CN109652569A - 一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒，它包含：鸡白痢沙门氏菌特异引物、PCR缓冲液、PCR enhancer、dNTP、DNA聚合酶Tfl和DNA聚合酶KOD；所述鸡白痢沙门氏菌特异引物的序列如SEQ ID NO.11‑12所示；所述PCR缓冲液含有200‑260摩尔份的Tris‑HCl、4‑8摩尔份的MgCl2、50‑120摩尔份的(NH4)2SO4、90‑110摩尔份的KCl和1‑3体积份Triton X‑100；当所述KCl的量90‑110mmol时，所述Triton X‑100的量为1‑3ml。本发明还提供了对应的使用方法，对应的聚合酶Tfl和DNA聚合酶KOD的用量比例为(1‑30):1。本发明能特异、灵敏地检测鸡白痢沙门氏菌以及其他沙门氏菌，在禽类疾病防控上具有良好的应用前景。

Description

一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及细菌检测领域，尤其涉及一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒和鸡白痢沙门氏菌的检测方法。
背景技术
沙门氏菌是常见的重要***共患病原菌，根据沙门菌对不同宿主的侵袭力差异可以分为广嗜性沙门氏菌和宿主专嗜性特异性沙门氏菌。鸡是沙门氏菌最主要的宿主，鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌仅感染鸡和火鸡，具有高度宿主适应性和宿主专嗜性，可以引起雏鸡急性败血症，导致很高的发病率和病死率；鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌血清型感染鸡群引起的，主要是存在于卵巢、睾丸、肝脏等器官，可由感染的父母代鸡传染给雏鸡。2周以下的雏鸡发病后死亡率可达40％-70％，受感染的雏鸡在4-7d死亡，急性时可在1-3d死亡。控制鸡白痢沙门氏菌病原传播最有效的措施是严格管理结合根除计划。因此，快速鉴定和清除感染的父母代鸡群至关重要。对病原菌及时、准确地检测和诊断是鸡场有效防治与净化沙门氏菌的重要手段。
国内外针对沙门氏菌属已建立的单重及多重PCR方法，多用于检测菌株的血清型、毒力因子或耐药基因，而针对沙门氏菌属中的鸡白痢沙门氏菌的快速检测和诊断手段报道较少。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒，它包含：鸡白痢沙门氏菌特异引物、PCR缓冲液、PCR enhancer、dNTP、DNA聚合酶Tfl和DNA聚合酶KOD；
所述鸡白痢沙门氏菌特异引物的序列如SEQ ID NO.11-12所示；
所述PCR缓冲液含有200-260摩尔份的Tris-HCl、4-8摩尔份的MgCl2、50-120摩尔份的(NH4)2SO4、90-110摩尔份的KCl和1-3体积份Triton X-100；当所述KCl的量90-110mmol时，所述Triton X-100的量为1-3ml；
所述PCR enhancer含有2500-2800摩尔份甜菜碱、6-7.5摩尔份二硫苏糖醇、65-70体积份的DMSO和50-60质量份的BSA；当所述甜菜碱为2.5-2.8mol时，二硫苏糖醇为6-7.5mmol、DMSO为65-70ml、BSA为50-60mg。
进一步地，所述PCR缓冲液含有240摩尔份的Tris-HCl、4摩尔份的MgCl2、110摩尔份的(NH4)2SO4、100摩尔份的KCl和2体积份Triton X-100；当所述KCl的量100mmol时，所述Triton X-100的量为2ml。
进一步地，所述PCR缓冲液是2倍浓度的缓冲液，其中含有：Tris-HCl 240mM、MgCl24mM、(NH4)2SO4 110mM、KCl 100mM、Triton X-100 0.2％(V)。
进一步地，所述PCR enhancer含有2700摩尔份甜菜碱、6.7摩尔份二硫苏糖醇、67体积份的DMSO和55质量份的BSA；当所述甜菜碱为2.7mol时，二硫苏糖醇为6.7mmol、DMSO为67ml、BSA为55mg。
进一步地，所述PCR enhancer是5倍浓度的浓缩液，其中含有：甜菜碱2.7M、二硫苏糖醇6.7mM、DMSO 6.7％(v)、BSA 55μg/mL。
进一步的，前述试剂盒还包括：16S通用引物和沙门氏菌属特异引物；
所述16S通用引物的序列如SEQ ID NO.17-18所示；
所述沙门氏菌属特异引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示。
本发明还提供了一种检测鸡白痢沙门氏菌的方法，它包含如下步骤：
1)获取待检样本DNA或经煮沸处理的样本上清液；
2)使用如权利要求6所述试剂盒组分进行三重PCR扩增，其反应条件是：95℃预变性5-10min后，94℃变性30-40s、56℃退火15-30s、72℃延伸80-100s，共30-45个循环；
3)凝胶电泳检测；
步骤2)中三对引物浓度比为沙门氏菌属特异引物∶鸡白痢沙门氏菌特异引物∶16S通用引物＝1∶0.5∶1；
步骤2)中DNA聚合酶浓度比为Tfl∶KOD＝(1-30)∶1。
进一步地，步骤2)所述的反应条件为：95℃预变性5min后，94℃变性30s、56℃退火15s、72℃延伸80s，共30个循环。
优选地，步骤2)中DNA聚合酶浓度比为Tfl∶KOD＝10∶1。
本发明通过对引物的合理设计和组合、缓冲液条件的优化、混合酶体系的配合，得到一种高效的鸡白痢沙门氏菌多重PCR检测体系和试剂盒，具有如下有益效果：
本发明的可以同时实现沙门氏菌属和鸡白痢沙门氏菌的特异性检测。
本发明的PCR体系可耐受检测样本中的多种杂质，无需DNA纯化即可对样本裂解上清进行PCR。
由于配合使用A家族DNA聚合酶Tfl和B家族DNA聚合酶KOD，加之引物设计得当，本发明还具有很高的灵敏度。本发明可检测浓度低至200CFU/mL的菌液；而现有关于鸡源沙门氏菌的检测方法，其最低检出下限为450CFU/mL，远高于本发明。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1鸡白痢沙门氏菌特异引物验证：A：traJ-476；B：ipaJ-417；C：traJ-387；1：鸡白痢沙门氏菌CVCC533；2：鸡白痢沙门氏菌CVCC528；3：鸡场分离菌1#(鉴定为鸡白痢沙门氏菌)；4：大肠杆菌JM-109；5：大肠杆菌BL-21；6：大肠杆菌JM-CPR；7：大肠杆菌DH-5α；8：肠炎沙门氏菌；9：富氏志贺菌；10：甲型副伤寒沙门氏菌；11：鼠伤寒沙门氏菌；12：鸡场分离菌2#(鉴定不是鸡白痢沙门氏菌)；13：鸡场分离菌3#(鉴定不是鸡白痢沙门氏菌)；14：大肠杆菌S17-1。
图2不同配方的共用反应缓冲液PCR扩增效果。
图3模板不同稀释度三重PCR扩增效果：M：maker；1-8分别为模板稀释倍数：6×、36×、216×、1296×、7776x、46656×、279936×。
图4养殖场鸡群泄殖腔样本直接多重PCR检测结果。
具体实施方式
本部分主要以实施例和实验例的方式对本发明进一步说明，涉及以下材料：
1.菌株：鸡白痢沙门氏菌标准株(CVCC533)、肠炎沙门氏菌CVCC3377、鼠伤寒沙门氏菌(CVCC2222)、大肠杆菌(CVCC25922)、金黄色葡萄球菌(CVCC25923)购自购自中国兽医药品监察所；部分菌株分离自四川圣地乐鸡场病鸡，由本室鉴定保存；其它菌株由本实验室保存；
2.沙门氏菌感染鸡群：由绵阳梓潼圣迪乐养殖场提供，经全血凝集实验鉴定；
3.试剂：dNTPs、DL2000Marker购自TaKaRa公司(大连)；Taq酶购自天根公司、DNAPolymerase KOD购自TOYOBO公司、Tfl DNA Polymerase为Promega产品；Buffer调试所需试剂Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、KCl、Triton X-100、BSA、DTT均为分子生物学级别，购自阿拉丁公司。
4.引物合成：由上海生工生物工程公司合成。
5.引物序列：如表1所示，表中SEQ ID NO.18第2或/和第14号碱基还可以为T。
表1引物序列
实施例1鸡白痢沙门氏菌特异靶标引物引物设计和测试
1.引物设计
在NCBI GenBank数据库中下载序列：pSPUV(JN885081)，pSGAV(CM001154.1)，pSDUV(NC_007208.1)，pSCSV(NC_006855.1)，pSPCV(NC_012124.1)，p14028S(CP001362.1)和pSLT(NC_003277.1)。通过MAUVE程序搜索pSPUV和其它VP之间的保守区域和特异区域。分歧程度由SITES程序计算，窗口大小为1000bp，步长为100bp。结合人工调整，在鸡白痢沙门氏菌毒力质粒pSPUV的特异区域设计检测引物。
得到如表1中的引物对：traJ-387-F/R、traJ-476-F/R和ipaJ-417-F/R，下文简称traJ-387、traJ-476和ipaJ-417。
2.引物验证
分别取验证菌株菌液各200μl，10000r/min离心3min后弃上清，用1ml无菌水洗一遍，10000r/min离心3min后用50μl无菌水重悬菌体，煮沸处理10min，12000r/min离心2min后上清作为PCR模板。PCR反应体系总体积为25μl，其中10×PCR buffer 2.5μl，dNTPs(2.5μmol/L)，特异引物各0.5μl，模板1μl，Taq酶0.5μl，三蒸水补充体积至25μl。PCR循环参数：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火20s，72℃延50s，经30个循环，最后72℃保温10min。电泳观察结果。
3.结果
图1-A可见，引物traJ-476在鸡白痢沙门氏菌标准株中均能扩增出单一清晰条带，而在沙门氏菌其它种以及肠道菌中目标位置皆没有出现条带。在提高退火温度至59℃退火15s时，原来肠炎沙门氏菌、福氏志贺菌、甲型副伤寒沙门氏菌和S17-1的非特异性条带都已消失，而对照菌株CVCC528在476bp处条带很亮且单一。
引物ipaJ-417在CVCC528未出现目的条带，具有偶然性，原因未明，此外，在8肠炎沙门氏菌、9福氏志贺菌；12：鸡白痢沙门氏菌和14S17-1中出现可不同程度的非特异扩增，在退火温度为59℃退火15s时，原来8肠炎沙门氏菌、9福氏志贺菌、12鸡场分离菌(已鉴定不是鸡白痢沙门氏菌)和S17-1的非特异性条带都已消失，而对照菌株CVCC528在417bp处条带很亮且单一。
引物traJ-387在8肠炎沙门氏菌在非主带位置出现一条非特异条带外，其他非鸡白痢菌中都没有非特异扩增，进一步提高退火温度57-60℃15-20s，58℃退火15s时，非特异条带变淡但没有消除，而到了60℃退火15s时，非特异条带仍然没有消除，且标准株中的特异条带亮度变暗，因此最适退火温度仍为58℃。
从图中看，设计的三对引物在鸡白痢沙门氏菌标准株中均能扩增出单一清晰条带，而在沙门氏菌其它种以及肠道菌中目标位置皆没有出现条带，且通过提高退火温度降低了非特异扩增，说明以上引物具备特异性，可以作为鸡白痢沙门氏菌的特异检测引物。
实施例2缓冲液调试
1.方法
选择两种不同类型的DNA聚合酶组合，根据市售商用酶用户手册和宣讲信息选择DNA聚合酶Tfl和KOD，以两种酶的反应缓冲液成分参考信息为基础，综合考虑各组分在PCR反应中对于特异性、反应效率的贡献水平，按照表2配制反应缓冲液系分别进行PCR，根据扩增效果筛选可供两种DNA聚合酶Tfl和KOD的共用反应缓冲液。
表2 DNA聚合酶不同反应缓冲液
2.结果
将两种不同的DNA聚合酶Tfl和KOD用不同配方的反应缓冲液进行PCR扩增效果比较(图2)，buffer 3#和7#都能够使分属于不同家族的DNA聚合酶同时发挥较好的扩增作用，buffer 3#效果最好。
因此，后续实验将buffer 3#作为混合酶的PCR反应buffer。
实施例3三重PCR引物筛选
三重PCR引物采用PCR体系验证引物(16S rDNA引物)、沙门氏菌属特异性引物以及本文筛选验证的鸡白痢沙门氏菌特异引物组成(表1)。根据不同片段长度及扩增效率进行组合筛选。
1.样品预处理
将鸡白痢沙门氏菌菌液10000r/min离心2min后弃上清，再用50μl无菌水重悬菌体，煮沸处理10min，最后12000r/min离心2min后上清作为PCR模板。
2.反应体系
PCR体系选用25μl体系，各个组分如表3，基础PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、56℃退火20s、72℃延伸1min20s，共30个循环。根据扩增效果，分别调整各引物浓度、两种DNA聚合酶的添加比例以及退火温度等。
表3三重PCR反应体系(ul)
PCR enhancer(5×)：Betaine 2.7M、DTT 6.7mM、DMSO 6.7％、BSA 55μg/ml；P1-P2为16S引物；P3-P4为沙门氏菌属特异引物；P5-P6为鸡白痢沙门氏菌特异引物。
3.结果
筛选到最佳引物组合为invA-211/traJ-387/16S-495。在样品预处理和扩增预变性的温度上做了调整，样品预处理为煮沸8min；预变性的温度为95℃，56℃退火15s，72℃延伸1min20s，循环数仍为30。三对引物浓度比，invA-211∶traJ-387∶16S-495＝1∶0.5∶1；混合酶浓度比Tfl∶KOD＝10∶1。
实施例4本发明的试剂盒
根据实施例1-3，可以直接得到本发明的试剂盒组成和使用方法。
1.本发明试剂盒由如下组分构成：
1)引物对：invA-211、traJ-387和16S-495；
2)2倍缓冲液：含有Tris-HCl 240mM、MgCl2 4mM、(NH4)2SO4 110mM、KCl 100mM、Triton X-100 0.2％(v)；
3)5倍PCR enhancer：含有甜菜碱2.7M、DTT 6.7mM、DMSO 6.7％(V)、BSA 55μg/ml；
4)DNA聚合酶Tfl和KOD；
5)dNTP。
2.本发明试剂盒的使用方法：
1)获取待检菌DNA或煮沸处理的菌液；
2)使用试剂盒组分进行三重PCR扩增，其反应条件是：95℃预变性5min后，94℃变性30s、56℃退火15s、72℃延伸1min20s，共30个循环；
3)凝胶电泳检测；
其中，步骤2)中三对引物浓度比为invA-211∶traJ-387∶16S-495＝1∶0.5∶1；DNA聚合酶浓度比为Tfl∶KOD＝(1-30)∶1。
实验例1三重PCR检测体系灵敏度测试
1.方法
取CVCC533菌株经平板划线纯化过夜培养，菌液用细菌计数板计数，通过稀释控制浓度于1×108/ml-3×108/ml。再取200μl菌液入EP管中，并加入1m1水，按6倍梯度稀释，共设8个梯度；菌液按梯度稀释好后10000r/min离心2min后弃上清，再用50μl无菌水重悬菌体，煮沸处理10min，最后12000r/min离心2min后上清作为PCR模板，按实施例3或4的方法进行PCR。
同时每管梯度稀释菌液充分混匀后皆取10μl涂平板，培养24h后进行菌落计数。
2.结果
由图3可知，泳道7、8分别为模板稀释46656×、279936×，三重PCR的条带依然可见。其中第7、8泳道细菌涂布结果有效计数分别为11个和2个菌落，则该模板菌液中的活菌浓度分别为：1.1×103CFU/ml、2×102CFU/ml。所以该三重PCR检测限为小于1000CFU/ml，可以快速准确的实现低浓度沙门氏菌样本的检测。
实验例2养殖场鸡群的PCR检测
1.方法
圣迪乐养殖场鸡群按全血平板凝集试验的方法筛选的感染沙门氏菌的阳性鸡，用消毒棉签通过泄殖腔采样后放入LB培养液试管中保存运输。1200r/min离心后去上清，加入灭菌水，混匀。沸水煮10min，1200r/min离心取上清做模板，按照实施例3或4的反应体系进行PCR。
2.结果
由图4可知，各泳道均扩增出沙门氏菌属特异条带，8/10/12号样品由于未扩增出16S条带，证明模板处理不合格，为确保避免假阳性结果出现，进行了重复验证试验，扩增出16S和沙门氏菌属特异条带(结果未呈现)。证明所有全血平板凝集试验的阳性鸡利用本检测方法结果均为阳性，判定为沙门氏菌感染。其中1-7和11号样品扩增出鸡白痢沙门氏菌特异条带，可以判定为鸡白痢沙门氏菌感染。
综上，本发明通过对引物的合理设计和组合、缓冲液条件的优化、A家族和B家族DNA聚合酶的配合使用，可以特异、灵敏地检测鸡白痢沙门氏菌以及其他沙门氏菌，在禽类疾病防控上具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒及其使用方法
<130> CD007-101012449
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<211> 25
<212> DNA
<213> traJ-387-R(artificial sequence)
<400> 12
agaactatga cttagtcctg aactg 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> traJ-476-F(artificial sequence)
<400> 13
tgtttcggga attgttcctg 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> traJ-476-R(artificial sequence)
<400> 14
caattcatcc ctgttacaga ctg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> ipaJ-417-F(artificial sequence)
<400> 15
gttgctgcta aagagcttgg aat 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> ipaJ-417-R(artificial sequence)
<400> 16
tcgctgaagc acccagtgta 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 16S-495-F(artificial sequence)
<400> 17
gagagtttga tcctggctca g 21
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 16S-495-R(artificial sequence)
<400> 18
gaattaccgc ggcggctg 18

Claims (9)

1.一种鸡白痢沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，它包含：鸡白痢沙门氏菌特异引物、PCR缓冲液、PCR enhancer、dNTP、DNA聚合酶Tfl和DNA聚合酶KOD；
所述鸡白痢沙门氏菌特异引物的序列如SEQ ID NO.11-12所示；
所述PCR缓冲液含有200-260摩尔份的Tris-HCl、4-8摩尔份的MgCl2、50-120摩尔份的(NH4)2SO4、90-110摩尔份的KCl和1-3体积份Triton X-100；当所述KCl的量90-110mmol时，所述Triton X-100的量为1-3ml；
所述PCR enhancer含有2500-2800摩尔份甜菜碱、6-7.5摩尔份二硫苏糖醇、65-70体积份的DMSO和50-60质量份的BSA；当所述甜菜碱为2.5-2.8mol时，二硫苏糖醇为6-7.5mmol、DMSO为65-70ml、BSA为50-60mg。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液含有240摩尔份的Tris-HCl、4摩尔份的MgCl2、110摩尔份的(NH4)2SO4、100摩尔份的KCl和2体积份Triton X-100；当所述KCl的量100mmol时，所述Triton X-100的量为2ml。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液是2倍浓度的缓冲液，其中含有：Tris-HCl 240mM、MgCl2 4mM、(NH4)2SO4 110mM、KCl 100mM、Triton X-100 0.2％(V)。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR enhancer含有2700摩尔份甜菜碱、6.7摩尔份二硫苏糖醇、67体积份的DMSO和55质量份的BSA；当所述甜菜碱为2.7mol时，二硫苏糖醇为6.7mmol、DMSO为67ml、BSA为55mg。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR enhancer是5倍浓度的浓缩液，其中含有：甜菜碱2.7M、二硫苏糖醇6.7mM、DMSO 6.7％(v)、BSA 55μg/mL。
6.如权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，还包括：16S通用引物和沙门氏菌属特异引物；
所述16S通用引物的序列如SEQ ID NO.17-18所示；
所述沙门氏菌属特异引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示。
7.一种检测鸡白痢沙门氏菌的方法，其特征在于，它包含如下步骤：
1)获取待检样本DNA或经煮沸处理的样本上清液；
2)使用如权利要求6所述试剂盒组分进行三重PCR扩增，其反应条件是：95℃预变性5-10min后，94℃变性30-40s、56℃退火15-30s、72℃延伸80-100s，共30-45个循环：
3)凝胶电泳检测；
步骤2)中三对引物浓度比为沙门氏菌属特异引物∶鸡白痢沙门氏菌特异引物∶16S通用引物＝1∶0.5∶1；
步骤2)中DNA聚合酶浓度比为Tfl∶KOD＝(1-30)∶1。
8.如权利要求7所述的检测鸡白痢沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤2)所述的反应条件为：95℃预变性5min后，94℃变性30s、56℃退火15s、72℃延伸80s，共30个循环。
9.如权利要求7所述的检测鸡白痢沙门氏菌的方法，其特征在于，步骤2)所述的DNA聚合酶浓度比为Tfl∶KOD＝10∶1。
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