为世界人口大国，而且伴随着社会人口的老龄化，心肌梗死对我国大众的生命威胁也日益严峻。
将生物材料移植到损伤心肌中对调控心梗区域的微环境以及改善心脏功能具有一定的作用。例如，Kofidis等证实将Matrigel凝胶注射到梗塞的心肌可以恢复受损的心肌，而不会扭曲心脏的几何形状。Christman等将纤维蛋白胶注射到大鼠心肌梗死模型中，结果显示其对心肌梗死后的心室壁以及心功能有保护作用。
近年来，器官与组织脱细胞策略的出现为再生医学研究开辟了新的途径。脱细胞基质支架材料由于保留了细胞外基质的天然成分和三维结构，如I型胶原、III型胶原、IV型胶原以及纤连蛋白、粘连蛋白、糖氨聚糖(GAGs)等，有利于细胞粘附、增殖、分化及其他生物学功能的发挥；不仅如此，由于细胞外基质成分在不同物种间的相对保守性，脱细胞基质支架材料几乎没有或仅有很小的免疫排斥性，因此，脱细胞基质在组织修复与再生中具有其他生物材料无法比拟的优势。目前，研究人员人们通过脱细胞技术已经成功获得了各种不同组织与器官来源的脱细胞基质材料。大网膜是腹膜的一种，是存在于高等动物腹腔中的一层黏膜，是由***形成的膜状组织。大网膜是连接胃大弯至横结肠的腹膜。大网膜富有极强的弹性以及高度血管化的结构，这些优点使其在组织工程与再生医学领域中具有广泛的应用前景。然而，目前还未见利用网膜脱细胞基质建立用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的相关报道。另一方面，壳聚糖具有明显的抗氧化作用，对于清除缺血心肌的大量的活性氧自由基具有重要作用。目前亦尚未有将壳聚糖与网膜脱细胞基质复合建立促进心肌修复的可注射生物凝胶的相关报道。
发明内容
本申请的目的在于克服上述问题或者至少部分地解决或缓减解决上述问题，本发明公开的通过可注射生物凝胶制备方法制备的可注射生物凝胶能够有效的促进心梗后损伤心肌的修复，减少纤维化并显著提高心脏功能。
根据本申请的第一个方面，提供了一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶，其特征在于：所述可注射生物凝胶包括网膜脱细胞基质溶液、壳聚糖衍生物溶液和1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液。
与现有技术相比，本发明公开的技术方案一方面由于网膜脱细胞基质含有多种有利于组织的修复与再生的细胞因子，另一方面壳聚糖衍生物能够有效的清除心梗部位的活性氧自由基，因此，本发明公开的可注射生物凝胶能够有效的促进心梗后损伤心肌的修复，减少纤维化并显著提高心脏功能，本发明操作工艺简单、实施条件温和，在缺血性心脏疾病的治疗中具有广阔的应用前景。
根据本申请的第二个方面，提供了一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理，随后利用组合的消化酶液结合加有转子的消化瓶消化脱细胞网膜组织，进而获得网膜脱细胞基质；
将壳聚糖衍生物水溶液与β-甘油磷酸钠水溶液按照体积比为1:(0.1-0.2)的比例混合，获得壳聚糖衍生物溶液；
将网膜脱细胞基质溶液、壳聚糖衍生物溶液、1,4-丁二醇二缩水甘油醚按照体积比为1：(0.1-0.5):(0.01-0.05)比例混合，制得用于促进心肌修复的可注射生物凝胶。
与现有技术相比，本发明提供的一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法的有益效果与上述技术方案所述一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的有益效果相同，在此不做赘述。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本申请的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解的是，这些附图未必是按比例绘制的。在附图中：
图1为一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法的流程图；
图2为用于促进心肌修复的可注射生物凝胶外观图；
图3为实验组与对照组检测大鼠的心脏功能在显微镜下超声心动图(二尖瓣水平短轴切面)的图片；
图4为实验组与对照组标本进行在Masson三色染色，在显微镜下观察心梗区域的纤维化程度图片。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下面进一步对本申请所提供的一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶制备方法进行介绍。
在本申请中，缩写词的含义如下：
SDS：十二烷基硫酸钠；
PBS：磷酸盐缓冲液；
DNA酶：脱氧核糖核酸酶；
mRFP：红色荧光蛋白；
min：分钟。
本发明的一个方面公开了一种用于促进心肌修复可注射生物凝胶，上述可注射生物凝胶包括网膜脱细胞基质、壳聚糖、1,4-丁二醇二缩水甘油醚三种溶液，或由网膜脱细胞基质、壳聚糖衍生物、1,4-丁二醇二缩水甘油醚三种溶液组成。其中，网膜脱细胞基质是浓度为10-20mg/mL的网膜脱细胞基质溶液；所述壳聚糖衍生物溶液是将壳聚糖与β-甘油磷酸钠(GP)水溶液按照按照1:(0.1-0.2)的比例混合，获得的壳聚糖衍生物含量为1-3％质量浓度的壳聚糖溶液，1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液是用PBS配制的浓度为0.5-1.0％质量浓度的溶液。
需要说明的是，上述壳聚糖衍生物可以为羧化壳聚糖，也可以为其它类型的壳聚糖类化合物，如羧甲基壳聚糖，壳聚糖季铵盐等等，本发明对此不作任何限制。
需要说明的，上述一种用于促进心肌修复可注射生物凝胶的通过下述用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法制得。
本发明公开一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶一方面由于网膜脱细胞基质含有多种有利于组织的修复与再生的细胞因子，另一方面壳聚糖衍生物能够有效的清除心梗部位的活性氧自由基，因此，本发明公开的可注射生物凝胶能够有效的促进心梗后损伤心肌的修复，减少纤维化并显著提高心脏功能，本发明操作工艺简单、实施条件温和，在缺血性心脏疾病的治疗中具有广阔的应用前景。
根据本发明的一个方面，还提供了用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法；包括以下步骤：
步骤S01，使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理，随后利用组合的消化酶液结合加有转子的消化瓶消化脱细胞网膜组织，进而获得网膜脱细胞基质；
步骤S02，将壳聚糖衍生物水溶液与β-甘油磷酸钠水溶液按照体积比为1:(0.1-0.2)的比例混合，获得壳聚糖衍生物溶液；
步骤S03，将网膜脱细胞基质溶液、壳聚糖衍生物溶液、1,4-丁二醇二缩水甘油醚按照体积比为1：(0.1-0.5):(0.01-0.05)比例混合，制得用于促进心肌修复的可注射生物凝胶。
上述网膜脱细胞基质的制备包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤。
可选的，在进行脱细胞处理的步骤中还进行震荡操作。
在本实施例中，上述网膜脱细胞基质的制备还包括脱脂处理的步骤。在示例性实施方案中，上述脱脂处理的步骤在脱细胞处理的步骤之前进行。在某些优选的实施方案中，该脱脂处理的步骤使用体积比为1：1：0.2-1的甲醇、氯仿和***的混合溶液进行处理，优选地，上述甲醇、氯仿和***的体积比还可以为1：1：0.4-0.7，优选地，上述甲醇、氯仿和***的体积比还可以为1：1：0.5。
在某些实施方案中，脱细胞处理的步骤是分梯度进行的，上述梯度包括至少第一梯度和第二梯度。
在某些优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度的重量比为1.5-3.5％，DNA酶的浓度为3500-4500U/L，pH为7.2-7.4；优选地，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度的重量比为1.5-2.5％，DNA酶的浓度为3600-4400U/L；优选地，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠浓度的重量比为1.8-2.2％，DNA酶的浓度为3800-4200U/L；优选地，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度的重量比为2.0％，DNA酶的浓度为4000U/L。
在某些优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度的重量比为0.6-1.5％，DNA酶的浓度为2500-3500U/L，pH为7.2-7.4；优选地，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度的重量比为0.7-1.3％，DNA酶的浓度为2600-3400U/L；优选地，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度的重量比为0.8-1.2％，DNA酶的浓度为2800-3200U/L；优选地，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.0％重量比，DNA酶的浓度为3000U/L。
在某些优选的实施方案中，上述梯度还包括第三梯度，其中在上述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度的重量比为0.1-0.6％，DNA酶的浓度为1500-2500U/L，pH为7.2-7.4；优选地，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度的重量比为0.2-0.6％，DNA酶的浓度为1600-2400U/L；优选地，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度的重量比为0.4-0.6％，DNA酶的浓度为1800-2200U/L；优选地，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5％重量比，DNA酶的浓度为2000U/L。
根据本发明的另一方面，提供了用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法，其特征在于，按照如下具体操作步骤进行：
1、脱脂溶液的配制
将甲醇、氯仿与***以体积比为1：1：0.2-1的比例混匀；
2、脱细胞液的配制
1)脱细胞液I：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于PBS中，其中，十二烷基硫酸钠在PBS中浓度的重量比为1.5-3.5％，DNA酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为3500-4500U/L，pH为7.2-7.4，过滤除菌；
2)脱细胞液II：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于PBS中，其中，十二烷基硫酸钠在PBS中浓度的重量比为0.6-1.5％，DNA酶在PBS中的浓度为2500-3500U/L,pH为7.2-7.4，过滤除菌；
3)脱细胞液III：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于PBS中，其中，十二烷基硫酸钠在PBS中浓度的重量比为0.1-0.6％，DNA酶在PBS中的浓度为1500-2500U/L,pH为7.2-7.4，过滤除菌；
3、网膜脱细胞基质消化液的制备
将胰酶、胶原酶、蛋白酶dispaseII以质量比2：2：1-2的比例溶于PBS溶液中，其中，胰酶、胶原酶与蛋白酶dispaseII在PBS溶液的浓度均为0.05-0.25％，完全溶解后，调解pH至7.2-7.4，获得网膜脱细胞基质消化液。
4、大网膜脱细胞处理
1)取新鲜的大网膜组织，于PBS中清洗，将清洗后的组织震荡浸泡于脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为150-250r/min；
2)将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于脱细胞液I中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；
3)将经脱细胞液I处理后的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于脱细胞液II中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；
4)将经脱细胞液II处理后的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于脱细胞液III中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；
5)通过PBS洗净，获得网膜脱细胞基质。
5、网膜脱细胞基质的制备
将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质加入到含有上述消化液的消化瓶中，每100毫升消化液加入10-20克网膜脱细胞基质，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为60-100rpm，于37℃，5％CO2的孵箱中消化30-45min(消化时间根据消化酶浓度不同适当调节)，然后以血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为1-2：10。收集消化液，获得液态网膜脱细胞基质生物凝胶，将网膜脱细胞基质浓度调整为10-20mg/mL。
6、用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备
将上述网膜脱细胞基质、壳聚糖、1,4-丁二醇二缩水甘油醚三种溶液按照1：(0.1-0.5):(0.01-0.05)的体积混合均匀。
在某些实施方案中，新鲜的大网膜组织来源于猪、牛、羊等哺乳类动物。
在本申请中，大网膜组织是可商购的，可以购自例如屠宰场。
以下以具体的实施例进行详细说明。
以下实施例中使用的大网膜脱细胞处理及其鉴定所需试剂的配制：
PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.491g Na2HPO4·12H2O，0.2g KH2PO4，溶解于1L超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
2)脱脂溶液：将400mL甲醇、400mL氯仿与200mL***混匀。
3)脱细胞液I：称取20g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到4000U/L,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。
4)脱细胞液II：称取10g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到3000U/L,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。
5)脱细胞液III：称取5g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到2000U/L,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。
6)网膜脱细胞基质消化液：将胰酶0.05克、胶原酶0.1g、Dispase II 0.1克，溶解于100mLPBS溶液中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。使用前现配制，用于网膜脱细胞基质的消化。
7)消化瓶：200mL有盖柱形玻璃瓶，内置一个的磁力搅拌器用转子(直径×长：6×20mm)。
步骤1网膜的脱细胞处理过程
取新鲜的小型猪腹膜大网膜组织(购自屠宰场)，于PBS中清洗3遍。将清洗后的组织震荡浸泡于2L脱脂溶液中处理24h，震荡频率为200r/min。随后，将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液I中处理8h，震荡频率为150r/min。随后，将经脱细胞液I处理后的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液II中处理8h，震荡频率150r/min。随后，将经脱细胞液II处理后的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液III中处理8h，震荡频率为150r/min。最后，将经脱细胞液III处理后的大网膜组织经PBS洗净，4℃保存。
步骤2网膜脱细胞基质的制备
将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质10g加入到含有上述消化液的消化瓶中，随后加入100毫升消化液，加盖后放在磁力搅拌器上以100rpm的转速进行搅动，磁力搅拌器和消化瓶一同置于37℃孵箱中，连续消化30-45min，然后加入2mL血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为0.1-0.2：10。收集消化液，获得液态网膜脱细胞基质生物凝胶。将网膜脱细胞基质浓度调整为20mg/mL。
步骤3用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备
将壳聚糖水溶液与β-甘油磷酸钠(GP)水溶液按照1:0.2的比例混合，获得壳聚糖溶液；用PBS溶液配制浓度为1.0％的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)溶液；将上述20mg/mL的网膜脱细胞基质溶液、壳聚糖溶液、1,4-丁二醇二缩水甘油醚按照1：0.5:0.05的体积比混合均匀。
步骤4大鼠心梗模型的制备
利用戊巴比妥钠将SD大鼠麻醉，连接小动物呼吸机。行开胸术，剪开心包，暴露心脏。在左心耳下缘2mm处，用0-7号丝线缝扎。结扎后左室壁变苍白，室壁运动减弱。心电监护见I、II导联的ST段明显抬高，表明冠状动脉梗死动物模型制备成功。
步骤5：促进心肌修复的可注射生物凝胶的移植与心脏功能检测
将SD大鼠随机分为可注射生物凝胶注射实验组与生理盐水注射对照组。大鼠心肌梗死14天后，再次开胸进行注射移植手术。打开胸腔暴露心脏，在肉眼可见的梗死区域以及周围的健康心肌上进行多点注射，一共注射100μL。移植4周后对各实验组大鼠进行心脏超声检查，如图3所示，结果表明，与生理盐水注射对照组相比，可注射生物凝胶注射实验组大鼠的心脏功能明显改善(图2)。随后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(200mg/kg)处死，迅速开胸取出心脏，OCT包埋，液氮速冻20s后，冰冻切片(5μm)。如图4所示，所有实验组与对照组标本进行在胶原纤维染色(Masson三色染色)，显微镜下观察心梗区域的纤维化程度，结果表明，与生理盐水对照组相比，可注射生物凝胶注射实验组大鼠的心脏的纤维化程度明显改善。
本发明公开的技术方案一方面由于网膜脱细胞基质含有多种有利于组织的修复与再生的细胞因子，另一方面壳聚糖衍生物能够有效的清除心梗部位的活性氧自由基，因此，本发明公开的可注射生物凝胶能够有效的促进心梗后损伤心肌的修复，减少纤维化并显著提高心脏功能，本发明操作工艺简单、实施条件温和，在缺血性心脏疾病的治疗中具有广阔的应用前景。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶，其特征在于：所述可注射生物凝胶包括网膜脱细胞基质溶液、壳聚糖衍生物溶液和1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液。
2.如权利要求1所述的用于促进心肌修复的可注射生物凝胶，其特征在于：所述网膜脱细胞基质溶液、壳聚糖衍生物溶液和1,4-丁二醇二缩水甘油醚体积比为1：(0.1-0.5):(0.01-0.05)。
3.如权利要求1或2所述的用于促进心肌修复的可注射生物凝胶，其特征在于：所述网膜脱细胞基质溶液的浓度为10-20mg/mL；所述壳聚糖衍生物溶液质量浓度为1-3％；所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液的质量浓度为0.5-1.0％。
4.如权利要求3所述的用于促进心肌修复的可注射生物凝胶，其特征在于：所述壳聚糖衍生物溶液是将壳聚糖衍生物与β-甘油磷酸钠水溶液按照体积比为1:(0.1-0.2)的比例混合获得，所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液是用磷酸盐缓冲液配制。
5.一种用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理，随后利用组合的消化酶液结合加有转子的消化瓶消化脱细胞网膜组织，进而获得网膜脱细胞基质；
将壳聚糖衍生物水溶液与β-甘油磷酸钠水溶液按照体积比为1:(0.1-0.2)的比例混合，获得壳聚糖衍生物溶液；
将网膜脱细胞基质溶液、壳聚糖衍生物溶液、1,4-丁二醇二缩水甘油醚按照体积比为1：(0.1-0.5):(0.01-0.05)比例混合，制得用于促进心肌修复的可注射生物凝胶。
6.如权利要求5所述的用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述获得网膜脱细胞基质步骤还包括脱脂处理的步骤，所述脱脂处理的步骤在所述大网膜进行脱细胞处理之前进行。
7.如权利要求6所述的用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述脱脂处理的步骤通过使用甲醇、氯仿和***的体积比为1：1：0.2-1的混合溶液进行处理。
8.如权利要求5所述的用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤通过分梯度进行处理。
9.如权利要求8所述的用于促进心肌修复的可注射生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述梯度包括第一梯度、第二梯度和第三梯度；
在所述第一梯度中，使用十二烷基硫酸钠的浓度的重量比1.5-3.5％和DNA酶的浓度为3500-4500U/L进行处理；
在所述第二梯度中，使用十二烷基硫酸钠的浓度的重量比0.6-1.5％和DNA酶的浓度为2500-3500U/L，pH为7.2-7.4进行处理；
在所述第三梯度中，使用十二烷基硫酸钠的浓度的重量比0.1-0.6％和DNA酶的浓度为1500-2500U/L，pH为7.2-7.4进行处理。
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