CN113214132A - 一种半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法 - Google Patents
一种半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，包括制备乙酸活性酯；将制备得到的乙酸活性酯与碘代甲状腺素反应合成中间体化合物1；将中间体化合物1和N‑羟基琥珀酰亚胺、缩合剂反应合成所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂。本发明具有原料价格低廉易得、合成步骤少、操作简单、提取纯化方便、收率高的优点，提出了一种全新的合成半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的解决方案，有利于解决小分子半抗原在制备单克隆抗体中合成人工抗原关键原料以及在开发临床检测甲功项目试剂盒中关键原料的问题。
Description
技术领域
本发明涉及化学合成技术领域，具体涉及的是一种半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法。
背景技术
目前合成半抗原乙酰碘代甲状腺素(T4和反T4、T3和反T3 以及T2和反T2)活性偶联试剂的方法较少，主要因为以下技术难题：在T4乙酰化中有用到乙酸酐在溶剂DMF中反应，但是碘代甲状腺素(T4和反T4、T3和反T3以及T2和反T2)在有机溶剂或水中的溶解性不好，造成反应时间长，收率低，副反应多，提纯困难。并且该工艺用到的乙酸酐是国家管制的易制毒化学品，原料并不易获得。
碘代甲状腺素是分子质量小于1000u，属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原。碘代甲状腺素中有氨基、羧基和酚羟基。设计合成保留原分子结构特征并带有活性基团的半抗原，通过共价键使半抗原与大分子质量蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫程序制备针对该半抗原的特异性抗体。
碘代甲状腺素是小分子半抗原，缺乏可作免疫检测夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗夹心法进行测定，只能采用竞争法模式检测，而在现行的主流化学发光免疫检测试剂盒的开发中，需要用到和半抗原碘代甲状腺素结构类似的活性衍生物试剂去和载体蛋白偶联形成抗原标记物，和待检样品中的游离抗原进行竞争反应。
因此开发出低成本、易操作和原料便宜易得的通用工艺合成半抗原碘代甲状腺素活性偶联试剂的方法非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种半抗原乙酰碘代甲状腺素(包括T4和反T4、T3和反T3以及T2和反T2)活性偶联试剂的制备方法。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
本发明公开了一种半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备乙酸活性酯；
S2、将制备得到的乙酸活性酯与碘代甲状腺素反应合成中间体化合物1；
S3、将中间体化合物1和N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂反应合成所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂2；
合成反应式为：
作为本发明实施方式的进一步改进，所述碘代甲状腺素的通式如式A和式B所示，所述式B为式A的反式；
其中的R1和R2基团为氢或者碘；式A包括T4、T3或T2；式B包括反T4、反T3和反T2；
具体化学式表示如下：
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S1中制备乙酸活性酯的具体步骤为把乙酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入到第一反应溶剂中，第一预设反应温度以下缓慢加入缩合剂，第二预设反应温度下反应第一预设反应时间以上；所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2中合成中间体化合物1的具体步骤包括：
把碘代甲状腺素加入到第一反应溶剂中，且进一步在碱性水溶液中混合溶解碘代甲状腺素得到碘代甲状腺素溶液；
在氮气保护下，将步骤S1中制备得到的乙酸活性酯溶液滴加到所述碘代甲状腺素溶液中，室温反应第二预设反应时间以上，反应完成后用稀酸调PH为酸性，萃取剂萃取3次，饱和NaCl水溶液洗2次，萃取液用干燥剂干燥，在旋转蒸发仪中除去萃取剂，得到中间体化合物1。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S3的具体步骤为氮气保护下，把中间体化合物1和HOSU加入到第二反应溶剂中，第一预设反应温度以下加入缩合剂，在第三预设反应温度下反应第三预设反应时间以上，反应完成后加水稀释，加入预设量的萃取剂萃取3次，加入饱和NaCl水溶液洗2次，萃取液用干燥剂干燥，在旋转蒸发仪中除去萃取剂，过柱提纯，洗脱剂用 EA:DCM:PE＝1:1:1，得到类白色固体粉末，即为所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S1中第一反应溶剂为DMF或DMSO；所述第一预设反应温度和第二预设反应温度为10℃-50℃；所述第一预设反应时间为0.5h-24h。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述第二预设反应时间为 0.5h-24h；所述步骤S3中的第二反应溶剂为DMF或DMSO；第三预设反应时间为0.5h-24h；
所述第三预设反应温度为10℃-50℃；所述缩合剂为1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S1中的所述第一预设反应温度为20℃，所述第二预设反应温度为25℃；所述步骤S2中所述第二预设反应时间为1h。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2和S3中萃取剂为EA或DCM；所述步骤S2和S3中干燥剂为无水Na2SO4或无水MgSO4；
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2中稀酸为稀盐酸水溶液或稀硫酸水溶液、稀柠檬酸水溶液；
作为本发明实施方式的进一步改进，所述碱性水溶液中的碱为 K2CO3、Na2CO3、NaHCO3中的至少一种或者任意几种的混合物。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S3后处理的产物经200-300目硅胶过柱提纯得到所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种全新的制备半抗原乙酰碘代甲状腺素(T4 和反T4、T3和反T3以及T2和反T2)活性偶联试剂的工艺方法，以便宜的乙酸和碘代甲状腺素(T4和反T4、T3和反T3以及T2 和反T2)为开始原料，替换了国家管制的易制毒化学品乙酸酐原料，用无机碱在混合溶剂DMF和水中溶解碘代甲状腺素的通用工艺方法合成不同的目标产品，不需要提纯中间体化合物1，步骤简单，处理方便，省去了提纯中间体化合物1的操作，降低了成本，缩短了生产周期，操作简单，并且还提高了收率；本发明制备得到的乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂很容易和载体蛋白质中的氨基发生反应得到人工抗原，且本发明首次提出了合成半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的解决方案，解决了这些小分子半抗原在制备单克隆抗体中合成人工抗原关键原料以及在开发临床检测甲功项目试剂盒中关键原料的问题。
需要说明的是，本发明中用到的试剂缩写表示如下：
T4：四碘甲状腺原氨酸
T3：三碘甲状腺原氨酸
T2：二碘甲状腺原氨酸
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
EA:乙酸乙酯
DCM:二氯甲烷
HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺
EDC·HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
K2CO3：碳酸钾
Na2CO3：碳酸钠
NaHCO3：碳酸氢钠
HCl：氯化氢
Na2SO4：硫酸钠
MgSO4：硫酸镁。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
本发明公开了一种半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备乙酸活性酯；
S2、将制备得到的乙酸活性酯与碘代甲状腺素反应合成中间体化合物1；
S3、将中间体化合物1和N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂反应合成半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂2；
合成反应式为：
其中，碘代甲状腺素的通式如式A和式B所示，式B为式A的反式；
其中的R1和R2基团为氢或者碘；式A包括T4、T3或T2；式B包括反T4、反T3和反T2；
具体化学式表示如下：
具体地，步骤S1中制备乙酸活性酯的具体步骤为把乙酸和N- 羟基琥珀酰亚胺加入到第一反应溶剂中，第一预设反应温度以下缓慢加入缩合剂，第二预设反应温度下反应第一预设反应时间以上；所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
其中，步骤S1中第一反应溶剂为DMF或DMSO；所述第一预设反应温度和第二预设反应温度为10℃-50℃；所述第一预设反应时间为0.5h-24h。
进一步地，步骤S2中合成中间体化合物1的具体步骤包括：
把碘代甲状腺素加入到第一反应溶剂中，且进一步在碱性水溶液中混合溶解碘代甲状腺素得到碘代甲状腺素溶液；
在氮气保护下，将步骤S1中制备得到的乙酸活性酯溶液滴加到所述碘代甲状腺素溶液中，室温反应第二预设反应时间以上，反应完成后用稀酸调PH为酸性，萃取剂萃取3次，饱和NaCl水溶液洗2次，萃取液用干燥剂干燥，在旋转蒸发仪中除去萃取剂，得到中间体化合物1。
具体地，步骤S3的具体步骤为氮气保护下，把中间体化合物1 和HOSU加入到第二反应溶剂中，第一预设反应温度以下加入缩合剂，在第三预设反应温度下反应第三预设反应时间以上，反应完成后加水稀释，加入预设量的萃取剂萃取3次，加入饱和NaCl水溶液洗2次，萃取液用干燥剂干燥，在旋转蒸发仪中除去萃取剂，过柱提纯，洗脱剂用EA:DCM:PE＝1:1:1，得到类白色固体粉末，即为所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂。
其中，第二预设反应时间为0.5h-24h，优选为1h以上；所述步骤S3中的第二反应溶剂为DMF或DMSO；第三预设反应时间为 0.5h-24h；
优选地，第三预设反应温度为10℃-50℃；缩合剂为1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
优选地，步骤S1中的所述第一预设反应温度为20℃，所述第二预设反应温度为25℃；步骤S2中所述第二预设反应时间为1h。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2和S3中萃取剂为EA或DCM；所述步骤S2和S3中干燥剂为无水Na2SO4或无水MgSO4；
需要说明的是，步骤S2中稀酸为稀盐酸水溶液或稀硫酸水溶液、稀柠檬酸水溶液；
而碱性水溶液中的碱为K2CO3、Na2CO3、NaHCO3中的至少一种或者任意几种的混合物。
在本发明实施例中，步骤S3后处理的产物经200-300目硅胶过柱提纯得到所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂。
具体例1
S1和S2中中间体化合物1的合成具体实验条件包括：氮气保护下，把乙酸(0.7g，3eq)和HOSU(1.3g，3eq)加入到DMF(10ml) 中，20℃以下缓慢加入EDC·HCl(2.2g，3eq)，25℃反应1h以上。再把T4(3g，1eq)加入到DMF(15ml)中，把K2CO3(1.6g，3eq) 加入到水(20ml)中溶解，然后混合溶解T4。再把反应好的乙酸活性酯溶液滴加到T4溶液中，室温反应1h，反应完成后，用稀HCl水溶液调PH为酸性，适量的EA萃取3次，饱和NaCl水溶液洗2次，EA 溶液用无水Na2SO4干燥，在旋转蒸发仪中除去EA，无需纯化，直接用于下步反应；
S3、产物2的合成：氮气保护下，把中间体化合物1(1.5g，1eq) 和HOSU(0.26g，1.2eq)加入到DMF(20ml)中，20℃以下加入EDC·HCl(0.43g,1.2eq)，再25℃反应1h以上，反应完成后加入适量的水，适量的EA萃取3次，适量的饱和NaCl水溶液洗2次，EA溶液用无水Na2SO4干燥，在旋转蒸发仪中除去EA，过柱提纯，洗脱剂用 EA:DCM:PE＝1:1:1，得到1.57g类白色固体粉末，两步总收率83％， HPLC纯度98.08％，1H NMR(DMSO-d6)9.29(s,1H),8.65(d，1H)， 7.93(s,2H)，7.06(s，2H),5.01(m，1H)，3.23(dd，1H)，2.96 (m，1H)，2.83(s，4H)，1.82(s，3H)。
具体例2
S1和S2、中间体化合物1的合成：氮气保护下，把乙酸(0.82g， 3eq)和HOSU(1.6g，3eq)加入到DMF(10ml)中，20℃以下缓慢加入EDC·HCl(2.65g，3eq)，25℃反应1h以上。再把T3(3g， 1eq)加入到DMF(15ml)中，把K2CO3(1.9g，3eq)加入到水(20ml) 中溶解，然后混合溶解T3。再把反应好的乙酸活性酯溶液滴加到T3 溶液中，室温反应1h以上，反应完成后，用稀HCl水溶液调PH为酸性，适量的EA萃取3次，饱和NaCl水溶液洗2次，EA溶液用无水 Na2SO4干燥，在旋转蒸发仪中除去EA，无需纯化，直接用于下步反应；
S3、产物2的合成：氮气保护下，把化合物1(1.5g，1eq)和 HOSU(0.3g，1.2eq)加入到DMF(20ml)中，20℃以下加入EDC·HCl (0.5g,1.2eq)，再25℃反应1h以上，反应完成后加入适量的水，适量的EA萃取3次，适量的饱和NaCl水溶液洗2次，EA溶液用无水Na2SO4干燥，在旋转蒸发仪中除去EA，过柱提纯，洗脱剂用 EA:DCM:PE＝1:1:1，得到1.55g类白色固体粉末，两步总收率81％， HPLC纯度98.23％，1H NMR(DMSO-d6)9.99(s，1H)，8.62 (d,1H),7.91(s，2H)，6.96(d，1H),6.82(d，1H)，6.60(dd， 1H)，4.99(m，1H)，3.21(dd，1H)，2.95(m，1H)，2.83(s，4H)， 1.82(s，3H)。
具体例3
S1、S2中间体化合物1的合成的具体实验条件：氮气保护下，把乙酸(1g，3eq)和HOSU(2g，3eq)加入到DMF(10ml)中， 20℃以下缓慢加入EDC·HCl(3.3g，3eq)，25℃反应1h以上。再把 T2(3g，1eq)加入到DMF(15ml)中，把K2CO3(2.4g，3eq)加入到水(20ml)中溶解，然后混合溶解T2。再把反应好的乙酸活性酯溶液滴加到T2溶液中，室温反应1h以上，反应完成后，用稀HCl 水溶液调PH为酸性，适量的EA萃取3次，饱和NaCl水溶液洗2次，EA溶液用无水Na2SO4干燥，在旋转蒸发仪中除去EA，无需纯化，直接用于下步反应；
S3、产物2的合成：氮气保护下，把化合物1(1.5g，1eq)和 HOSU(0.37g，1.2eq)加入到DMF(20ml)中，20℃以下加入EDC·HCl (0.62g,1.2eq)，再25℃反应1h以上，反应完成后加入适量的水，适量的EA萃取3次，适量的饱和NaCl水溶液洗2次，EA溶液用无水 Na2SO4干燥，在旋转蒸发仪中除去EA，过柱提纯，洗脱剂用EA:DCM:PE＝1:1:1，得到1.68g类白色固体粉末，两步总收率84％， HPLC纯度98.36％，1H NMR(DMSO-d6)9.10(s，1H)，8.62 (d,1H),7.90(s，2H)，6.67(d，2H),6.52(d，2H)，4.97(m，1H)， 3.21(dd，1H)，2.96(m，1H)，2.83(s，4H)，1.83(s，3H)。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种全新的制备半抗原乙酰碘代甲状腺素(T4 和反T4、T3和反T3以及T2和反T2)活性偶联试剂的工艺方法，以便宜的乙酸和碘代甲状腺素(T4和反T4、T3和反T3以及T2 和反T2)为开始原料，替换了国家管制的易制毒化学品乙酸酐原料，用无机碱在混合溶剂DMF和水中溶解碘代甲状腺素的通用工艺方法合成不同的目标产品，不需要提纯中间体化合物1，步骤简单，处理方便，省去了提纯中间体化合物1的操作，降低了成本，缩短了生产周期，操作简单，并且还提高了收率；本发明制备得到的乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂很容易和载体蛋白质中的氨基发生反应得到人工抗原，且本发明首次提出了合成半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的解决方案，解决了这些小分子半抗原在制备单克隆抗体中合成人工抗原关键原料以及在开发临床检测甲功项目试剂盒中关键原料的问题。
Claims (10)
1.一种半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备乙酸活性酯；
S2、将制备得到的乙酸活性酯与碘代甲状腺素反应合成中间体化合物1；
S3、将中间体化合物1和N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂反应合成所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂2；
合成反应式为：
2.根据权利要求1所述的半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述碘代甲状腺素的通式如式A和式B所示，所述式B为式A的反式；
其中的R1和R2基团为氢或者碘；式A包括T4、T3或T2；式B包括反T4、反T3和反T2；
具体化学式表示如下：
3.根据权利要求1所述的半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中制备乙酸活性酯的具体步骤为把乙酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入到第一反应溶剂中，第一预设反应温度以下缓慢加入缩合剂，第二预设反应温度下反应第一预设反应时间以上；所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
4.根据权利要求3所述的半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中合成中间体化合物1的具体步骤包括：
把碘代甲状腺素加入到第一反应溶剂中，且进一步在碱性水溶液中混合溶解碘代甲状腺素得到碘代甲状腺素溶液；
在氮气保护下，将步骤S1中制备得到的乙酸活性酯溶液滴加到所述碘代甲状腺素溶液中，室温反应第二预设反应时间以上，反应完成后用稀酸调PH为酸性，萃取剂萃取3次，饱和NaCl水溶液洗2次，萃取液用干燥剂干燥，在旋转蒸发仪中除去萃取剂，得到中间体化合物1。
5.根据权利要求4所述的半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的具体步骤为氮气保护下，把中间体化合物1和HOSU加入到第二反应溶剂中，第一预设反应温度以下加入缩合剂，在第三预设反应温度下反应第三预设反应时间以上，反应完成后加水稀释，加入预设量的萃取剂萃取3次，加入饱和NaCl水溶液洗2次，萃取液用干燥剂干燥，在旋转蒸发仪中除去萃取剂，过柱提纯，洗脱剂用EA:DCM:PE＝1:1:1，得到类白色固体粉末，即为所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂。
6.根据权利要求3所述的半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中第一反应溶剂为DMF或DMSO；所述第一预设反应温度和第二预设反应温度为10℃-50℃；所述第一预设反应时间为0.5h-24h。
7.根据权利要求5所述的半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述第二预设反应时间为0.5h-24h；所述步骤S3中的第二反应溶剂为DMF或DMSO；第三预设反应时间为0.5h-24h；
所述第三预设反应温度为10℃-50℃；所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
8.根据权利要求6所述的半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的所述第一预设反应温度为20℃，所述第二预设反应温度为25℃；所述步骤S2中所述第二预设反应时间为1h。
9.根据权利要求5所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2和S3中萃取剂为EA或DCM；所述步骤S2和S3中干燥剂为无水Na2SO4或无水MgSO4；
所述步骤S2中稀酸为稀盐酸水溶液或稀硫酸水溶液、稀柠檬酸水溶液；
所述碱性水溶液中的碱为K2CO3、Na2CO3、NaHCO3中的至少一种或者任意几种的混合物。
10.根据权利要求5所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3后处理的产物经200-300目硅胶，过柱提纯得到所述半抗原乙酰碘代甲状腺素活性偶联试剂。
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