CN104771788B - 一种基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤及其构建方法。组织工程皮肤的构建方法包括以下步骤：(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及(2)组织工程皮肤构建与培养。还提供了由该方法获得的组织工程皮肤。由于大网膜脱细胞基质中富含促血管生长因子，其可促使毛细血管由创面长入移植的组织工程皮肤，从而有利于组织工程皮肤的血管化及创面愈合，对组织工程皮肤的临床应用具有重要意义。此外，本发明中支架材料来源广泛、成本低廉、操作工艺简单。

Description

一种基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤及其构建方法

技术领域

本发明属于组织工程与再生医学技术领域，具体涉及一种以大网膜脱细胞基质为支架材料的组织工程皮肤及其构建方法。

背景技术

皮肤是保护机体免受外界侵袭的首要屏障，在维持机体内环境稳定中发挥着极其重要的作用。严重创伤、大面积烧伤、肿瘤摘除等引起皮肤缺损的传统的治疗方法为皮肤移植，然而目前皮肤移植存在供体来源不足以及免疫排斥反应等问题，因此迫切需要一种理想的皮肤替代物来修复损伤皮肤。通过组织工程方法，利用细胞以及细胞外基质能够构建出具有一定功能的人工皮肤，为构建皮肤替代物以及皮肤损伤临床修复提供了新的方法。

组织工程皮肤为修复皮肤缺损创面带来了希望，目前，部分组织工程皮肤产品已应用于临床，如Integra、Dermagraft、Alloderm等组织工程皮肤产品，具有巨大的发展潜力。然而其移植存活率明显低于自体皮肤移植，临床效果依然不甚明显。主要原因在于组织工程皮肤很大程度上受制于移植后缺乏足够的血管化而导致缺血损伤，进而造成的细胞供养不足，甚至移植失败。

正因如此，国内外研究人员在组织工程皮肤血管化方面开展了大量研究。目前，促进组织工程皮肤血管化的方法主要包括促血管生成因子的直接应用、添加血管内皮细胞、编码特定生长因子基因转染种子细胞等。上述方法在解决组织工程皮肤血管化方面发挥了一定作用，然而也存在明显的局限性。例如，在组织工程皮肤构建时添加血管外源性内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等调控因子，虽然能趋化宿主内皮细胞，促进工程化皮肤的血管化。然而，外源性生长因子价格昂贵，体内半衰期短，且高剂量应用时可能导致血液流变异常，进而产生严重副作用。而在构建工程化皮肤时添加血管内皮细胞的方法也存在自体来源内皮细胞来源有限以及取材过程对机体产生创伤等不足，不仅如此，血管内皮细胞多为终末分化细胞，其增殖的能力与细胞因子分泌能力均存在不足，限制了于组织工程皮肤的应用。编码特定生长因子基因转染种子细胞亦存在安全性等问题。因此，亟需寻找能够促进组织工程皮肤血管化的新方法与策略。

脱细胞技术的出现为组织工程皮肤的构建及其血管化带来了新的希望。利用脱细胞技术去除组织中各种细胞成分以及遗传物质而获得的天然生物支架材料及脱细胞基质材料，保留了细胞外基质的三维结构和天然成分，有利于细胞粘附、增殖、分化及其生物学功能的发挥，在组织修复与再生中具有其他支架材料无法比拟的优势。目前，研究人员已经获得了各种不同组织来源的脱细胞基质支架材料，如小肠、皮肤、角膜、心、肺、肝、肾等。

大网膜(greater omentum)是连接胃大弯至横结肠的腹膜组织，从胃与肠之间向前膨出，在肠的前方下垂形成皱襞，呈围裙状遮被空、回肠。大网膜来源广泛，高度血管化，富含各类生长因子，目前已广泛用于各类移植物的体内移植平台。例如，其可以用于外科重建手术中对炎性或者缺损组织的修复，促进组织的血管化与再生。然而，目前大网膜脱细胞基质相关研究刚刚起步，尚未见以大网膜脱细胞基质为支架材料，构建组织工程皮肤的相关研究报道。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了组织工程皮肤的构建方法，包括以下步骤：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及

(2)组织工程皮肤构建与培养。

根据本发明的另一方面，提供了组织工程皮肤的构建方法，其特征在于，按照以下操作步骤进行：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料

将新鲜的大网膜组织震荡浸泡于由甲醇、氯仿与***以体积比为1∶1∶0.2-1混合而成脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30小时，震荡频率为150-250r/min；随后，将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于十二烷基硫酸钠/DNA酶含量由高到低的梯度脱细胞液中处理，梯度脱细胞液中十二烷基硫酸钠/DNA酶含量分别为1.5-3.5％重量比的十二烷基硫酸钠/3500-4500U/L的DNA酶、0.6-1.5％重量比的十二烷基硫酸钠/2500-3500U/L的DNA酶、0.1-0.6％重量比的十二烷基硫酸钠/1500-2500U/L的DNA酶，每梯度溶液浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min，最后，将经梯度脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌；以及

(2)组织工程皮肤构建与培养

将5×10⁵-1×10⁷/mL的皮肤成纤维细胞悬液1-3mL接种于步骤(1)中制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物；将所述复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1-2小时，然后添加DMEM培养液10-15mL，继续培养至第7天，随后将复合构建物进行气液面培养，每天更换一次培养液，第14-28天结束培养即可获得组织工程皮肤。

根据本发明的另一方面，提供了根据上述方法获得的组织工程皮肤。

与其他方式构建的组织工程皮肤相比，本发明中构建的组织工程皮肤以大网膜脱细胞基质为支架材料，由于大网膜脱细胞基质中富含促血管生长因子，其可促使毛细血管由创面长入移植的组织工程皮肤，从而有利于组织工程皮肤的血管化及创面愈合，对组织工程皮肤的临床应用具有重要意义。此外，本发明中支架材料来源广泛、成本低廉、操作工艺简单。

附图说明

图1基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤活/死(Live/Dead)染色×200。

图2基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤中VEGF表达情况(*p＜0.01)。

图3基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤中bFGF表达情况(*p＜0.01)。

图4组织工程皮肤在皮肤创面移植7天后HE染色×200。

具体实施方式

在本申请中，缩写词的含义如下：

DMEM：Dulbecco′s modified eagle medium培养液，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基；

HEPEs：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；

PBS：磷酸盐缓冲液；

SDS：十二烷基硫酸钠；

VEGF：血管外源性内皮生长因子；

bFGF：碱性成纤维细胞生长因子；

HE染色：苏木精-伊红染色；

EthD-III：溴化乙锭同型二聚体-III；

calcein AM：二乙酰甲酯

DNA酶：脱氧核糖核酸酶；

min：分钟。

根据本发明的一个方面，提供了组织工程皮肤的构建方法，包括以下步骤：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及

(2)组织工程皮肤构建与培养。

在某些实施方案中，在进行脱细胞处理的步骤中还进行震荡。

在某些实施方案中，步骤(1)还包括脱脂处理的步骤。

在优选的实施方案中，脱脂处理的步骤在脱细胞处理的步骤之前进行。

在优选的实施方案中，脱脂处理的步骤使用体积比为1∶1∶0.2-1的甲醇、氯仿和***的混合溶液进行。在某些更优选的实施方案中，甲醇、氯仿和***的体积比为1∶1∶0.4-0.7。在最优选的实施方案中，甲醇、氯仿和***的体积比为1∶1∶0.5。

在某些实施方案中，脱细胞处理的步骤是分梯度进行的，所述梯度包括至少第一梯度和第二梯度。

在某些优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-3.5％重量比，DNA酶的浓度为3500-4500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-2.5％重量比，DNA酶的浓度为3600-4400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.8-2.2％重量比，DNA酶的浓度为3800-4200U/L。在最优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为2.0％重量比，DNA酶的浓度为4000U/L。

在某些优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.6-1.5％重量比，DNA酶的浓度为2500-3500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.7-1.3％重量比，DNA酶的浓度为2600-3400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.8-1.2％重量比，DNA酶的浓度为2800-3200U/L。在最优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.0％重量比，DNA酶的浓度为3000U/L。

在某些优选的实施方案中，所述梯度还包括第三梯度，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1-0.6％重量比，DNA酶的浓度为1500-2500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.2-0.6％重量比，DNA酶的浓度为1600-2400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.4-0.6％重量比，DNA酶的浓度为1800-2200U/L。在最优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5％重量比，DNA酶的浓度为2000U/L。

根据本发明的另一方面，提供了组织工程皮肤的构建方法，其特征在于，按照以下操作步骤进行：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料

将新鲜的大网膜组织震荡浸泡于由甲醇、氯仿与***以体积比为1∶1∶0.2-1混合而成脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30小时，震荡频率为150-250r/min；随后，将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于十二烷基硫酸钠/DNA酶含量由高到低的梯度脱细胞液中处理，梯度脱细胞液中十二烷基硫酸钠/DNA酶含量分别为1.5-3.5％重量比的十二烷基硫酸钠/3500-4500U/L的DNA酶、0.6-1.5％重量比的十二烷基硫酸钠/2500-3500U/L的DNA酶、0.1-0.6％重量比的十二烷基硫酸钠/1500-2500U/L的DNA酶，每梯度溶液浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min，最后，将经梯度脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌；以及

(2)组织工程皮肤构建与培养

将5×10⁵-1×10⁷/mL的皮肤成纤维细胞悬液1-3mL接种于步骤(1)中制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物；将所述复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1-2小时，然后添加DMEM培养液10-15mL，继续培养至第7天，随后将复合构建物进行气液面培养，每天更换一次培养液，第14-28天结束培养即可获得组织工程皮肤。

在某些实施方案中，步骤(2)中的大网膜来源于猪、牛、羊等哺乳类动物。

在本申请中，大网膜是可商购的，可以购自例如屠宰场。

在某些实施方案中，DMEM培养液为含体积百分比浓度为10-15％血清的DMEM培养基；其中，DMEM培养基的配制方法为将DMEM培养基干粉一包、NaHCO₃ 2.4g、HEPEs 2.383g溶解并定容于1L超纯水中。

根据本发明的另一方面，提供了根据上述方法获得的组织工程皮肤。

通过以下实施例对本发明做详细描述，然而以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。

以下实施例中使用的基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤构建所需试剂的配制：

1)PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.491g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，溶解于1L超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。

2)脱脂溶液：将400mL甲醇、400mL氯仿与200mL***混匀。

3)脱细胞液I：称取20g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到4000U/L，调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。

4)脱细胞液II：称取10g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到3000U/L，调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。

5)脱细胞液III：称取5g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到2000U/L，调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。

6)DMEM细胞培养基：DMEM干粉培养基一袋，3.7g NaHCO₃，2.383g HEPES，溶解于1L超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。使用时添加10％胎牛血清(FBS)。

7)4％多聚甲醛固定液：加热0.1M的PBS溶液1L至沸腾，加入40g多聚甲醛，搅拌溶解，调节pH值为7.2-7.4，过滤除杂质，4℃保存。

实施例中所用人皮肤组织由中国人民解放军总医院医学捐赠。

实施例1人皮肤成纤维细胞的培养

将人皮肤组织经PBS清洗后，剪碎(组织块大小约为0.1cm³)并置于0.5％胶原酶溶液中，37℃孵箱中消化2小时。然后，经过200目筛网过滤，加入PBS至10mL，800rpm离心5min，洗去胶原酶，沉淀即为皮肤成纤维细胞。弃去上清，加入DMEM培养液制成细胞悬液，按1×10⁶/mL接种至培养瓶中，置37℃、5％CO₂孵箱培养。

构建组织工程皮肤之前，将培养的细胞通过胰蛋白酶消化，用DMEM培养液重悬细胞，并制备细胞密度为5×10⁶/mL的皮肤成纤维细胞悬液。

实施例2大网膜脱细胞基质的制备

取新鲜的小型猪腹膜大网膜组织(购自屠宰场)，于PBS中清洗3遍。将清洗后的组织震荡浸泡于2L脱脂溶液中处理24h，震荡频率为200r/min。随后，将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液I中处理8h，震荡频率为150r/min。随后，将经脱细胞液I处理后的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液II中处理8h，震荡频率150r/min。随后，将经脱细胞液II处理后的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液III中处理8h，震荡频率为150r/min。最后，将经脱细胞液III处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌，常温保存。

实施例3基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤的构建与培养

将5×10⁶mL的皮肤成纤维细胞悬液2mL接种于制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物。将复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1.5h，然后添加DMEM培养液10mL，继续培养至第7天，随后将复合构建物进行气液面培养，每天更换一次培养液，第21天结束培养获得组织工程皮肤。

实施例4基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤的细胞活性检测

取培养21天的组织工程皮肤于新的培养皿中，用移液枪吸取20μl 2mM EthD-III溶液加到10mL PBS中，得到4μM EthD-III工作液，再将5μl 4mM calcein AM溶液转移到EthD-III工作液中，配制成混合液(2μM calcein AM和4μM EthD-III)。随后添加足量的Live/Dead混合液以覆盖组织工程皮肤，然后于室温孵育30-45min，PBS溶液清洗三次。在荧光显微镜下观察荧光标记的细胞。

经染色，由于活细胞具有酯酶活性，可以把非荧光calcein AM转化成能发绿色荧光的calcein，而由于死细胞的细胞膜失去选择性，EthD-III进入细胞结合到细胞核上，使死细胞呈现红色荧光。live/dead染色结果可见，培养21天的组织工程皮肤中大量细胞存活良好(绿色)，仅有少量细胞死亡(红色)出现，表明基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤具有良好的活性(图1)。

实施例5基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤的促血管因子表达检测

通过酶联免疫反应测定法(ELISA)检测并比较基于大网膜脱细胞基质组织工程皮肤以及基于胶原支架的组织工程皮肤中促血管因子VEGF与bFGF的表达水平。分别称取100mg左右上述两种工程化皮肤，匀浆后取上清，设置空白对照组，标准品组，样品组。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl；用封板膜封板后置37℃温育30min；随后，小心揭掉封板膜，弃去液体、甩干、每孔加满洗涤液、静置30s后弃去，如此反复5次、拍干。然后每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；经温育、洗涤后，每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min；最后，每孔加入终止液50μl终止反应；以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光值。绘制标准曲线，计算样品标准浓度，乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。结果发现，基于大网膜脱细胞基质组织工程皮肤中促血管因子VEGF与bFGF的表达水平均显著高于基于胶原支架的组织工程皮肤，表明本发明构建的基于大网膜脱细胞基质组织工程皮肤具有良好的促血管作用(图2，图3)。

实施例6大鼠创伤感染模型的建立及组织工程皮肤异体移植实验

大鼠腹腔注射0.5mL 2％的戊巴比妥钠溶液进行麻醉。随后，在大鼠背部喷洒75％酒精消毒，然后用剪刀剃除其背部覆毛，用脱毛膏将手术区域的毛脱干净；在大鼠背部划定1.5×1.5cm的方形手术区，然后将其全皮切除；将组织工程皮肤覆盖创面，用缝线将其与周围皮肤缝合，无菌敷料加压包扎固定。两天后常规碘酒、酒精消毒，并更换敷料，7天后拆除缝线，切取部分移植的组织工程皮肤标本进行作组织学检查。HE染色结果表明，基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤能有效促进创面愈合，炎性细胞显著降低，且可显著增强损伤区域的血管化程度(图4)。

Claims (16)

1.一种组织工程皮肤的构建方法，包括以下步骤：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及

(2)组织工程皮肤构建与培养，

其中所述脱细胞处理的步骤是分梯度进行的，所述梯度包括至少第一梯度和第二梯度，其中：

在所述第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-3.5％重量比，DNA酶的浓度为3500-4500U/L，pH为7.2-7.4，并且

在所述第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.6-1.5％重量比，DNA酶的浓度为2500-3500U/L，pH为7.2-7.4，

其中所述梯度还包括第三梯度，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1-0.6％重量比，DNA酶的浓度为1500-2500U/L，pH为7.2-7.4。

2.如权利要求1所述的方法，其中在进行脱细胞处理的步骤中还进行震荡。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)还包括脱脂处理的步骤。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述脱脂处理的步骤使用体积比为1∶1∶0.2-1的甲醇、氯仿和***的混合溶液进行。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述脱脂处理的步骤使用体积比为1∶1∶0.4-0.7的甲醇、氯仿和***的混合溶液进行。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述脱脂处理的步骤使用体积比为1∶1∶0.5的甲醇、氯仿和***的混合溶液进行。

7.如权利要求1所述的方法，其中：

在所述第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-2.5％重量比，DNA酶的浓度为3600-4400U/L，并且

在所述第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.7-1.3％重量比，DNA酶的浓度为2600-3400U/L。

8.如权利要求7所述的方法，其中：

在所述第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.8-2.2％重量比，DNA酶的浓度为3800-4200U/L，并且

在所述第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.8-1.2％重量比，DNA酶的浓度为2800-3200U/L。

9.如权利要求7所述的方法，其中：

在所述第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为2.0％重量比，DNA酶的浓度为4000U/L，并且

在所述第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.0％重量比，DNA酶的浓度为3000U/L。

10.如权利要求1所述的方法，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.2-0.6％重量比，DNA酶的浓度为1600-2400U/L。

11.如权利要求10所述的方法，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.4-0.6％重量比，DNA酶的浓度为1800-2200U/L。

12.如权利要求10所述的方法，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5％重量比，DNA酶的浓度为2000U/L。

13.一种组织工程皮肤的构建方法，其特征在于，按照以下操作步骤进行：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料

将新鲜的大网膜组织震荡浸泡于由甲醇、氯仿与***以体积比为1∶1∶0.2-1混合而成脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30小时，震荡频率为150-250r/min；随后，将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于十二烷基硫酸钠/DNA酶含量由高到低的梯度脱细胞液中处理，梯度脱细胞液中十二烷基硫酸钠/DNA酶含量分别为1.5-3.5％重量比的十二烷基硫酸钠/3500-4500U/L的DNA酶、0.6-1.5％重量比的十二烷基硫酸钠/2500-3500U/L的DNA酶、0.1-0.6％重量比的十二烷基硫酸钠/1500-2500U/L的DNA酶，每梯度溶液浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min，最后，将经梯度脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌；以及

(2)组织工程皮肤构建与培养

将5×10⁵-1×10⁷/mL的皮肤成纤维细胞悬液1-3mL接种于步骤(1)中制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物；将所述复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1-2小时，然后添加DMEM培养液10-15mL，继续培养至第7天，随后将复合构建物进行气液面培养，每天更换一次培养液，第14-28天结束培养即可获得组织工程皮肤。

14.如权利要求1-13中任一权利要求所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的大网膜来源于哺乳类动物。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的大网膜来源于猪、牛或羊。

16.根据权利要求1-15中任一权利要求所述的方法获得的组织工程皮肤。