CN110713533A - 一种25-羟基维生素d3抗原及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种25‑羟基维生素D3，本发明还提供了25‑羟基维生素D3的制备方法，步骤如下：a)以25‑羟基维生素D3为原料，将羟基进行保护；b)将羟基保护后的25‑羟基维生素D3经Wacker氧化A环末端双键成醛；c)将步骤b)得到的醛氧化成羧酸或还原成醇引出含羧基的偶联臂；d)将步骤c)得到的产物脱去羟基保护后形成含羧基的半抗原；e)将半抗原与大分子蛋白偶联，经纯化后，得到25‑羟基维生素D3抗原。本发明的有益效果是：整个制备工艺条件温和，没有苛刻的低温反应条件，氧化双键时也没有使用有毒的臭氧；另外通过氧化A环双键从19位引出偶联臂，制备的抗原最大程度保留了25‑羟基维生素D3的两个活性基团羟基，所得抗原有较强的特异性和较高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种25-羟基维生素D3抗原的制备方法。
背景技术
25-羟基维生素D3是人体内存储维生素D的主要形式之一，是人体内代谢活动不可缺少的营养物质。体内维生素D的缺乏，使儿童易患佝偻病，老人易导致骨质疏松症。
此外，近年来大量研究表明，维生素D的缺乏直接影响到人体内肿瘤的发生，特别是结肠癌、乳腺癌和***癌；维生素D是一种类固醇激素，有两个主要类型：维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化甾醇)。无论哪种形式的维生素D，在血液中均与结合蛋白结合后运输至肝脏，在肝脏中被转换成为25(OH)VD，而后在肾脏中被转化为1,25-(OH)2VD，这是维生素D发挥作用的生物活性成分。
但人体内循环中的1,25-(OH)2VD含量极少，半衰期仅有4h。而循环中的25(OH)VD含量是1,25-(OH)2VD的1000倍，是维生素D在循环中的主要存在形式，半衰期3周，能够反映人体维生素D的真实水平，是反映个体维生素D状态的最佳指标。
25-羟基维生素D3的定量检测主要有理化检验方法和免疫学方法。理化检验方法有液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)，由于存在其仪器昂贵、样品前处理复杂，且繁琐费时限制了其应用。免疫学方法有放射免疫测定、竞争蛋白结合测定、免疫层析技术和酶联免疫测定技术，由于具有灵敏、快速、特异和简便等优点，已成为一种必然的趋势。
目前合成25-羟基维生素D3抗原的方法主要从25-羟基维生素D3分子结构中的3位或25位点引出偶联臂，无法最大程度保留25-羟基维生素D3的两个活性基团羟基。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是提供一种25-羟基维生素D3，保留了羟基维生素D3的两个活性基团羟基，该抗原能产生强免疫应答性，灵敏度高，其结构式为：
在该结构式中，X-L-Y偶连臂有4种选择，分别是：
IA：X为C＝O，L-Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；
IB：X为C＝O，L为NH(CH2)nC＝O或p-NHPhC＝O，n为1-3，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；
IC：X为CH2O，L为(CH2)nC＝O，n为2-4，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；
ID：X为CH2O，L为C＝O(CH2)nC＝O，n为2-3，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种。
本发明还提供了25-羟基维生素D3的制备方法，具体步骤如下：
a)以25-羟基维生素D3为原料，将羟基进行保护；
b)将羟基保护后的25-羟基维生素D3经Wacker氧化A环末端双键成醛；
c)将步骤b)得到的醛氧化成羧酸或还原成醇引出含羧基的偶联臂；
d)将步骤c)得到的产物脱去羟基保护后形成含羧基的半抗原；
e)将半抗原与大分子蛋白偶联，经纯化后，得到25-羟基维生素D3抗原。
进一步的，步骤a)具体为：
25-羟基维生素D3的硅醚保护
取200mg25-羟基维生素D3Ⅰ溶于5mL DMF，加入150mg咪唑，降至0℃，加入250mg三异丙基氯硅烷(TIPSCl)，20-30℃反应15h；
停止反应，加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，室温搅拌10min，用200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，并有机层通过无水硫酸钠干燥，减压浓缩得431mg粗品Ⅱ。
进一步的，步骤b)具体为：
25-羟基维生素D3A环末端双键经过wacker氧化反应成醛。
取18mg PdCl2和98mg CuCl加入到250mL三口瓶中，加入7mL DMF和1mL水，室温搅拌下，通入氧气至反应液面下，反应0.5h，将431mg粗品Ⅱ溶于7mL DMF和1mL水，10分钟内将其加入到三口瓶中的反应液中，，室温搅拌并持续通入氧气反应15h；
停止反应，加入50mL水，用200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得452mg粗品，过硅胶柱得213mg化合物Ⅲ。
进一步的，在步骤c)、d)和e)中，根据偶连臂的4种选择，步骤c)、d)和e)可以由4中偶连臂分为4中不同方式，该4种方式具体步骤分别如下：
25-羟基维生素D3抗原ⅠA的合成：
取100mg化合物Ⅲ溶于4mL四氢呋喃和4mL水，降至0℃，加入100mg次氯酸钠，室温反应18h，加入5mL饱和氯化铵溶液搅拌10min，加入200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得92mg化合物Ⅳ；
取30mg化合物Ⅳ，溶于12mL四氢呋喃，加入20mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得22mg粗品，爬板得9mg化合物Ⅴ；
取9mg化合物Ⅴ，溶于0.5mLDMF，加入3mgNHS和5mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为12mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h；
将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠA；
25-羟基维生素D3抗原ⅠB的合成：
取62mg化合物Ⅳ溶于4mLDMF，加入10mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)和16mgDCC，室温下反应10h，再加入7mg 3-氨基丙酸，室温下反应12h，加入10mL水搅拌10min，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得65mg化合物Ⅵ；
取65mg化合物Ⅵ，溶于20mL四氢呋喃，加入42mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入20mL饱和碳酸氢钠溶液，加入150mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×30mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得31mg粗品，爬板得16mg化合物Ⅶ；
取16mg化合物Ⅶ，溶于0.5mLDMF，加入4mgNHS和7mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为13mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h。将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠB；
25-羟基维生素D3抗原ⅠC的合成：
取112mg化合物Ⅲ溶于5mL四氢呋喃，降至5℃，加入21mg硼氢化钠，室温反应12h，降至5℃，加入10mL饱和氯化铵搅拌10min，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得125mg粗品，爬板得89mg化合物Ⅷ；
取59mg化合物Ⅷ溶于5mLDMF，降至10℃，加入16mg3-溴丙酸乙酯和12mg碳酸钾，室温反应12h，过滤，滤液加入10mL水和100mL乙酸乙酯，萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得68mg化合物Ⅸ；
取68mg化合物Ⅸ溶于3mL乙醇，加入3mL浓度为7mg/mL的氢氧化钠水溶液，室温反应15h，用1N盐酸将pH调至5-6，减压浓缩干溶剂，用2×10mL乙醇提取浓缩物，将提取物爬板得13mg化合物Ⅹ；
取13mg化合物Ⅹ，溶于0.5mLDMF，加入4mgNHS和6mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到4mL浓度为11mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h；
将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠC；
25-羟基维生素D3抗原ⅠD的合成：
取30mg化合物Ⅷ溶于5mL吡啶，加入50mg丁二酸酐，回流反应15h，减压浓缩干溶剂，加入10mL水和100mL乙酸乙酯，萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得75mg粗品，爬板得32mg化合物Ⅺ；
取32mg化合物Ⅻ，溶于10mL四氢呋喃，加入22mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，加入150mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得21mg粗品，爬板得8mg化合物Ⅻ；
取8mg化合物Ⅻ，溶于0.5mLDMF，加入3mgNHS和5mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为10mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h。将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠD。
进一步的，在本发明中，步骤a)中羟基的保护为硅醚保护，硅醚为三异丙基硅醚、叔丁基二苯基硅醚或叔丁基二甲基硅醚的一种；
缚酸剂为咪唑或三乙胺中的一种，反应溶剂为乙腈、二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的一种，反应温度为0-30℃，反应时间为2-24h。
进一步的，在步骤b)中，Wacker氧化A环末端双键成醛的催化剂为PdCl2-CuCl或PdCl2-CuCl2，氧化剂为氧气，反应溶剂为DMF/H2O，反应温度为20-40℃，反应时间为2-30h。
进一步的，在步骤c)中，醛氧化成酸所用的氧化剂为次氯酸钠，反应溶剂为THF/H2O，反应温度为0-30℃，反应时间为2-24h；
醛还原成醇的还原剂为硼氢化钠，反应溶剂为四氢呋喃、甲醇或乙醇中的一种，反应温度为0-30℃，反应时间为2-24h；
当偶联臂为(IA)时，可将得到的酸直接进行下一步反应；
当偶联臂为(IB)时，可将得到的酸与含羧酸的胺类化合物进行缩合反应，得到偶联臂加长的含羧酸化合物，含羧酸的胺类化合物为氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸或对氨基苯甲酸中的一种；
当偶联臂为(IC)时，可将得到的醇与卤代烷烃酯进行缩合反应、水解反应得到偶联臂加长的含羧酸化合物，卤代烷烃酯为3-溴代丙酸乙酯、4-溴代丁酸乙酯或5-溴代戊酸乙酯中的一种；
当偶联臂为(ID)时，可将得到的醇通过醇与酸酐进行取代反应得到偶联臂加长的含羧酸化合物，酸酐为丁二酸酐或戊二酸酐。
进一步的，在步骤d)中，脱去羟基保护所用试剂为四丁基氟化铵或强碱，所述强碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
进一步的，在步骤e)中，半抗原与大分子蛋白偶联的方法为二环己基碳二亚胺(DCC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法，大分子蛋白质为BSA、KLH、OVA或BGG中的一种。
本发明的有益效果是：
整个制备工艺条件温和，没有苛刻的低温反应条件，氧化双键时也没有使用有毒的臭氧；另外通过氧化A环双键从19位引出偶联臂，制备的抗原最大程度保留了25-羟基维生素D3的两个活性基团羟基，所得抗原有较强的特异性和较高的灵敏度。
具体实施方式
以下对本发明作进一步阐述。
实施例1：
一种25-羟基维生素D3，其结构式为：
在该结构式中，X-L-Y偶连臂有4种选择IA、IB、IC、ID，分别是：
IA：X为C＝O，L-Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；
IB：X为C＝O，L为NH(CH2)nC＝O或p-NHPhC＝O，n为1-3，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；
IC：X为CH2O，L为(CH2)nC＝O，n为2-4，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；
ID：X为CH2O，L为C＝O(CH2)nC＝O，n为2-3，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种。
实施例2：
本发明公开了25-羟基维生素D3的制备方法，具体步骤如下：
a)以25-羟基维生素D3为原料，将羟基进行保护；
b)将羟基保护后的25-羟基维生素D3经Wacker氧化A环末端双键成醛；
c)将步骤b)得到的醛氧化成羧酸或还原成醇引出含羧基的偶联臂；
d)将步骤c)得到的产物脱去羟基保护后形成含羧基的半抗原；
e)将半抗原与大分子蛋白偶联，经纯化后，得到25-羟基维生素D3抗原。
进一步的，步骤a)具体为：
25-羟基维生素D3的硅醚保护
取200mg25-羟基维生素D3Ⅰ溶于5mL DMF，加入150mg咪唑，降至0℃，加入250mg三异丙基氯硅烷(TIPSCl)，20-30℃反应15h；
停止反应，加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，室温搅拌10min，用200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，并有机层通过无水硫酸钠干燥，减压浓缩得431mg粗品Ⅱ。
进一步的，步骤b)具体为：
25-羟基维生素D3A环末端双键经过wacker氧化反应成醛
取18mg PdCl2和98mg CuCl加入到250mL三口瓶中，加入7mL DMF和1mL水，室温搅拌下，通入氧气至反应液面下，反应0.5h，将431mg粗品Ⅱ溶于7mL DMF和1mL水，10分钟内将其加入到三口瓶中的反应液中，室温搅拌并持续通入氧气反应15h；
停止反应，加入50mL水，用200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得452mg粗品，过硅胶柱得213mg化合物Ⅲ。
进一步的，在步骤c)、d)和e)中，根据偶连臂的4种选择，步骤c)、d)和e)可以由4中偶连臂分为4中不同方式，该4种方式具体步骤分别如下：
25-羟基维生素D3抗原ⅠA的合成：
取100mg化合物Ⅲ溶于4mL四氢呋喃和4mL水，降至0℃，加入100mg次氯酸钠，室温反应18h，加入5mL饱和氯化铵溶液搅拌10min，加入200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得92mg化合物Ⅳ；
取30mg化合物Ⅳ，溶于12mL四氢呋喃，加入20mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得22mg粗品，爬板得9mg化合物Ⅴ；
取9mg化合物Ⅴ，溶于0.5mLDMF，加入3mgNHS和5mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为12mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h；
将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠA；
25-羟基维生素D3抗原ⅠB的合成：
取62mg化合物Ⅳ溶于4mLDMF，加入10mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)和16mgDCC，室温下反应10h，再加入7mg 3-氨基丙酸，室温下反应12h，加入10mL水搅拌10min，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得65mg化合物Ⅵ；
取65mg化合物Ⅵ，溶于20mL四氢呋喃，加入42mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入20mL饱和碳酸氢钠溶液，加入150mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×30mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得31mg粗品，爬板得16mg化合物Ⅶ；
取16mg化合物Ⅶ，溶于0.5mLDMF，加入4mgNHS和7mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到4mL浓度为13mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h。将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠB；
25-羟基维生素D3抗原ⅠC的合成：
取112mg化合物Ⅲ溶于5mL四氢呋喃，降至5℃，加入21mg硼氢化钠，室温反应12h，降至5℃，加入10mL饱和氯化铵搅拌10min，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得125mg粗品，爬板得89mg化合物Ⅷ；
取59mg化合物Ⅷ溶于5mLDMF，降至10℃，加入16mg3-溴丙酸乙酯和12mg碳酸钾，室温反应12h，过滤，滤液加入10mL水和100mL乙酸乙酯，萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得68mg化合物Ⅸ；
取68mg化合物Ⅸ溶于3mL乙醇，加入3mL浓度为7mg/mL的氢氧化钠水溶液，室温反应15h，用1N盐酸将pH调至5-6，减压浓缩干溶剂，用2×10mL乙醇提取浓缩物，将提取物爬板得13mg化合物Ⅹ；
取13mg化合物Ⅹ，溶于0.5mLDMF，加入4mgNHS和6mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到4mL浓度为11mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h；
将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠC；
25-羟基维生素D3抗原ⅠD的合成：
取30mg化合物Ⅷ溶于5mL吡啶，加入50mg丁二酸酐，回流反应15h，减压浓缩干溶剂，加入10mL水和100mL乙酸乙酯，萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得75mg粗品，爬板得32mg化合物Ⅺ；
取32mg化合物Ⅻ，溶于10mL四氢呋喃，加入22mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，加入150mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得21mg粗品，爬板得8mg化合物Ⅻ；
取8mg化合物Ⅻ，溶于0.5mLDMF，加入3mgNHS和5mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为10mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h。将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠD。
实施例3：
四种25-羟基维生素D3抗原的活性测试：利用胶体金免疫层析法对25-羟基维生素D3抗原进行检测。用喷膜机以1.0μg/cm的喷量，将四种25-羟基维生素D3抗原ⅠA、ⅠB、ⅠC和ⅠD分别以3.0mm的宽度喷在不同NC膜上，均以相同25-羟基维生素D3抗体标记胶体金，结合玻璃纤维纸及吸水纸，组装成试纸条，对试纸条进行检测。检测结果如下表：
从表可知：ⅠA、ⅠB、ⅠC和ⅠD抗原阴性检测T线显色强度均可达到G7以上，证明合成的25-羟基维生素D3抗原V活性较高，能被抗体所识别并发生高效结合，其中ⅠA阴性稍弱，可能为偶联臂较短原因。阳性检测证明25-羟基维生素D3的PBS溶液对合成的25-羟基维生素D3四种抗原均有竞争性抑制作用，且有较高灵敏度和梯度。
Claims (10)
1.一种25-羟基维生素D3抗原，其特征在于，其结构式为：
在该结构式中，X-L-Y偶连臂有4种选择，分别是：
IA：X为C＝O，L-Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；
IB：X为C＝O，L为NH(CH2)nC＝O或p-NHPhC＝O，n为1-3，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；
IC：X为CH2O，L为(CH2)nC＝O，n为2-4，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；
ID：X为CH2O，L为C＝O(CH2)nC＝O，n为2-3，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种。
2.一种制备如权利要求1所述的25-羟基维生素D3抗原的方法，其特征在于，该方法包括如步骤：
a)以25-羟基维生素D3为原料，将羟基进行保护；
b)将羟基保护后的25-羟基维生素D3经Wacker氧化A环末端双键成醛；
c)将步骤b)得到的醛氧化成羧酸或还原成醇引出含羧基的偶联臂；
d)将步骤c)得到的产物脱去羟基保护后形成含羧基的半抗原；
e)将半抗原与大分子蛋白偶联，经纯化后，得到25-羟基维生素D3抗原。
3.根据权利要求2所述的一种制备25-羟基维生素D3抗原的方法，其特征在于，步骤a)具体为：
25-羟基维生素D3的硅醚保护
取200mg25-羟基维生素D3Ⅰ溶于5mL DMF，加入150mg咪唑，降至0℃，加入250mg三异丙基氯硅烷(TIPSCl)，20-30℃反应15h；
停止反应，加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，室温搅拌10min，用200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，并有机层通过无水硫酸钠干燥，减压浓缩得431mg粗品Ⅱ。
4.根据权利要求2所述的一种制备25-羟基维生素D3抗原的方法，其特征在在于步骤b)具体为：
25-羟基维生素D3A环末端双键经过wacker氧化反应成醛
取18mg PdCl2和98mg CuCl加入到250mL三口瓶中，加入7mL DMF和1mL水，室温搅拌下，通入氧气至反应液面下，反应0.5h，将431mg粗品Ⅱ溶于7mL DMF和1mL水，10分钟内将其加入到三口瓶中的反应液中，室温搅拌并持续通入氧气反应15h；
停止反应，加入50mL水，用200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得452mg粗品，过硅胶柱得213mg化合物Ⅲ。
5.根据权利要求2所述的一种制备25-羟基维生素D3抗原的方法，其特征在在于步骤c)、d)和e)中，根据偶连臂的4种选择，步骤c)、d)和e)的4种具体步骤如下：
25-羟基维生素D3抗原ⅠA的合成：
取100mg化合物Ⅲ溶于4mL四氢呋喃和4mL水，降至0℃，加入100mg次氯酸钠，室温反应18h，加入5mL饱和氯化铵溶液搅拌10min，加入200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得92mg化合物Ⅳ；
取30mg化合物Ⅳ，溶于12mL四氢呋喃，加入20mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得22mg粗品，爬板得9mg化合物Ⅴ；
取9mg化合物Ⅴ，溶于0.5mLDMF，加入3mgNHS和5mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为12mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h；
将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠA；
25-羟基维生素D3抗原ⅠB的合成：
取62mg化合物Ⅳ溶于4mLDMF，加入10mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)和16mgDCC，室温下反应10h，再加入7mg 3-氨基丙酸，室温下反应12h，加入10mL水搅拌10min，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得65mg化合物Ⅵ；
取65mg化合物Ⅵ，溶于20mL四氢呋喃，加入42mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入20mL饱和碳酸氢钠溶液，加入150mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×30mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得31mg粗品，爬板得16mg化合物Ⅶ；
取16mg化合物Ⅶ，溶于0.5mLDMF，加入4mgNHS和7mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到4mL浓度为13mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h。将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠB；
25-羟基维生素D3抗原ⅠC的合成：
取112mg化合物Ⅲ溶于5mL四氢呋喃，降至5℃，加入21mg硼氢化钠，室温反应12h，降至5℃，加入10mL饱和氯化铵搅拌10min，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得125mg粗品，爬板得89mg化合物Ⅷ；
取59mg化合物Ⅷ溶于5mLDMF，降至10℃，加入16mg3-溴丙酸乙酯和12mg碳酸钾，室温反应12h，过滤，滤液加入10mL水和100mL乙酸乙酯，萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得68mg化合物Ⅸ；
取68mg化合物Ⅸ溶于3mL乙醇，加入3mL浓度为7mg/mL的氢氧化钠水溶液，室温反应15h，用1N盐酸将pH调至5-6，减压浓缩干溶剂，用2×10mL乙醇提取浓缩物，将提取物爬板得13mg化合物Ⅹ；
取13mg化合物Ⅹ，溶于0.5mLDMF，加入4mgNHS和6mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到4mL浓度为11mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h；
将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠC；
25-羟基维生素D3抗原ⅠD的合成：
取30mg化合物Ⅷ溶于5mL吡啶，加入50mg丁二酸酐，回流反应15h，减压浓缩干溶剂，加入10mL水和100mL乙酸乙酯，萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得75mg粗品，爬板得32mg化合物Ⅺ；
取32mg化合物Ⅻ，溶于10mL四氢呋喃，加入22mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，加入150mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得21mg粗品，爬板得8mg化合物Ⅻ；
取8mg化合物Ⅻ，溶于0.5mLDMF，加入3mgNHS和5mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为10mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h。将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D3抗原ⅠD。
6.根据权利要求2所述的一种制备25-羟基维生素D3抗原的方法，其特征在于，步骤a)中，羟基的保护为硅醚保护，硅醚为三异丙基硅醚、叔丁基二苯基硅醚或叔丁基二甲基硅醚的一种；
缚酸剂为咪唑或三乙胺中的一种，反应溶剂为乙腈、二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的一种，反应温度为0-30℃，反应时间为2-24h。
7.根据权利要求2所述的一种制备25-羟基维生素D3抗原的方法，其特征在于，步骤b)中，Wacker氧化A环末端双键成醛的催化剂为PdCl2-CuCl或PdCl2-CuCl2，氧化剂为氧气，反应溶剂为DMF/H2O，反应温度为20-40℃，反应时间为2-30h。
8.根据权利要求2所述的一种制备25-羟基维生素D3抗原的方法，其特征在于，步骤c)中，醛氧化成酸所用的氧化剂为次氯酸钠，反应溶剂为THF/H2O，反应温度为0-30℃，反应时间为2-24h；
醛还原成醇的还原剂为硼氢化钠，反应溶剂为四氢呋喃、甲醇或乙醇中的一种，反应温度为0-30℃，反应时间为2-24h；
当偶联臂为(IA)时，可将得到的酸直接进行下一步反应；
当偶联臂为(IB)时，可将得到的酸与含羧酸的胺类化合物进行缩合反应，得到偶联臂加长的含羧酸化合物，含羧酸的胺类化合物为氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸或对氨基苯甲酸中的一种；
当偶联臂为(IC)时，可将得到的醇与卤代烷烃酯进行缩合反应、水解反应得到偶联臂加长的含羧酸化合物，卤代烷烃酯为3-溴代丙酸乙酯、4-溴代丁酸乙酯或5-溴代戊酸乙酯中的一种；
当偶联臂为(ID)时，可将得到的醇通过醇与酸酐进行取代反应得到偶联臂加长的含羧酸化合物，酸酐为丁二酸酐或戊二酸酐。
9.根据权利要求2所述的一种制备25-羟基维生素D3抗原的方法，其特征在于，步骤d)中，脱去羟基保护所用试剂为四丁基氟化铵或强碱，所述强碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
10.根据权利要求2所述的制备25-羟基维生素D3抗原的方法，其特征在于，步骤e)中，半抗原与大分子蛋白偶联的方法为二环己基碳二亚胺(DCC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法，大分子蛋白质为BSA、KLH、OVA或BGG中的一种。
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