CN101574514A - 一种基于壳聚糖水凝胶和生长因子治疗心肌梗死的产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于温敏性壳聚糖水凝胶的可注射性心肌组织工程产品。具体涉及应用温敏性壳聚糖水凝胶为支架材料，携带一种或几种不同促血管生长因子如bFGF、PDGF－BB、VEGF等，注射移植到动物心肌梗死模型特定区域后观察其修复心肌梗死区域的情况。应用该支架材料构建的温敏性心肌组织工程产品，可以促使心肌毛细血管和小动脉生成，增加成肌纤维生成，促进心肌组织再生，增加梗死区室壁厚度、重塑原有心室形状、改善心脏功能。本发明操作工艺简单、实施条件温和，为心肌组织工程提供了一种新的产品，对组织工程化心肌治疗心脏疾患的临床开展具有重要意义。

Description

一种基于壳聚糖水凝胶和生长因子治疗心肌梗死的产品

技术领域

本发明属于组织工程与再生医学领域，特别涉及一种温敏性壳聚糖水凝胶为载体携带促血管生长因子治疗心梗的产品。

发明背景

世界上动脉粥样硬化引起的冠状动脉疾病是发病率和死亡率的主要原因，其中以心梗发生最为严重。尽管在心梗治疗方面已经取得了很大进展，但是心梗后心肌细胞不能再生、左室重构和心脏功能的损害仍然是心衰的主要原因。

促血管生长因子包括VEGF、FGF、PDGF等家族及它们的亚型，通过特定的受体促进血管生成。VEGF主要作用于内皮细胞。bFGF是细胞增生、活力、分化和存活有力的调节基因，在调解包括内皮细胞在内的靶细胞的生长具有很大作用。bFGF在体内选择刺激血管的发生。PDFG主要作用于包括周细胞和血管平滑肌细胞在内的血管周细胞，PDGF-BB起稳定新生血管作用。

促血管生长因子可促进处于细胞增生和分化的不同阶段的组织再生，促进血管的发生，从而对损伤部位的修复和再生有很大作用，但是这种作用在体内不是总是达到的，其原因之一是生长因子在机体具有非常短的半衰期和较快的扩散而不能保持其生物活性，因此，必须解决生长因子在体内的缓慢释放问题以加强其作用。

基于材料使促血管生长因子在体内缓释的方法是一种很有前景的方法。先前研究报道各种载体如明胶水凝胶、纤维蛋白水凝胶和Matrigel等携带促血管生长因子应用于缺血机体并促进缺血局部血管生成和改善缺血局部功能起很大作用。

壳聚糖是β-(1-4)-2-乙酰氨基-D-葡聚糖和2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖的共聚物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，医学领域多作为生物黏附剂和创伤辅料，起到止血活性和加速创伤愈合。壳聚糖可以和很多离子、聚合物以多种方式复合，形成多种凝胶，如温敏性凝胶及光敏性凝胶等。有研究者通过紫外线照射交联成胶作用，将复合了FGF的壳聚糖水凝胶固化在兔慢性心肌梗塞模型的缺血心肌部位，虽起到了一定的治疗性作用，但该方法导致促血管生长因子在心梗局部坏死组织中的释放率和存在率较低，无法为心梗坏死组织再生和血管组织形成提供根本性解决办法。研究报道可注射性壳聚糖水凝胶携带bFGF注射于S-D大鼠缺血后肢后，bFGF缓慢释放出来，局部血管形成和侧枝循环加强。

有研究发现壳聚糖与甘油磷酸钠复合物，常温下流动性好、生理体温(37℃)时发生凝胶化、形成水凝胶，是一种优良的可注射性载体，目前主要应用于软骨及骨组织工程，但以其作为生物载体，携带生长因子治疗心梗的产品至今尚未见报道。

发明内容

本产品首次采用温敏性壳聚糖水凝胶作为生物载体携带促血管生长因子构建可注射性组织工程心肌产品，将其注射到跳动的心脏缺血损伤心肌内，以达到促血管生长因子在体内缓慢释放，并保持较好生物活性，促进心梗部位毛细血管网和小动脉的产生，并促进成肌纤维的产生，改善局部缺血组织的血流，修复大面积心梗疤痕并且改善心脏功能的目的。

因此，本发明的第一个发明目的是为心梗治疗提供一种新的产品，具体地说，提供一种促血管生长因子的可注射性组织工程产品。

在一个具体实施方案中，所述的促血管生长因子的可注射性组织工程产品是基于壳聚糖水凝胶的促血管生长因子混合物。其中，可注射的壳聚糖水凝胶是温敏性壳聚糖水凝胶，其特征在于室温条件下为液态，注射到体内后，短时间内凝结为固态。

在另一个具体实施方案中，促血管生长因子可以是已有的任何促血管生长因子，例如，包括FGF、VGEF、PDGF在内的所有促血管生长因子。其中，FGF是包含aFGF、bFGF等在内的FGF家族；VEGF是包括VEGF-A、VEGF-B等在内的VEGF家族；PDGF包括PDFG-AA、PDGF-AB、PDGF-BB等在内的PDGF家族。还在另一个具体实施方案中，既可使用单一促血管生长因子与壳聚糖水凝胶来制备可注射性组织工程产品，也可联合使用上述任意两种或多种促血管生长因子与壳聚糖水凝胶来制备可注射性组织工程产品。

本发明的第二个发明目的是提供制备上述促血管生长因子的可注射性组织工程产品的方法，包括：

(1)温敏性壳聚糖水凝胶的制备

原料准备如下：1％-3％壳聚糖(C)溶液；10％-50％β-甘油磷酸钠(GP)水溶液；1％-4％羟乙基纤维素(HEC)溶液。

温敏性壳聚糖水凝胶制备方法：将上述三种溶液按照C∶GP∶HEC＝4∶1∶1的比例在室温下混合成液态，37℃条件下即可凝结为固态。

(2)促血管生长因子溶液的准备：

a.bFGF溶液：用pH值7.2-7.8的PBS溶解；

b.PDGF-BB：溶于无菌的100mM醋酸和0.1％BSA，可被其他溶液进一步稀释；

c.如果是VEGF溶液，溶于去离子水，可被其他溶液进一步稀释；

d.其它促血管生长因子溶液的准备详见具体说明书。

(3)基于温敏性壳聚糖水凝胶和促血管生长因子治疗心梗产品的制备：

取一定量(例如，20ng-500ug)的配制好的促血管生长因子溶液，同制备好的温敏性壳聚糖水凝胶充分混合均匀，混合方式如下：

a.单一促血管生长因子溶液和温敏性壳聚糖水凝胶

如：20ng-500ug的bFGF溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合、20ng-500ug的PDGF-BB溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合、20ng-500ug的VEGF溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合等。

b.促血管生长因子溶液联合和温敏性壳聚糖水凝胶

如：20ng-500ug的bFGF联合VEGF溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合、20ng-500ug的bFGF联合PDGF-BB溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合等。

应当指出，促血管生长因子具体注入量应根据不同动物种属和其心肌梗死损伤面积大小来定，鉴于不同厂家和来源促血管生长因子的纯度和有效性不同，不同个体病例对药物的依赖性和敏感性不同，促血管生长因子的注入量应根据情况来定。本发明中，通常选用的范围是250ng-50ug。

有益效果

本产品以温敏性壳聚糖水凝胶作为生物载体，携带一种或几种促血管生长因子进行心肌梗死部位注射治疗。在体内，促血管生长因子可随着壳聚糖水凝胶降解而缓慢释放，从而有效解决了其在体内因扩散过快和降解过快造成的活性降低等问题，促进了心梗区血管形成，增加血供，增加心室壁容积和梗死区室壁厚度，重塑原有心室形状、改善心脏功能。该产品具有可注射性的特征，侵害性小，具有定向性，便于治疗操作，可以避免心脏停跳、体外循环等操作所带来的风险。本发明操作工艺简单、实施条件温和，为心肌组织工程提供了一种新的产品，对组织工程化心肌治疗心脏疾患的临床开展具有重要意义。

附图说明

图1.固态凝胶状壳聚糖水凝胶

图2.壳聚糖水凝胶的组织相容性检测(HE染色)

A.1周，×40；B.2周，×40；C.3周，×40；D.4周，×40；

图3.大鼠心梗模型的制备

A.大鼠冠状动脉前降支结扎；

B.心电图示ST段抬高提示心梗形成；

图4.壳聚糖水凝胶注射和单纯心梗四周后梗死中间部位心室壁厚度情况(HE染色)

A.壳聚糖水凝胶注射，×4；B.单纯心梗，×4；

图5.壳聚糖水凝胶携带促血管生长因子注射、壳聚糖水凝胶注射和4周后梗死中间部位血管生成情况(VIII因子免疫组化染色)

A.壳聚糖水凝胶携带促血管生长因子注射，×10；B.壳聚糖水凝胶注射×10；C.PBS注射×10；

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、组织工程学等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，Lanza，Langer and Vacanti″Principlesof Tissue Engineering″(2006)；Atala and Lanza″Methods of Tissue Engineering″(2006)。

实施例1：壳聚糖水凝胶的制备

200mg壳聚糖置于10ml小烧杯，加入0.1％醋酸9ml，待壳聚糖完全溶解后，高压蒸汽灭菌(121℃、20min)，5gβ-甘油磷酸钠置于10ml小烧杯，加入10ml培养基并0.22μm滤膜过滤除菌，250mg羟乙基纤维素照射除菌后，用10ml培养基溶解成2.5％溶液，三者按4∶1∶1比例混合可以配制出PH值为中性，室温流动性好的液态凝胶，放置孵箱中约10分钟即可呈固态凝胶状(图1)。

实施例2：壳聚糖水凝胶的组织相容性检测

壳聚糖水凝胶0.1ml注射植入S-D大鼠的大腿肌肉中，分别于1、2、3、4周处死，每次取2只，取出标本后进行石蜡切片，作HE染色观察炎性反应的情况。术后1周切片可见壳聚糖水凝胶广泛分布在心肌组织间隙，其间掺杂少许炎性细胞(图2A)；术后2周组可见壳聚糖水凝胶周围存在较为明显的炎性细胞浸润(图2B)；术后3周组未能见到明显的壳聚糖水凝胶，但炎性细胞浸润仍然明显(图2C)；术后4周未见明显的壳聚糖水凝胶样物质残留，但注射部位仍可见少量炎性细胞浸润(图2D)。

实施例3：动物的选择和心梗的制备

实验用S-D大鼠(225-300g左右)，戊巴比妥钠(40mg/kg体重)进行腹腔麻醉，与动物微量呼吸机连接。行开胸术，剪开心包，充分暴露心脏。在左心耳下缘2mm处，用0-7号丝线缝扎。结扎后左室壁变苍白，室壁运动减弱(图3A)。心电监护见I、II导联的ST段明显抬高，表明冠状动脉梗死动物模型制备成功(图3B)。

实施例4：壳聚糖水凝胶的促心肌血管生成功能检测

将240g左右的S-D大鼠20只随机分为壳聚糖水凝胶注射组、单纯心肌梗死模型组、PBS注射组。随机选取S-D大鼠8只，雌雄不限，戊巴比妥钠35mg/kg体重腹腔注射麻醉。通过大鼠冠状动脉结扎，致心肌梗死30分钟后，心肌缺血处注射壳聚糖水凝胶。术后1、2、4周，分别处死进行组织学、免疫组织化学检查。结果可见注射壳聚糖水凝胶的实验组较其它两个对照组提高了心梗部位的心室壁厚度，(图4)梗死部位的血管密度增加，存活的心肌数量增多，纤维化程度减轻。

实施例5：壳聚糖水凝胶携带生长因子促进心肌血管生成和改善心脏功能检测

将240g左右的S-D大鼠18只随机分为壳聚糖水凝胶携带生长因子注射组、PBS携带生长因子注射组、PBS注射组。随机选取S-D大鼠6只，雌雄不限，戊巴比妥钠35mg/kg体重腹腔注射麻醉。通过大鼠冠状动脉结扎，致心肌梗死30min后，心肌缺血处注射携带促生长因子(如1ug)壳聚糖水凝胶。注射后两天后进行超声心动图监测。术后4周，分别进行超声心动图和血流动力学检测后处死动物进行组织学、免疫组织化学检查。结果可见注射壳聚糖水凝胶携带生长因子的实验组较其它两个对照组的心功能明显改善，心梗部位心室壁厚度明显提高，梗死部位的血管密度明显增加(图5)，存活的心肌数量增多，纤维化程度减轻。

Claims (10)

1.一种用于治疗心肌梗死的可注射性组织工程产品，其特征在于所述的产品是基于壳聚糖水凝胶的促血管生长因子混合物，其中壳聚糖水凝胶是可注射的温敏性壳聚糖水凝胶，在室温条件下为液态，注射到体内后，短时间内能凝结为固态。

2.按权利要求1中所述的可注射性组织工程产品，其中促血管生长因子既可以是FGF、VGEF、PDGF中的任何一种，也可以是FGF、VGEF、PDGF中任何两种或以上。

3.按权利要求2中所述的可注射性组织工程产品，其中所述的FGF是包含aFGF、bFGF等在内的FGF家族。

4.按权利要求2中所述的可注射性组织工程产品，其中所述的VEGF是包括VEGF-A、VEGF-B等在内的VEGF家族。

5.按权利要求2中所述的可注射性组织工程产品，其中所述的PDGF包括PDFG-AA、PDGF-AB、PDGF-BB等在内的PDGF家族。

6.按权利要求1-5任一所述的可注射性组织工程产品，其中心肌梗死是急性心肌梗死，或是陈旧性心肌梗死。

7.用于制备权利要求1-6中任一所述的可注射性组织工程产品的方法，包括：

(1)温敏性壳聚糖水凝胶的制备：

准备1％-3％壳聚糖(C)溶液；10％-50％β-甘油磷酸钠(GP)水溶液；1％-4％羟乙基纤维素(HEC)溶液；

然后上述三种溶液按照C∶GP∶HEC＝4∶1∶1的比例在室温下混合成液态，37℃条件下即可凝结为固态；

(2)根据公知常识，选择合适的缓冲液制备促血管生长因子溶液；

(3)基于温敏性壳聚糖水凝胶和促血管生长因子治疗心梗产品的制备：

取配制好的促血管生长因子溶液，同制备好的温敏性壳聚糖水凝胶充分混合均匀。

8.权利要求7所述的方法，其中在步骤(2)中，

a.如果是bFGF溶液，可用pH值7.2-7.8的PBS溶解；

b.如果是PDGF-BB溶液，可溶于无菌的100mM醋酸和0.1％BSA，可被其他溶液进一步稀释；

c.如果是VEGF溶液，溶于去离子水，可被其他溶液进一步稀释；

d.如果是其它促血管生长因子溶液，可使用适宜的常规溶液进行溶解。

9.权利要求7或8所述的方法，其中在步骤(3)中：

可将20ng-500ug的bFGF溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合；

或将20ng-500ug的PDGF-BB溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合；

或20ng-500ug的VEGF溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合等。

10.权利要求7或8所述的方法，其中在步骤(3)中：

将20ng-500ug的bFGF联合VEGF溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合；

或20ng-500ug的bFGF联合PDGF-BB溶液和温敏性壳聚糖水凝胶混合等。

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