CN110698328B

CN110698328B - 二氢白藜芦醇或其芪类衍生物和/或化学变体作为抗微生物剂的使用方法

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Publication number: CN110698328B
Application number: CN201910596632.1A
Authority: CN
Inventors: 张宏杰; 曾少慧
Original assignee: Hong Kong Baptist University HKBU
Current assignee: Hong Kong Baptist University HKBU
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2019-07-03
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2039-07-03
Also published as: CN110698328A

Abstract

本发明涉及一种用于预防或减少微生物生长的组合物，尤其是皮肤真菌和/或酸性和产酸性***的生长。更具体地说，它涉及反式‑3,5,4’‑三羟基二苯甲酰(也称为二氢白藜芦醇)或其二氢二苯乙烯衍生物和/或化学变体作为抗微生物剂的用途。本发明还涉及通常由皮肤真菌引起的皮肤癣菌病的管理和通常由酸性和产酸革兰氏阳性链球菌介导的龋齿的管理。因此，本发明在预防、减轻和/或治疗皮肤癣菌病和龋齿方面具有应用。

Description

二氢白藜芦醇或其芪类衍生物和/或化学变体作为抗微生物剂的使用方法

技术领域

本发明涉及一种用于预防或减少微生物生长的组合物，尤其是皮肤真菌和/或酸性和产酸性***的生长。更具体地说，它涉及反式-3,5,4’-三羟基二苯甲酰(也称为二氢白藜芦醇)或其二氢二苯乙烯衍生物和/或化学变体作为抗微生物剂的使用。本发明还涉及经常由皮肤真菌引起的皮肤癣菌病的管理和经常由酸性和酸性链球菌介导的龋齿的管理。因此，本发明在预防、减轻和/或治疗所述皮肤癣菌病和龋齿方面具有应用。

背景技术

皮肤癣，是指皮肤和指甲的感染，是全世界共同关注的公共卫生问题。通常，皮肤真菌病是由皮肤真菌引起的。足癣，又称运动员脚，是引起皮肤病的最常见的皮肤真菌形式。近年来，足癣的发病率一直在稳步上升，特别是在发达国家，高达15-25％的人口受到影响【Fay Crawford】。这种皮肤真菌感染经常在游泳运动员和跑步者身上发现，而老年人的感染率更高。大部分运动员脚部病例是由红色毛癣菌和须发藓菌引起的。人们普遍认为，闭塞是增强脚部皮肤真菌感染的关键，因为鞋子提供了一个封闭的环境，相对较高的湿度和温暖，是上述皮肤真菌生长的理想环境。本发明在最佳环境条件下培养，能显著降低红色毛癣菌和须发藓菌的生长。

目前常用的杀菌剂主要是偶氮类，可进一步分为伊曲康唑、酮康唑和氟康唑。其中，氟康唑被认为对多种真菌具有最大的最低抑菌浓度(MIC)。然而，红色毛癣菌和须发藓菌在不同水平上对上述三种氮化物表现出显著的抗性。因此，对新型高效抗真菌剂的发现和开发提出了更高的要求。

在过去的几十年里，许多药理学研究都集中在利用类药物小分子作为从草药成分，特别是多酚类芪类药物中提取的治疗剂上。事实上，芪类化合物是一类由一般的C6-C2-C6结构组成的化合物，它们通常作为单体和低聚物被分离出来，用作植物补充剂或药物制剂中的活性成分。越来越多的证据表明，芪类化合物是有效的抗氧化剂，因为它们中的大多数是作为抗非生物和生物应激因子的植物毒素产生的。此外，一些芪类化合物还被报道具有抗微生物活性，特别是抗真菌生长。

因此，使用二氢白藜芦醇或其二氢二苯乙烯衍生物和/或化学变体来制备抗真菌剂成为本发明的目标之一。

除了皮肤真菌病，龋齿(龋齿发生)也是一个常见的公共卫生问题，世界各地。一般而言，龋齿的特征是牙齿硬组织的停止或侵蚀，这可能导致牙齿疼痛、敏感牙齿和牙齿活力的丧失。长期以来，含有可发酵碳水化合物(主要是单、二和多糖)的食物被认为是导致龋齿的主要原因，因为它们是细菌(如变形链球菌和远缘链球菌)在口腔中容易利用的营养来源【van houte J】。事实上，这些***是耐酸菌(耐酸性)和产酸菌(产酸性)；它们将膳食糖(尤其是蔗糖)代谢为乳酸，从而导致牙釉质和牙本质脱矿。同时，它们合成的粘性大分子，如多糖，通过形成牙斑和生物膜，促进细菌附着在牙齿表面。结果，龋齿形成。此外，这些耐酸性和产酸性链球菌在培养初期和已建立的龋损后基本恢复。抑制上述链球菌，特别是变形链球菌，明显有利于减少牙斑和生物膜，从而减少龋齿的发生。本发明在最佳环境条件下培养的变形链球菌和远缘链球菌能显著降低其生长。

因此，使用二氢白藜芦醇或其二氢二苯乙烯衍生物和/或化学变体作为抗微生物剂的方法成为本发明的另一个目标。

发明内容

因此，本发明的第一方面涉及用于在发现微生物的区域预防或减少微生物生长的组合物，特别是红色毛癣菌、须发藓菌、变形链球菌和远缘链球菌的生长。更具体地说，它涉及反式-3,5,4’-三羟基二苯甲酰(也称为二氢白藜芦醇)或其二氢二苯乙烯衍生物和/或化学变体作为抗微生物剂的使用。本发明还涉及通常由红色毛癣菌和须发藓菌引起的皮肤癣菌病的管理；以及通常由变形链球菌和远缘链球菌介导的龋齿的管理。因此，本发明之应用在于预防、减轻或治疗皮肤癣菌病和龋齿方面。

在本发明第一方面的第一实施例中，提供了一种包含式(3)化合物的抗微生物剂：

其中

R²、R⁴和R⁸各自独立地选自-OR¹¹、-OCH₂R¹¹、-OC(O)R¹¹、-OCH₂C(O)OR¹¹和-OC(O)CH₂R¹¹；

R¹、R³、R⁵、R⁶、R⁷、R⁹和R¹⁰各自独立地选自氢、卤素、三氟甲基、-OR¹¹和-OC(O)R¹¹；或R²和R³、或R⁷和R⁸可连同其附接之碳原子一起形成环状基团；

R¹¹独立地为氢或选自烃基及杂环基，其任一者视情况经1个、2个、3个、4个或5个R¹²取代；

R¹²独立地选自卤素、三氟甲基、氰基、硝基、氧代、-OR¹³、-C(O)R¹⁴、-C(O)N(R¹³)R¹⁴、-C(O)OR¹³、-OC(O)R¹⁴、-S(O)₂R¹³、-S(O)₂N(R¹³)R¹⁴或-N(R¹³)R¹⁴；

R¹³和R¹⁴各自独立地为氢或选自烃基及杂环基，其任一者视情况经1个、2个、3个、4个或5个独立地选自卤素、氰基、胺基、羟基、C_1-6烷基或C_1-6烷氧基之取代基取代；

或其对映异构体；

或其药学上可接受的盐或前药；

或其混合物、衍生物和/或化学变体。

在本发明第一方面的第二实施例中，提供了一种抗微生物剂，其中所述化合物进一步包含以下式的化合物：

二氢白藜芦醇；

在本发明第一方面的第三个实施例中，提供了一种抗微生物剂，其中所述化合物进一步包含式(I)化合物：

其中R独立地或共同地为OC(＝O)R’；R’是烯基。

本发明的第二方面涉及一种预防、减轻和/或治疗皮肤癣菌病的方法，包括将本发明的抗微生物剂应用于需要的个体。

本发明的第三方面涉及一种预防、减轻和/或治疗龋齿的方法，包括将本发明的抗微生物剂应用于需要的个体。

本发明的第四方面涉及一种防止或减少微生物生长的方法，所述方法包括皮肤真菌和/或酸性和产酸性***，所述方法包括将本发明的抗微生物剂应用于所述位置发现皮肤真菌和/或所述酸性和产产酸性***。

在第一实施例中，所述皮肤真菌包括红色毛癣菌和须发藓菌。

在第二实施例中，所述酸性和产酸性***包括变形链球菌和远缘链球菌。

在第三实施方案中，所述抗微生物剂被配制为局部杀菌或抑菌凝胶、洗剂、乳膏、乳剂、糊剂、溶液或湿润喷雾，用于预防、减轻和/或治疗皮肤癣菌病。

在第四实施例中，所述抗微生物剂被配制为牙膏、口腔凝胶、牙刷消毒液、漱口剂或口香糖，用于预防、减轻和/或治疗龋齿。

在第五个实施例中，所述抗微生物剂的浓度在用于预防、减轻和/或治疗皮肤癣菌病的方法中为25μM到100μM。

在第六个实施例中，所述抗微生物剂的浓度在用于预防、减轻和/或治疗龋齿的方法中为25μM到100μM。

在第七个实施例中，所述抗微生物剂的浓度在25μM到100μM范围内，用于防止或减少皮肤真菌的生长。

在第八个实施例中，所述抗微生物剂的浓度在25μM到100μM范围内，用于预防或减少酸性和产酸性***的生长。

在第九实施例中，在需要本发明抗微生物剂的个体的足癣中发现皮肤真菌。

在第十实施例中，在需要本发明的抗微生物剂的个体的口腔中发现了酸性和产酸性***。

熟习此项技术者应了解，本文中所描述之本发明除特定描述之彼等内容外允许进行变化及修改。

本发明包括全部此类变化及修改。本发明亦包括本说明书中单独或集体提及或指示的所有步骤及特征，以及该等步骤或特征中之任两者或超过两者的任何及所有组合。

在本说明书通篇中，除非本文另有规定，否则词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式应理解为意指包括所陈述整体或整体的群组，但不排除任何其他整体或整体的群组。在本发明中且尤其在申请专利范围及/或段落中亦应注意，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”及其类似术语之术语可具有对应专利法中归属于其之含义；例如其可意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”及其类似物；且诸如“基本上由……组成(consistingessentially of)”及“基本上由……组成(consists essentially of)”之术语具有美国专利法中归属于其之含义，例如其使得要素无需明确列举，但排除先前技术中所发现或影响本发明之基础或新颖特征的要素。

此外，在本说明书及申请专利范围通篇中，除非本文另有规定，否则词语“包括(include)”或诸如“包括(includes)”或“包括(including)”的变化形式应理解为意指包括所陈述整体或整体的群组，但不排除任何其他整体或整体的群组。

本文所用术语的其他定义可在本发明的详细说明中找到并贯穿始终。除非另有定义，否则本文使用的所有其他技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员从随后的描述的回顾中显而易见。

附图说明

结合附图，从本发明的以下描述中可以看出本发明的上述和其他目的和特征，其中：

图1显示了由于蛙皮素诱导的急性胰腺炎引起的胰腺水肿导致的大鼠体内水分增加。所得重量表示为胰腺重量与体重的比例。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与蛙皮素组比较。

图2A至2F显示对照组(图2A)、蛙皮素组(图2B)和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)(图2C至2F)的胰腺组织结构和形态变化，采用苏木精和伊红(H&E)染色。图像以50μm的比例尺显示。

图3A至3E显示了对照组(图3A)、蛙皮素组(图3B)和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)(图3C至3E)肺组织的结构和形态变化。图像以200倍的放大倍数显示。

图4A显示了用比色分光亮度法测量的MPO活性，它表示对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)胰腺组织中中性粒细胞的滞留。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与蛙皮素组比较。

图4B显示了用比色分光亮度法测量的MPO活性，它表示对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)肺组织中中性粒细胞的滞留。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与蛙皮素组比较。

图5A显示了用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)胰腺组织中TNF-α水平。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与蛙皮素组比较。

图5B显示了用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)肺组织中TNF-α水平。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与蛙皮素组比较。

图6A显示了用比色分光亮度法测量对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)胰腺组织中麸胱甘肽的含量。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与蛙皮素组比较。

图6B显示了二氢白藜芦醇(D-Res)和反式白藜芦醇(Res)对蛙皮素诱导的急性胰腺炎胰腺水肿大鼠降低水含量的改善作用。所得重量表示为胰腺重量与体重的比例。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。*p<0.05与生理盐水对照组比较(Con)；#p<0.05与蛙皮素组比较。

图7显示了用二氢白藜芦醇和反式白藜芦醇治疗的胰腺腺泡细胞中MTT细胞增殖的代谢率测量。*p<0.05与未使用二氢白藜芦醇或反式白藜芦醇的细胞相比。

图8A至8H分别显示来自二氢白藜芦醇(即化合物2)的八个衍生物(即化合物I至化合物VIII)。

图8I显示了二氢白藜芦醇(即化合物2)的化学结构。

图9显示了用TGF-β(5ng/mL)预培养的LTC-14PSC的蛋白质印迹，并用20μg/mL的反式白藜芦醇(Resv)或二氢白藜芦醇或二苯乙烯化合物I至VIII处理24小时。对照组未使用Resv或任何芪类药物处理。

图10显示了用TGF-β(5ng/mL)预培养的LTC-14细胞中α-SMA和纤维结合蛋白(FN1)的蛋白质印迹探测，并用反式白藜芦醇或二氢白藜芦醇在指定浓度下处理。

图11显示了LTC-14细胞中纤维丝α-SMA的绿色荧光信号(通过箭头标记识别)，表明PSC激活的程度。

图12显示了在蛙皮素(Cer)诱导的慢性胰腺炎小鼠中，在有或没有治疗二氢白藜芦醇(D-Res，20mg/kg/天)或反式白藜芦醇(Res，20mg/kg/天)的情况下，胰腺组织切片中纤维连接蛋白(FN1)沉积的荧光信号，用于估计纤维化程度。

图13显示了腹腔葡萄糖耐量试验中正常小鼠(对照组)和慢性胰腺炎小鼠(Cer)接受或不接受二氢白藜芦醇(D-Res，20mg/kg/天)治疗后的葡萄糖反应。在所有的时间点上，Cer组和Cer+D-Res组之间都有显著性差异(p<0.05)。

图14显示了胰腺组织切片中胰岛素的荧光信号，用于评估胰腺胰岛素分泌细胞(即β细胞)区域。比较对照组、慢性胰腺炎组和慢性胰腺炎组在20mg/kg/天二氢白藜芦醇(D-Res)剂量下的治疗效果。

图15显示了二氢白藜芦醇(D-Res)、反式白藜芦醇(Res)和化合物DR1到DR11对B16黑色素细胞中黑色素含量的抑制作用。抗坏血酸(AC)和BHA作为阳性对照。数据表示为平均值±SEM(n＝3)。*p<0.05和**p<0.01与DMSO处理的细胞相比。

图16显示了二氢白藜芦醇(D-Res)、反式白藜芦醇(Res)和化合物DR1到DR11对A375黑色素细胞中黑色素含量的抑制作用。抗坏血酸(AC)和BHA作为阳性对照。数据表示为平均值±SEM(n＝3)。*p<0.05和**p<0.01与DMSO处理的细胞相比。

图17显示了金钗石斛提取物(JCSH，50μg/mL)、铁皮石斛提取物(TPSH，50μg/mL)、反式白藜芦醇(Res，25μM)和二氢白藜芦醇(D-Res，25μM)对B16黑色素细胞中黑素含量的抑制作用。抗坏血酸(AC)作为阳性对照。数据表示为平均值±SEM(n＝3)。*p<0.05和**p<0.01与DMSO处理的细胞相比。

图18显示了二氢白藜芦醇(D-Res)、反式白藜芦醇(Res)和化合物DR1到DR11对B16黑色素细胞中细胞酪氨酸酶活性的抑制作用(25μM)。抗坏血酸(AC)和BHA作为阳性对照。数据表示为平均值±SEM(n＝3)。*p<0.05和**p<0.01与DMSO处理的细胞相比。

图19显示了二氢白藜芦醇(D-Res)、反式白藜芦醇(Res)和化合物DR1到DR11对A375黑色素细胞中细胞酪氨酸酶活性的抑制作用(25μM)。抗坏血酸(AC)和BHA作为阳性对照。数据表示为平均值±SEM(n＝3)。*p<0.05和**p<0.01与DMSO处理的细胞相比。

图20显示了金钗石斛提取物(JCSH，50μg/mL)、铁皮石斛提取物(TPSH，50μg/mL)、反式白藜芦醇(Res，25μM)和二氢白藜芦醇(D-Res，25μM)对B16黑色素细胞中细胞酪氨酸酶活性的抑制作用。抗坏血酸(AC)作为阳性对照。数据表示为平均值±SEM(n＝3)。*p<0.05和**p<0.01与DMSO处理的细胞相比。

图21显示了金钗石斛提取物(JCSH，L:10；M:25；H:50μg/m l)和铁皮石斛提取物(TPSH，L:10；M:25；H:50μg/mL)、二氢白藜芦醇(D-Res，L:25；H:50μM)、反式白藜芦醇(Res，L:25；H:50μM)和抗坏血酸(AC，H:50μg/mL)对B16黑色素细胞中TRP-1、TRP-2、Phospho-AKT和Phospho-P38蛋白水平的抑制作用。GAPDH用作加载参考。

图22显示了金钗石斛提取物(JCSH，高：50μg/mL；低：25μg/mL)、铁皮石斛提取物(TPSH，高：50μg/mL；低：25μg/mL)、反式白藜芦醇(Res，高：50μM；低：25μM)、二氢白藜芦醇(d-R，高：50μM；低：25μM)和抗坏血酸(AC，50μM)对B16黑色素细胞中ROS生成的抑制作用。荧光信号在Ex488nm处测量。数据表示为平均值±SEM(n＝3)。*p<0.05与单独的TBHP处理(即无石斛提取物或化合物)相比。

图23显示了含有2％反式白藜芦醇(Res)或2％二氢白藜芦醇(D-Res)的芪类溶液在第7天和第14天对个体手臂的美白效果。

图24显示实验结束时用介质溶液、5-FU或D-Res治疗21天的荷瘤小鼠获得的肿瘤。

图25显示用介质溶液5-FU或D-Res治疗的荷瘤小鼠的肿瘤大小。用卡尺测量两个垂直直径来监测肿瘤大小并以体积表示。肿瘤体积(V)根据方程式：V＝0.5*(LxW²)计算，其中L为长度，W为宽度，单位为毫米。

图26显示用介质溶液、5-FU或D-Res治疗21天的荷瘤裸鼠的肿瘤重量。

图27显示用介质溶液、5-FU或D-Res治疗21天的荷瘤裸鼠的体重。

图28显示了D-Res对人黑色素瘤A375细胞和人胰腺导管腺癌PANC-1细胞24小时治疗后细胞迁移的抑制作用。DMSO用作实验控制。

图29显示了在细胞迁移分析中，经DMSO或D-Res处理后，PANC-1细胞中剥蚀面积的百分比变化。

图30显示了在培养一周后，二氢白藜芦醇(100μM)和DR8(100μM)对须发藓菌的生长抑制作用。阴性对照组不含真菌，实验对照组不含检测化合物。

图31显示了在培养10小时后，二氢白藜芦醇(100μM)和DR8(100μM)对变形链球菌的生长抑制。阴性对照组不含细菌，实验对照组不含检测化合物。

具体实施方式

本发明不受本文所述任何具体实施例的范围限制。以下实施例仅用于示例。

定义

烃基

本文所用术语“烃基”包括提及仅由氢原子和碳原子组成的部分；所述部分可包含脂肪族和/或芳香族部分。该部分可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子。烃基的实例包括C_1-6烷基(例如C₁、C₂、C₃或C₄烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)；C_1-6烷基经芳基(例如苄基)或环烷基(例如环丙基甲基)取代；环烷基(例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基)；芳基(例如苯基、萘基或环己基)等。

烷基

本文所用术语“烷基”包括提及具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的直链或支链烷基部分。烷基的实例包括“C_1-6烷基”和“C_2-10烷基”。本文所用术语“C_1-6烷基”包括提及具有1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子的直链或支链烷基部分。本文所用术语“C_2-10烷基”包括提及具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碳原子的直链或支链烷基部分。此术语包括提及诸如甲基、乙基、丙基(正丙基或异丙基)、丁基(正丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基、己基等基团。具体而言，烷基部分可具有1、2、3、4、5或6个碳原子。

烯基

本文所用术语“烯基”和“C_2-6烯基”包括提及具有2个、3个、4个、5个或6个碳原子并且在适用情况下具有至少一个E或Z立体化学双键的直链或支链烷基部分。该术语包括提及诸如乙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基和3-己烯基等基团。

炔基

本文所用术语“炔基”和“C_2-6炔基”包括提及具有2个、3个、4个、5个或6个碳原子且另外具有至少一个三键的直链或支链烷基部分。此术语包括提及诸如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基和3-己炔基等基团。

烷氧基

术语“烷氧基”和“C_1-6烷氧基”包括提及具有-O-烷基，其中烷基为直链或支链，包含1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子。在一类实施例中，烷氧基具有1个、2个、3个或4个碳原子。此术语包括提及诸如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等基团。

烷基

本文所用术语“环烷基”包括提及具有3、4、5、6、7或8个碳原子的脂环部分。该组可以是桥接或多环***。通常环烷基是单环的。该术语包括提及诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降乙二醇、双环[2.2.2]辛基等基团。

芳基

本文所用术语“芳基”包括提及包含6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个环碳原子的芳香环***。芳基通常是苯基，但可以是多环***，具有两个或多个环，其中至少一个环是芳香族的。此术语包括提及诸如苯基、萘基、荧烯基、蓝烯基、茚基、蒽基等基团。

环群

“环群”指可能不饱和或部分不饱和但通常饱和的环或环***，通常含有5到13个成环原子，例如5或6元环。环或环***可以被一个或多个烃基取代。环状基团包括碳环基和杂环基分子。

碳环

本文所用术语“碳环基”包括提及具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个碳环原子的饱和(例如环烷基)或不饱和(例如芳基)环部分。具体来说，碳环基包括一个3-10元环或环***，尤其是5-6元环，其可以是饱和的或不饱和的。环或环***可以被一个或多个烃基取代。碳环部分例如选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基、双环[2.2.2]辛基、苯基、萘基、荧烯基、阿兹烯基、茚基、蒽基等。

杂环基

本文所用术语“杂环基”包括提及具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个环原子的饱和(例如杂环烷基)或不饱和(例如杂芳基)杂环部分，其中至少一个环原子选自氮、氧、磷、硅和硫。具体来说，杂环基包括3到10元环或环***，更具体地说是5或6元环，其可以是饱和的或不饱和的。环或环***可以被一个或多个烃基取代。

杂环部分例如选自环氧乙烷基、叠氮基、1，2-恶唑硫兰基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、硫吡喃基、噻吩基、异苯并呋喃基、呋喃苯甲基、色烯基、2H吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、吡咯利嗪基、咪唑基、咪唑基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡咯咪唑啉基、噻唑基、异噻唑基、二噻唑基、恶唑基、异恶唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、哒嗪基、吗啉基、硫吗啉基，尤其是硫吗啉基、吲哚基、异吲哚基、3H吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、异芳基、吲哚基、***基、四唑基、嘌呤基、4/V-喹啉基、异喹啉基、喹诺基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、环烷基、喹恶啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、肉桂醇基、蝶啶基、卡巴唑基、β-卡宾基、菲蒽啶基、吖啶基、环嘧啶基、菲蒽啉基、呋氮杂基、苯丙氨酸纳齐基、吩噻嗪基、吩恶嗪基、色烯基、异色胺基、色胺基等。

杂环烷基

本文所用术语“杂环烷基”包括提及具有3个、4个、5个、6个或7个环碳原子和选自氮、氧、磷和硫的1个、2个、3个、4个或5个环杂环原子的饱和杂环部分。该组可能是多环***，但更经常是单环***。该术语包括提及诸如氮杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、哌啶基、环氧乙烷基、吡唑烷基、咪唑基、吲哚基、哌嗪基、噻唑烷基、吗啉基、硫吗啉基、喹啉基等基团。环或环***可以被一个或多个烃基取代。

杂芳基

本文所用术语“杂芳基”包括提及具有5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个或16个环原子的芳香杂环***，其中至少一个环原子选自氮、氧和硫。所述基团可以是多环***，具有两个或多个环，其中至少一个环是芳香的，但更通常是单环的。环或环***可以被一个或多个烃基取代。本术语包括提及诸如嘧啶基、呋喃基、苯并[b]噻苯基、噻苯基、吡咯基、咪唑基、吡咯烷基、吡啶基、苯并[b]呋喃基、吡嗪基、嘌呤基、吲哚基、苯并咪唑基、喹啉基、吩噻嗪基、三嗪基、邻苯二甲嗪基、2H-色烯基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基、异吲哚基、吲唑基、嘌呤基、异喹基等基团。邻甲酰、喹唑啉基、蝶啶基等。

卤素

本文所用术语“卤素”包括提及具有F，Cl，Br或I。

含卤素部分

如本文所用的表达式“含卤素部分”包括提及包含1到30个选自碳、氮、氧和硫的多价原子的部分，该部分包括至少一个卤素。该部分可为烃基(例如C_1-6烷基或C_1-6烷氧基)或碳环基(例如芳基)。

经取代

本文中所用术语“经取代”在提及部分时意指所述部分中的一个或多个氢原子(尤其是最多5个、更特别是1个、2个或3个)被所述取代基的相应数量独立地相互取代。本文所用术语“视情况经取代”意指被取代或未被取代。当然，可以理解，取代基仅在其化学上可能的位置，本领域技术人员能够在不进行不当努力的情况下(实验或理论上)决定特定取代是否可能。

对映异构体

本文所用术语“对映异构体”意指具有彼此镜像的两种立体异构体之一。

外消旋体

本文所用术语“外消旋物”意指等量手性分子对映异构体的混合物。

非对映异构体

本文所用术语“非对映异构体”意指并非对映异构体，但在一或多个同等掌性中心具有不同组态的一类立体异构体之一。非对映异构体之实例为差异在于仅仅一个掌性中心之组态的差向异构体。

前药

前药是一种作为非活性(或低于完全活性)化学衍生物投与的药物，随后通常通过正常的代谢过程在体内转化为活性药物。

独立地

在两个或更多个部分描述为“各自独立地”选自一系列原子或基团的情况下，此意指该等部分可相同或不同。因此，各部分之身分与一或多个其他部分之身分无关。。

本发明的实施例描述如下。本发明之各方面之较佳特征如针对其他方面每一者，细节上作必要修改。此外应了解各实施例中详细说明之特征可与其他详细说明之特征组合，以提供其他实施例。

先前要求保护的发明的描述

在几种已建立的动物模型中，重复性腹腔注射胆囊收缩素分泌药,蛙皮素是实验性急性胰腺炎最广泛使用和高度可重复的方法。其次是单次注射脂多糖(LPS)，肺损伤以肺组织中性粒细胞滞留和肺泡膜屏障通透性增加为特征，常被视为急性胰腺炎相关并发症。为诊断急性胰腺炎的发病，大量的消化酶，即α-淀粉酶，渗漏到血液中作为主要病理参数。为了评估急性胰腺炎和相关肺损伤的严重程度，器官结构的形态学改变包括间质性水肿、细胞损伤、白细胞浸润和出血被描述为组织学和/或病理学参数。除了组织学检查，异常的MPO活性经常被用来评估中性粒细胞介导的炎症状态的严重性。局部和全身炎症反应可通过受影响组织匀浆中高水平的促炎细胞因子进一步证实。此外，麸胱甘肽消耗是一种防御机制，是评估组织损伤严重程度的最常见参数之一。

用本发明方法治疗的对象可以是人或动物。先前要求保护的发明适用于各种形式的急性胰腺炎，尤其适用于急性胰腺炎相关的***性并发症，包括肺损伤。

二氢白藜芦醇，又称反式-3，5，4’-三羟基二苯甲酰，是一种属于芪类家族的多酚衍生物，通常从植物提取物中获得。事实上，二氢白藜芦醇是一种由兰科和***等不同植物种类产生的抗非生物和生物挑战的植物防御素，特别是在真菌感染的情况下，如Fritzemeier,K.H.,Kindl,H于1983年报道(9,10-dihydrophenanthrenes asphytoalexins of Orchidaceae.Biosynthetic studies in vitro and in vivo provingthe route from L-phenylalanine to dihydro-m-coumaric acid,dihydrostilbene anddihydrophenanthrenes(“9,10-二氢菲蒽作为兰科植物的植物防御素。体外和体内生物合成研究证明了从L-苯丙氨酸到二氢-m-香豆酸、二氢芪和二氢菲蒽的途径”).Eur JBiochem 133,545-550)。

先前要求保护的发明涉及具有式1的芪类家族的多酚衍生物的用途：

其中，R₁、R₂和R₃各自独立地选自烷基。术语“烷基”单独或与其它基团组合包括提及具有1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子的直链烷基部分。该术语进一步由诸如甲基、乙基、丙基(正丙基或异丙基)、丁基(正丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基、己基等基团举例说明，以改善胰腺和肺的组织损伤。

先前要求保护的发明还涉及含有反式-3,5,4’-三羟基二苯甲酰(也称为二氢白藜芦醇)的二苯乙烯化合物的用途，参见化合物2：

改善胰腺、肺组织损伤。在先前要求保护的发明中，通过反式白藜芦醇的加氢，以白色粉末形式获得这种特殊的芪类衍生物。

此外，先前要求保护的发明涉及上述化合物的制造方法、含有该化合物的药物制剂以及该化合物用于制备药物制剂的用途。

口服足量的二氢白藜芦醇(剂量不低于20mg/kg)可显著改善蛙皮素处理大鼠的急性胰腺炎和相关肺损伤的严重程度。就病理参数而言，急性胰腺炎大鼠由于胰腺水肿的减轻,其胰腺含水量降低(图1)、血浆α-淀粉酶水平的降低(表1)、更完整的腺泡形态(图2C至2F)以及肺泡壁增厚和出血的减少(图3C至3E)。

表1：血浆α-淀粉酶活性以U/μl/分钟表示。P值小于0.05被认为具有统计学意义，S.D.代表标准偏差。*p<0.05与对照组比较；#p<0.05与蛙皮素组比较。

通过给药二氢白藜芦醇(图4A和4B)，蛙皮素诱导的中性粒细胞隔离水平升高(量化为MPO活性)在胰腺和肺组织中被显著抑制。注射二氢白藜芦醇(图5A和5B)可显著抑制蛙皮素诱导的胰腺和肺中TNF-α水平升高。

麸胱甘肽缺乏是组织损伤的一个明显迹象。藉由给予二氢-白藜芦醇，显著恢复胰脏中蛙皮素诱发之下降含量之麸胱甘肽(图6A)。

在先前申请专利的发明中，二氢白藜芦醇完全且容易溶解于0.5％(重量/体积，w/v)甲醇中，而反式白藜芦醇在剧烈振荡下溶解于2.5％(w/v)甲醇中(表2)。因此，二氢白藜芦醇的溶解度至少是反式白藜芦醇的5倍。与反式白藜芦醇相比，二氢白藜芦醇的改善作用更有可能降低蛙皮素诱导的急性胰腺炎大鼠胰腺水肿所致的水分含量(图6B)。

表2：二氢白藜芦醇和反式白藜芦醇在甲醇中的溶解度。

	反式白藜芦醇	二氢白藜芦醇
			所需甲醇(w/v)	2.5％	0.5％

通过MTT分析对线粒体代谢率的评估，确定胰腺腺泡细胞中的二氢白藜芦醇的细胞毒性约为500μM，而反式白藜芦醇的细胞毒性约为250μM(图7)。因此，二氢白藜芦醇的细胞毒性比反式白藜芦醇低50％。

实验

二氢白藜芦醇的制备及结构鉴定。以反式白藜芦醇为原料，经加氢得到白色粉末状的C₁₄H₁₄O₃。将反式白藜芦醇(10g，43.8mmol)存于无水乙醇(150mL)中的溶液在室温下在5atm H₂压力下在10％Pd/C(0.2g)存在下搅拌。反应在8小时(h)后通过过滤催化剂进行淬火。滤液在真空中蒸发，残留物用硅油色谱分离，用石油醚和乙酸乙酯(1:1)洗脱，得到二氢白藜芦醇白色无定形粉末(9.6克，产率95％)：H-ESIMS([M+1]+m/z 231.1026，C₁₄H₁₄O₃的calcd 231.1016)；¹H NMR(甲醇-d4，400MHz)δ 6.96(2H，ABd，J＝8.3Hz)、6.67(2H,ABd,J＝8.4Hz),6.13(2H,brd,J＝2.2Hz),6.09(1H,brt,J＝2.2Hz),2.74(2H,brdd,J＝8.5,5.6),2.67(2H,brdd,J＝8.3,5.2)；；¹³C NMR(甲醇-d4，100MHz)159.2(2C,s),156.3(1C,s),145.6(1C,s),134.1(1C,s),130.3(2C,d),116.0(2C,d),108.1(2C,d),101.1(1C,d),39.6(2C,t),38.0(2C,t)。

生物活性评价。将体重在70至90g的28天龄Sprague-Dawley大鼠随机分为6组，每组6至8只。将大鼠置于23±2℃的环境温度、60％至80％的相对湿度和12小时的光/暗循环中。在实验之前，大鼠饥饿隔夜，但允许自由取用水。大鼠实验性急性胰腺炎在超最大刺激剂量下，每6小时注射一次蛙皮素(50μg/kg)，最后一次注射蛙皮素1小时后，注射单剂量的LPS(7.5mg/kg)，这组大鼠被指定为蛙皮素组。对照组在相同体积和相同时间间隔内注射0.9％生理盐水而不是蛙皮素。治疗组给予蛙皮素和口服剂量的二氢白藜芦醇(10，20或50mg/kg)被指定为蛙皮素+D-Res 10或20或50mg/kg。治疗干预是在第一次注射蛙皮素30分钟后连续3小时进行的。在牺牲后，立即移除胰腺，称重，修除脂肪，并在4℃下固定在4％多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水中过夜。然后处理样本，包埋于固体石蜡中，切片并进行H&E染色。用商用酶联免疫吸附测定试剂盒测定胰腺和肺标本中的TNF-α水平。组织匀浆进行生化分析，以评估MPO活性和麸胱甘肽含量。

功能完整的腺泡通过胶原酶消化和轻微的剪切力从胰腺组织中分离出来。腺泡在改性的Dulbecco’s Eagle’s培养基(GIBCO)中加入5％胎牛血清(GiBCO)、1％青霉素链霉素(GIBCO)，在37℃的5％CO2、95％空气湿化大气中接种LTC-14细胞，密度为1×10⁴/孔，在96孔板中接种，并用不同浓度的二氢白藜芦醇或反式白藜芦醇(溶于DMSO)培养24小时。在24小时处理结束时，将MTT试剂添加到细胞中。在3小时反应时间后，将MTT产物溶解于DMSO中，并在570nm处进行吸光度测定。

结果

蛙皮素诱导后,由于胰腺水肿的发生，急性胰腺炎大鼠的胰腺重量与身体重量之比与非蛙皮素诱导的对照组相比显著增加约60％。以不少于20mg/kg的剂量口服二氢白藜芦醇可显著减少胰腺水肿，这一现象反映在胰腺与身体的重量比显著降低。与公认的抗氧化剂反式白藜芦醇相比，二氢白藜芦醇对减轻胰腺水肿的改善作用更有希望。根据以下之标准剂量转化:Reagan-Shaw S,Nihal M,Ahmad N(2008)《重新讨论自动物至人类研究之剂量转换(Dose translation from animal to human studies revisited)》《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J)》22(3):659-661，可比剂量为3.24mg/kg。

口服二氢白藜芦醇后，大鼠胰腺炎实质小叶间隔局灶性扩张、细胞质收缩和白细胞浸润明显减少，而蛙皮素诱导的急性胰腺炎大鼠肺壁增厚和肺组织出血明显改善。

为了减轻胰腺和肺的炎症状况，口服二氢白藜芦醇可显著降低胰腺和肺组织中促炎细胞因子TNF-α和MPO活性。

与未处理蛙皮素的对照组相比，蛙皮素诱导的胰腺组织中麸胱甘肽的含量急剧下降了50％以上。口服二氢白藜芦醇可显著抑制蛙皮素诱导的胰腺麸胱甘肽的消耗。

二氢白藜芦醇在甲醇溶剂中的溶解度至少是反式白藜芦醇的5倍。通过对腺泡线粒体代谢率的评估，发现二氢白藜芦醇的细胞毒性约为500μM，而反式白藜芦醇的细胞毒性约为250μM，因此，二氢白藜芦醇的细胞毒性比反式白藜芦醇低50％。

在先前要求保护的发明的第一个方面的第一个实施例中，提供了一种治疗胰腺的急性炎症状态和相关的***并发症的方法，该方法通过向有需要的个体施用一种包含有效量的芪类衍生物的成分，所述化合物包含式(I)化合物，

其中，R₁、R₂和R₃各自独立地选自烷基。术语“烷基”单独或与其它基团组合包括提及具有1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子的直链烷基部分。该术语进一步例示为甲基、乙基、丙基(正丙基或异丙基)、丁基(正丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基、己基等以及其衍生物或化学变体；或所述化合物、其衍生物和/或化学变体的混合物。

在先前要求保护的发明的第一个方面的第二个实施例中，提供了一种治疗胰腺急性炎症状态和相关***并发症的方法，其中，芪类衍生物是反式-3,5,4’-三羟基二苯甲酰或二氢白藜芦醇，其为式(2)化合物：

以及其衍生物或化学变体；或所述化合物、其衍生物和/或化学变体的混合物。

在先前要求保护的发明的第一个方面的第三个实施例中，提供了一种治疗胰腺的急性炎症状态和相关的***并发症的方法，其中，该个体是人类或动物。

在先前要求保护的发明的第一个方面的第四个实施例中，提供了一种治疗胰腺的急性炎症状态和相关的***并发症的方法，其中所述成分是口服的。

在先前要求保护的发明的第一个方面的第五个实施例中，提供了治疗胰腺的急性炎症状态和相关的***并发症的方法，其中胰腺的急性炎症状态包括所有形式的急性胰腺炎，相关的***并发症包括肺损伤。

在先前要求保护的发明的第一个方面的第六个实施例中，提供了一种治疗胰腺的急性炎症状态和相关的***并发症的方法，其中所述成分以不低于20mg/kg的剂量给予该个体，每天不少于3次。

在先前要求保护的发明的第一个方面的第七个实施例中，提供了一种治疗胰腺的急性炎症状态和相关的***并发症的方法，其中所述成分以不低于3.24mg/kg的剂量给予该个体，每天不少于3次。

在先前要求保护的发明的第二方面的第一实施例中，提供了制备分子式C₁₄H₁₄O₃和式(2)化合物的方法，

它是一种芪类衍生物，其化学名称为反式白藜芦醇氢化后的反式-3,5,4’-三羟基二苯甲酰。

在先前要求保护的发明的第二方面的第二实施例中，提供了一种制备分子式C₁₄H₁₄O₃和式(2)化合物的方法，其中反式白藜芦醇的氢化包含以下步骤：

-将反式白藜芦醇溶于无水乙醇中，室温5atm H₂压力，10％Pd/c搅拌8小时；

-从搅拌溶液中过滤出催化剂；

-在真空中蒸发滤液以产生残渣；

-用硅油色谱分离，用石油醚和乙酸乙酯(1:1)洗脱残留物，得到二氢白藜芦醇。

先前要求保护的发明的其他实施例

TGF-β被一些以前的研究报道为PSC激活的有效诱导物，其中包括纤维结合蛋白(FN1)在内的一系列纤维化介质被上调。在大鼠永生化PSC的LTC-14细胞中，外源性添加重组TGF-β(5ng/mL)可显著提高纤维丝α-SMA和ECM蛋白纤维结合蛋白(FN1)的表达水平。在先前要求保护的发明的另一个实施例中，发明人发现，在TGF-β的挑战下，施用二氢白藜芦醇可显著降低大鼠PSC中α-SMA和纤维结合蛋白(FN1)的表达水平。二氢白藜芦醇衍生物对PSC有类似的抑制作用。与已知的抗氧化剂反式白藜芦醇相比，二氢白藜芦醇的抑制作用更为显著。在这些检测的芪类化合物中，尽管二氢白藜芦醇具有适度的结构差异，但它在PSC中具有最有效的抗纤维化作用。

先前要求保护的发明提供了一种化合物，用于抑制存在于需要治疗的个体的内部器官中的星状细胞的纤维化介质，其化学式为

其中，

R²及R⁴各自独立地选自-OR¹¹及-OC(O)R¹¹；

R¹、R³、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹及R¹⁰各自独立地选自氢、卤素、三氟甲基、-OR¹¹及-OC(O)R¹¹；或R²及R³或R⁷及R⁸可连同其附接之碳原子一起形成环状基团；

R¹²独立地选自卤素、三氟甲基、氰基、硝基、侧氧基、-OR¹³、-C(O)R¹⁴、-C(O)N(R¹³)R¹⁴、-C(O)OR¹³、-OC(O)R¹⁴、-S(O)₂R¹³、-S(O)₂N(R¹³)R¹⁴、-N(R¹³)R¹⁴；

R¹³及R¹⁴各自独立地为氢或选自烃基及杂环基，其任一者视情况经1个、2个、3个、4个或5个独立地选自卤素、氰基、胺基、羟基、C_1-6烷基及C_1-6烷氧基之取代基取代；

或其对映异构体；

或其药学上可接受的盐或前药；

或所述化合物、衍生物和/或其化学变体的混合物。

先前要求保护的发明进一步提供了用于抑制存在于需要的个体的内部器官中的星状细胞的纤维化介质的化合物的九个实施例，其化学式为：

内部器官可以是，例如，个体的胰腺、肝脏、肾脏和肺部。个体可以是人类个体。

实验

在95％空气的加湿环境与5％的二氧化碳下，将LTC-14细胞在37℃培养于含有添加10％胎牛血清(FBS)的IMDM中。所有实验中使用的细胞都在第9至25代之间。将LTC-14细胞以1×10⁵/孔的密度接种在12孔板中，并以5ng/mL的重组TGF-β与0、1、5、10和20μg/mL的二氢白藜芦醇在添加0.2％FBS的IMDM中培养24小时。然后收集细胞进行蛋白质提取和蛋白质印迹分析或免疫荧光染色。

LTC-14细胞的总蛋白用含有蛋白酶抑制剂的RIPA溶解缓冲液提取。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对细胞裂解液进行加载和分离。湿电印迹后，将蛋白质转移到PVDF膜(Bio-rad)上，用5％的脱脂奶粉封闭，用抗体探测，并使用ECL试剂盒(GE Healthcare)观察。

对于α-SMA的免疫荧光染色，将LTC-14细胞以1×10⁵的密度接种到聚L-赖氨酸涂层的盖玻片上，置于24孔板中，以5ng/ml的TGF-β与0和10μg/ml的二氢白藜芦醇在添加0.2％FBS的IMDM中培养24小时。然后固定细胞，用3％的BSA封闭，用抗体探测并用含有4'，6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)的荧光封片剂封固。使用Nikon显微镜拍摄图像，并使用SPOT高级软件进行分析。

生物活性评价。将28天龄、体重在20～25g的C57/BL6小鼠随机分为4组，每组6～8只。将小鼠置于23±2℃的环境温度、60％至80％的相对湿度和12小时的光/暗循环中。在进行葡萄糖耐量试验之前，小鼠被饿了一夜，但允许自由取用水。小鼠实验性慢性胰腺炎是通过每天4小时静脉注射蛙皮素(50μg/kg)，每周3天，共6周，以超最大刺激剂量(50μg/kg)诱导的。对照组在相同体积和相同时间间隔内注射0.9％生理盐水而不是蛙皮素。治疗组给予蛙皮素和口服剂量的二氢白藜芦醇(20mg/kg/天)被指定为蛙皮素+D-Res。治疗过程中还尝试了50mg/kg/天剂量的二氢白藜芦醇，但与20mg/kg/天剂量的纤维化形成没有统计学意义的差异。然而，在体内试验中，这一高剂量并未产生不良反应。因此，得出结论，二氢白藜芦醇的有效剂量至少为20mg/kg/天。使用反式白藜芦醇的组被指定为蛙皮素+RES。两种化合物的药物干预从第4周的第一天到实验结束，即总共3周。在为期6周的实验结束时，对小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)。在IPGTT之前，小鼠已经被饿了14小时，其中15％(w/v)葡萄糖溶液以每千克体重1.5g葡萄糖注射给单个动物。从尾静脉获取约1μL的血液，并在注射葡萄糖前30分钟(即空腹水平)和注射葡萄糖后10、20、30和60分钟使用血糖仪监测血糖水平(Medisign,Korea)。在牺牲后，立即移除胰腺，称重，修除脂肪，并在4℃下固定在4％多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水中过夜。然后处理样本，包埋于固体石蜡中，切片并进行免疫染色。

根据剂量换算公式，人当量剂量(mg/kg)＝动物剂量(mg/kg)乘以动物Km/人Km，其中小鼠Km数为3，人Km数为37(Guidance for Industry Estimating the Maximum SafeStarting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult HealthyVolunteers)，先前要求保护的发明的二氢白藜芦醇的人当量有效剂量至少为1.622mg/kg/天。

在先前要求保护的发明的另一个实施例中，图8A-8I中显示了8种其他二氢白藜芦醇的衍生物(化合物I到VIII)和二氢白藜芦醇(化合物2)。在该实施例中，对每种化合物进行如下实验：

实验图8A-8I中化合物的实施例

LTC-14细胞用TGF-β(5ng/mL)预培养，用反式白藜芦醇(Resv)、二氢白藜芦醇(D-Res)或二苯乙烯化合物i-viii以20μg/mL处理24小时。对照组未使用Resv或任何芪类药物处理。提取总蛋白后用蛋白质印迹法分析。如图9所示。

LTC-14细胞为胰腺星状细胞。α-SMA是肝纤维化的基本标志，而β-肌动蛋白作为一个加载参考。因此，α-SMA的表达水平表示PSC的活化程度。由于TGF-β被认为是一种有效的纤维化诱导剂，因此加入了TGF-β。在二氢白藜芦醇及化合物i至viii之间，相对于反式白藜芦醇(Resv)，测试对α-SMA表现量之遏制作用。所有测试化合物均发挥α-SMA表现量之遏制作用。

LTC-14细胞用TGF-β(5ng/mL)预培养，用反式白藜芦醇或二氢白藜芦醇按指定浓度处理。提取总蛋白后用蛋白质印迹法分析。如图10所示。

纤维结合蛋白(FN1)是一种主要的细胞外基质蛋白，在纤维化或胰腺星状细胞活化时产生。其表达水平提示纤维化的程度。在二氢白藜芦醇(即化合物2)和反式白藜芦醇间检测对纤维结合蛋白(FN1)和α-SMA水平的抑制作用。

LTC-14细胞用TGF-β(5ng/mL)预培养，免疫荧光染色前用20μg/mL的二氢白藜芦醇处理24小时。

LTC-14细胞为胰腺星状细胞。α-SMA是肝纤维化的基本标志，而β-肌动蛋白作为一个加载参考。因此，α-SMA的绿色荧光信号(由图11中的箭头标记标识)表示PSC的活化程度。由于TGF-β被认为是一种有效的纤维化诱导剂，因此加入了TGF-β。检测了二氢白藜芦醇对α-SMA表达水平的抑制作用。

使用抗纤维结合蛋白(FN1)抗体对胰腺组织切片染色；因此，免疫染色信号表明纤维结合蛋白(FN1)在实质中的沉积程度。以二氢白藜芦醇20mg/kg/天(蛙皮素+D-RES)的剂量使用可减少慢性胰腺炎中的此类沉积，相較於反式白藜芦醇(蛙皮素+RES)更为显著。如图12所示。

生物活性评价。将28天龄、体重在20～25g的C57/BL6小鼠随机分为4组，每组6～8只。将小鼠置于23±2℃的环境温度、60％至80％的相对湿度和12小时的光/暗循环中。口服二氢白藜芦醇(20mg/kg/天)后，慢性胰腺炎小鼠(Cer)的空腹血糖水平明显高于对照组，表明这些慢性胰腺炎小鼠出现高血糖，这是糖尿病的一个明显特征。重要的是，通过3周的二氢白藜芦醇治疗(蛙皮素+D-Res)，他们的糖耐量受损已得到明显矫正。结果，慢性胰腺炎小鼠的高血糖状态得到改善。如图13所示。

当以20mg/kg/天的剂量口服二氢白藜芦醇(蛙皮素+D-Res)时，胰腺炎的严重程度和胰岛(尤其是β细胞)的收缩和破坏明显得到改善。如图14所示，胰腺β细胞区域由免疫荧光胰岛素信号所显示。β细胞面积或质量的减少与糖耐量不足或糖尿病的发生有关。因此，通过二氢白藜芦醇治疗恢复β细胞面积表明，这种芪类药物有利于治疗胰腺源性糖尿病(即3C型糖尿病)。

根据剂量换算公式，人当量剂量(mg/kg)＝动物剂量(mg/kg)乘以动物Km/人Km，其中小鼠Km为3，人Km为37(Guidance for Industry Estimating the Maximum SafeStarting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult HealthyVolunteers)(“成人健康志愿者中治疗剂初始临床试验最大安全起始剂量评估行业指南”)，本发明的二氢白藜芦醇的有效人当量剂量为至少1.622mg/kg/天。

先前要求保护的发明的另一个进一步实施例

石斛属植物，俗称“石斛”，广泛应用于中医***以及治疗各种疾病的民间药物，如慢性萎缩性胃炎、糖尿病、心血管疾病等。石斛提取物或成分含有大量的各种芪类化合物，如反式白藜芦醇和二氢白藜芦醇，它们是对抗人体氧化应激的潜在化合物。然而，这些化合物用于皮肤保护或美白的用途尚未公开。

由于东方化妆品更喜欢植物性成分，因此先前所要求保护的发明涉及石斛衍生的芪类，特别是反式白藜芦醇、二氢白藜芦醇或二氢白藜芦醇衍生物在减少黑色素形成中的用途，其有可能抑制氧化自由基和活性氧的生成。本发明的组合物通过局部施用应用于需要其的个体。本发明的组合物是日霜、晚霜、面部乳液、身体乳液、润肤油、软化角质精华液、面膜、沐浴露、防晒霜、防晒乳液、晒后霜或晒后乳液。

本发明的组合物包含一种或多种从石斛植物中提取的提取物。

本发明的组合物包含一种或多种具有以下化学式的芪类：

其中

或其对映异构体；

或其药学上可接受的盐或前药；

或其混合物、衍生物和/或化学变体。

本发明的组合物包括具有以下化学式的芪类：

其系二氢白藜芦醇及其衍生物或化学变体；或该化合物、其衍生物和/或化学变体的混合物，或具有以下式：

本发明用于皮肤美白和皮肤保护的成分包括具有以下化学式的芪类：

其中

或其对映异构体；

或其药学上可接受的盐或前药；

或其混合物、衍生物和/或化学变体。

为了测定抗氧化能力，使用了分光光度脱色分析，并与2,2’-阿嗪比(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的预形成自由基单作用(也称为ABTS)互补。在本试验中，ABTS(Abcam美国)溶解在水中，浓度为7mM，ABTS自由基阳离子是通过ABTS储备溶液与2.45mM过硫酸铵(Sigma-Aldrich美国)反应产生的，并使混合物在使用前在室温下在黑暗中静置16小时。当测试石斛提取物样品或芪类样品时，用乙醇稀释ABTS自由基溶液，使其在734nm处吸光度为0.70，并在30℃下平衡。在734nm处吸光度之前，用ABTS自由基溶液(0.9mL)将测试样品(0.1mL)或DMSO(0.1mL)的稀释液培养15分钟。DMSO是一种介质处理，而Trolox(Abcam,美国)是一种著名的维生素E衍生物，从0.001到0.05mg/mL不等，作为阳性药物参考。根据Trolox标准曲线，测试样品的抗氧化能力表示为相当于Trolox的量，单位为毫克(mg)。

在与二氢白藜芦醇(D-Res)、反式白藜芦醇(Res)、石斛提取物样品或其他芪类样品(化合物DR1到DR11)培养后，已清除预形成的ABTS自由基，并将其抗氧化能力标准化为TRolox阳性标准，如表3所示。

表3。相当于Trolox量的芪类化合物的抗氧化能力(mg)

化合物	Trolox量(mg)	标准偏差
			D-Res	4969.611	333.841
Res	4296.325	83.132
			DR1	105.736	24.978
DR2	30.178	52.270
			DR3	119.325	90.071
DR4	94.277	84.519
			DR5	0	0
DR6	0	0
			DR7	0	0
DR8	15.893	27.527
			DR9	0	0
DR10	0	0
			DR11	0	0

在培养的B16和A375黑色素细胞中测定细胞黑素含量和酪氨酸酶活性。事实上，黑色素细胞是产生黑色素的细胞，而黑色素则是一组内源性色素，能产生多种皮肤颜色。B16细胞(上海生物科学院，中国科学院，中国)和A375细胞(美国模式培养物集存库，美国)常规生长在DMEM培养基(Gibco，美国)中，添加10％热激活胎牛血清(FBS，Gibco，美国)和1％青霉素/链霉素(Gibco，美国)，在37℃下95％空气的加湿环境与5％的二氧化碳中生长。

为了测定细胞黑素含量，将黑色素细胞接种在12孔板(8×10⁴个细胞/孔)中，并用α-黑色素细胞刺激激素(α-MSH，100nM)刺激24小时。这种刺激的目的是加速黑色素细胞中黑色素的细胞形成，使测试化合物或提取物对黑色素形成的降低能力变得更加明显。接着，在α-MSH刺激下，用不同的石斛提取物样品或芪类样品(5μL)或DMSO(5μL，Sigma-Aldrich，美国)处理细胞24小时。DMSO是一种介质处理。实验结束后，对细胞进行胰蛋白酶化，使其从培养板上分离。离心后，用100μL 1N氢氧化钠溶液(Sigma-Aldrich，美国)在70℃下培养每个样品的黑色素颗粒1.5小时。冷却至室温后，在15000×g下离心10分钟。将每个样品的上清液(100μL)转移到96孔板上读取吸光度。读取405nm处的吸光度。每个样本的相对黑色素含量与蛋白质含量标准化，并以与DMSO处理细胞相比的百分比变化呈现。

在与二氢白藜芦醇(D-Res)、反式白藜芦醇(Res)、石斛提取物样品或其他芪类样品(化合物DR1到DR11)培养后，如图15到17所示，B16和A375黑色素细胞中的细胞黑色素含量已降低。

为了测定细胞酪氨酸酶活性，将黑色素细胞接种在12孔板(8×10⁴个细胞/孔)中，用α-MSH(100nM)刺激24小时。在α-MSH刺激后，用不同的测试样品(5μL)或DMSO(5μL)处理细胞24小时。在实验结束时，用冰冷磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.8)(Gibco，美国)洗涤细胞两次，然后用含0.1％Triton X-100的150μLPBS(pH6.8)在冰上溶解。将细胞溶解物在15000×g的4℃温度下在离心15分钟。将50μL上清液的一小部分与96孔板中的50μL L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA，Abcam，美国)溶液(0.2％，pH6.8)混合，在37℃下在黑暗中培养2小时。在475nm处测量每个样品的光密度。吸光度根据每个样品的蛋白质含量进行标准化。计算黑色素细胞中细胞酪氨酸酶的相对活性，并以与DMSO处理细胞相比的百分比变化表示。另外，我们还收集了另一组实验用于蛋白质印迹分析TRP1和TRP2的表达水平，以及它们的上游调节因子P-AKT和P-38。

在与二氢白藜芦醇(D-Res)、反式白藜芦醇(Res)、石斛提取物样品或其他芪类样品(化合物DR1到DR11)培养后，如图18到20所示，已抑制了B16和A375黑色素细胞中的酪氨酸酶活性。蛋白质印迹结果如图21所示。

为了测定黑色素细胞内的ROS的产生，将B16或A375细胞接种在12孔板(8×10⁴个细胞/孔)中，用α-MSH(100nM)刺激24小时。在α-MSH培养结束时，根据制造商的说明，将细胞从培养板上分离并进行细胞ROS检测(Abcam)。简言之，细胞在37℃下用20μM的DCFDA染色30分钟。染色后，在用我们的试验提取物或化合物或体积为5μL的抗坏血酸(AC)培养4小时之前，用叔丁基过氧化氢(TBHP，55nM)处理细胞，使其ROS明显升高。ROS产生的信号将使用荧光微板阅读器检测。DCF由488nm激光器激发。该分析的结果如图22所示。

所有分析均一式三份，并在个别实验中重复至少三次。结果显示为平均值±标准偏差。两组之间的方差采用Student's t-test进行评估，而两组以上的方差则采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行计算。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。

为了确定个体的皮肤颜色，在第0天用皮肤色度计MPA5测试个体手臂的初始皮肤状况。根据亮度(L*)和黄蓝分量(b*)值，用色度计计算个体类型角(ITA°)。ITA°值越大，皮肤白度越大[S.Del Bino and F.Bernerd.Variations in skin colour and thebiological consequences of ultraviolet radiation exposure.British Journal ofDermatology 2013；169(Suppl.3),33-40]。事实上，皮肤颜色分为6大类：如表4所示的非常淡、淡、中等、棕褐色、褐色及黑色。选择两个区域(每个2cm×2cm)作为处理区域，而手臂上处理区域周围的区域作为控制区域。将200μL的试验用芪类(按重量2％溶于乙醇)白天和晚上每天两次施用到指定区域。在第一周(第7天)结束时，使用皮肤比色计对个体进行测试，记录有关使用芪类7天的数据。同样，在第二周(第14天)结束时，使用皮肤比色计对个体进行测试，以记录关于使用芪类药物14天的数据。ITA°读数如表5所示。二氢白藜芦醇或反式白藜芦醇具有明显的美白效果。图23显示了从使用局部处理的人身上拍摄的一组具有代表性的图像。

表4。基于ITA的皮肤分类

个体类型角(ITA°)	皮肤分类
		ITA°>55°	非常淡
41°<ITA°<55°	淡
		28°<ITA°<41°	中等
10°<ITA°<28°	棕褐色
		-30°<ITA°<10°	褐色
ITA°<-30°	黑色

表5。在指示时间点个别人类个体之ITA°量测

DR1～DR3通用合成途径

向二氢白藜芦醇(0.2mmol)和溴代烷(RBr)(1.2mmol)在二甲基甲酰胺(DMF，2毫升)中的混合物中添加K₂CO₃(1.2mmol)。将所得混合物在室温下搅拌，直到起始材料在薄层层析(TLC)上消失。用H₂O(10mL)稀释混合物，用二氯甲烷(DCM，10mL)洗涤三次。用饱和氯化钠(NaCl)洗涤组合的有机层两次，经无水Na₂SO₄干燥，真空浓缩，并通过制备(prep-)TLC(PE/EA＝5/1或3/1)纯化，得到所需化合物。

DR1:

高分辨率质谱(HRMS)：511.1997[M+Na]⁺

质子核磁共振(¹H NMR,400MHz,CDCl₃)δ1.31(9H,t,J＝7.1Hz),2.82(4H,s),4.22-4.32(6H,m),4.56(4H,s),4.60(2H,s),6.29-6.41(3H,m),6.80-6.86(2H,m),7.04-7.13(2H,m).

DR2:

高分辨率质谱(HRMS)：373.1770[M+Na]+.

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ2.84(4H,d,J＝2.1Hz),4.49(4H,dt,J＝5.3,1.4Hz),4.51-4.53(2H,m),5.25-5.35(3H,m),5.37-5.48(3H,m),5.99-6.13(3H,m),6.36(3H,s),6.81-6.90(2H,m),7.05-7.15(2H,m).

DR3:

高分辨率质谱(HRMS)：379.2220[M+Na]⁺.

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ0.98-1.08(9H,m),1.74-1.90(6H,m),2.75-2.90(4H,m),3.85-3.95(6H,m),6.29-6.39(3H,m),6.81-6.87(2H,m),7.07-7.15(2H,m).

DR4～DR11通用合成途径

向二氢白藜芦醇(0.2mmol)和酰基氯(RCOCl)((1.2mmol)在DCM(2mL)中的混合物中在0℃下添加ET₃N(1.2mmol)。将所得混合物加热至室温并搅拌，直到起始材料在TLC上消失。用H₂O(10mL)稀释混合物，用DCM(10mL)洗涤三次。用饱和氯化钠洗涤合并的有机层两次，经无水Na₂SO₄干燥，真空浓缩，并通过制备TLC(PE/EA＝5/1或3/1)纯化，得到所需化合物。

DR4:

高分辨率质谱(HRMS)：463.2044[M+Na⁺].

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δδ0.97-1.10(9H,m),1.72-1.89(6H,m),2.47-2.58(6H,m),2.91(4H,s),6.74-6.84(3H,m),6.94-7.04(2H,m),7.13-7.21(2H,m).

DR5:

高分辨率质谱(HRMS)：667.0427and 669.0408[M+Na⁺].

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ3.01(4H,s),6.99-7.06(3H,m),7.10-7.17(2H,m),7.22-7.27(2H,m),7.46-7.55(6H,m),8.09-8.18(6H,m).

DR6:

HRMS:655.1964[M+Na⁺].

¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ3.00(4H,s),3.89-3.92(9H,m),6.97-7.04(9H,m),7.11-7.16(2H,m),7.23-7.27(2H,m),8.13-8.18(6H,m).

DR7:

HRMS:565.1600[M+Na]+.

¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ3.02(4H,s),7.02-7.08(3H,m),7.12-7.20(2H,m),7.25-7.29(2H,m),7.50-7.57(6H,m),7.60-7.70(3H,m),8.17-8.28(6H,m)

DR8:

HRMS:415.1140[M+Na]+

¹H NMR(400 MHz,CDCl3)δ2.94(4H,s),5.98-6.08(3H,m),6.23-6.43(3H,m),6.58-6.70(3H,m),6.84-6.97(3H,m),7.01-7.13(2H,m),7.16-7.26(2H,m).

DR9:

HRMS:514.2550[M+Na]⁺.

¹H NMR(400 MHz,CDCl3)δ1.61-1.79(12H,m),1.88-2.09(12H,m),2.82-3.08(7H,m),6.72-6.83(3H,m),6.96-7.03(2H,m),7.15-7.20(2H,m).

DR10:

HRMS:607.2070[M+Na]+.

¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ2.91(4H,s),5.27(6H,s),6.91-6.98(3H,m),7.08-7.12(2H,m),7.14-7.19(2H,m),7.38-7.46(15H,m).

DR11:

HRMS:505.2550[M+Na]⁺.

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)1.34-1.38(27H,m),2.86-2.94(4H,m),6.77(3H,d,J＝2.1Hz),6.93-7.02(2H,m),7.14-7.21(2H,m)

先前要求保护的发明的另一个实施例

二氢白藜芦醇在重量和体积上抑制异种移植瘤的生长，并且在实验动物中无表现出不良的副作用。尽管二氢白藜芦醇与反式白藜芦醇具有显著的结构相似性，但在人体肠道中不会发生进一步的代谢分解，并在微生物转化后作为结肠代谢产物存在。因此，二氢白藜芦醇可作为微生物受限患者反式白藜芦醇的替代药物，且无反应。

实验动物

所有动物研究均按照香港浸会大学动物伦理委员会的动物护理及使用指引获批准及进行。BALB/c裸鼠，SPF级，雄性，6-8周大，购自台湾BioLASCO。在异种移植实验前，小鼠在SPF级实验室条件下驯化一周。

细胞培养和细胞活力测定

人结肠直肠癌HCT-116细胞系、人胰管腺癌PANC-1细胞系、人黑色素瘤A375细胞系、人胚肾HEK293细胞系购自美国模式培养物集存库。细胞在含有10％胎牛血清、青霉素和链霉素(100U)的高葡萄糖DMEM培养基中,在37℃下95％空气与5％的二氧化碳中培养。将二氢白藜芦醇(D-Res)添加到HCT-116、PANC-1、A375或HEK293细胞中，以96孔板的形式以每孔8000个细胞的密度接种。采用(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)四唑(MTT)还原试验测定试验细胞24小时后的存活率，并表示为生长抑制50％(GI₅₀，表6)。

表6：二氢白藜芦醇在各种癌细胞中的GI₅₀

细胞系	人源细胞类型	GI<sub>50</sub>
			A375	黑色素瘤	106.59±3.37μM
HCT-116	结肠直肠癌	102.04±5.21μM
			HEK293	胚肾(用作正常对照)	244.11±0.96μM
PANC-1	胰腺导管腺癌	115.69±3.09μM

裸鼠异种移植模型的建立

采用胰蛋白酶化法采集对数生长期HCT-116细胞。离心和冲洗后，细胞以3×10⁷细胞/mL重新悬浮在无血清DMEM培养基中。裸鼠用75％医用乙醇进行皮肤消毒，用25-G注射器皮下注射100μL HCT-116细胞悬液至其左侧。同样的程序重复了肿瘤细胞注射到右侧。

动物分组

肿瘤细胞注射7天后，24只肿瘤体积为32mm³～178mm³的小鼠随机分为3组，每组小鼠的平均初始肿瘤体积分别为78.04±7.76mm³(介质，8只小鼠)，78.76±9.40mm³(5-FU，8只小鼠)，78.01±7.75mm³(D-Res，8只小鼠)。

给药方案和介质的制备

介质溶液：2.5％乙醇和1:1v/v Cremphor EL溶于生理盐水中。

5-FU溶液：将5-FU粉末溶解于2.5％乙醇和Cremphor EL中，浓度为5mg/mL。

D-Res溶液：将二氢白藜芦醇粉末溶于2.5％乙醇和Cremphor EL溶液中，浓度为20mg/mL。

给药方案

介质组(n＝8)：每隔一天腹腔注射2.5％乙醇和Cremphor EL溶液21天。

5-FU组(n＝8)：每隔一天腹腔注射25mg/kg小鼠5-FU溶液21天。

D-Res组(n＝8)：每隔一天腹腔注射100mg/kg的D-Res溶液，持续21天。这相当于人体体重不低于8.13mg/kg的剂量。

与主要抗癌药物5-FU相比，从肿瘤大小(图24)、肿瘤体积(图25)和肿瘤重量(图26)来看，来源于HCT-116人结肠直肠癌细胞的异种移植物肿瘤的生长受到D-Res 21天给药的充分抑制。载瘤小鼠的肿瘤体积、肿瘤重量和体重的数值数据和统计数据分别见表7、8和9。值得注意的是，21天服用D-Res不会导致体重显著下降(图27)。这一结果意味着，D-Res并不是一种会对动物造成严重不良影响的有毒物质。除了活体实验外，D-Res(25μM)的应用确实显著降低了体外A375人黑色素瘤细胞和PANC-1人胰腺导管腺癌细胞的迁移能力(图28)。图29显示了D-Res或DMSO(即实验对照组)24小时处理后，PANC-1细胞表示细胞迁移能力的剥蚀面积百分比变化。此外，表6中的GI₅₀值表明D-Res对癌细胞具有选择性。

D-Res的有效剂量为每天20mg/kg(体重)到100mg/kg(体重)。根据剂量转换公式(Nair AB，Jacob S.A simple practice guide for dose conversion between animalsand human(“动物与人之间剂量转换的简单实践指南”).J Basic Clin Pharma 2016；7:27-31)方程(2)，本发明的D-res的有效转换人剂量范围为1.62mg/kg(体重)至8.13mg/kg(体重)每天。

表7HCT-116人结肠直肠癌裸鼠经介质溶液、氟尿嘧啶(5-FU)和二氢白藜芦醇(D-Res)治疗21天的肿瘤体积(mm³)：

二氢白藜芦醇组与介质组肿瘤体积差异有统计学意义，而5-FU组与介质组肿瘤体积差异有统计学意义，P<0.001。

表8HCT-116人结肠直肠癌裸鼠经介质溶液、氟尿嘧啶(5-FU)和二氢白藜芦醇(D-Res)治疗21天的肿瘤重量(g)

二氢白藜芦醇组与介质组肿瘤重量差异有统计学意义，而5-FU组与介质组肿瘤重量差异有统计学意义，P<0.05。

表9HCT-116人结肠直肠癌裸鼠经溶媒溶液、氟尿嘧啶(5-FU)和二氢白藜芦醇(D-Res)治疗21天的体重(g)。

给药二氢白藜芦醇并没有显著降低实验裸鼠的体重。

本发明的进一步实施例

本发明的另一实施例是提供一种将二氢白藜芦醇或其二氢二苯乙烯衍生物和/或化学变体用作个体中的抗微生物剂的方法。

本发明的抗微生物剂还包括式(I)化合物：

其中R独立地或共同地为OC(＝O)R′；R′是烯基。

实验

抗真菌活性的评价。在96孔微孔板的单孔中，将10μL的测试化合物添加到190μL的生长培养基(Difco^TM YM)中，该培养基含有密度约为5×10⁵cFU的红色毛癣菌或须发藓菌的过夜培养物。测试化合物包括二氢白藜芦醇和DR1到DR11。仅用10μL0.5％DMSO(即无测试化合物)培养的培养孔用作真菌生长的实验控制，而仅用培养基(即无真菌)培养的培养孔用作阴性控制。为了评估抑制皮肤真菌生长的效率，上述两种真菌均在30℃下与试验化合物一起培养或不培养一周，然后在510nm下读取OD；使用反式白藜芦醇作为参考药物。表10显示了不同浓度的测试化合物对须发藓菌的生长抑制百分比，而红色毛癣菌的生长抑制百分比则显示在表11中。与实验对照组和阴性对照组的生长相比，须发藓菌培养的图像在处理后的二氢白藜芦醇(100μM)和DR8(100μM)后被拍摄(图30)。

抗菌活性的评价。在96孔微孔板的单孔中，将10μL的测试化合物添加到190μL的培养基生长培养基(BBL^TM脑-心灌注)中，该培养基含有浓度约为5×10⁵CFU的变形链球菌或远缘链球菌的过夜培养物。测试化合物包括二氢白藜芦醇和DR1到DR11。仅用10μL0.5％DMSO(即无测试化合物)培养的培养孔用作细菌生长的实验控制，而仅用培养(即无细菌)培养的培养孔用作阴性控制。为了评估抑制致龋链球菌生长的效率，上述两种细菌均在30℃下与试验化合物一起培养10小时，然后在600nm下读取OD值；使用反式白藜芦醇作为参考药物。不同浓度的供试化合物对变形链球菌的生长抑制率如表12所示，而对远缘链球菌的生长抑制率如表13所示。与实验对照组和阴性对照组的生长相比，变形链球菌的图像在处理二氢白藜芦醇(100μM)和DR8(100μM)后被拍摄(图31)。

该化合物局部用于治疗皮肤癣菌病和龋齿。

该化合物为凝胶剂、洗剂、乳膏、乳剂、糊剂、溶液或湿润喷雾，用于皮肤癣菌病的治疗。

该化合物为牙膏、口腔凝胶、牙刷消毒剂、漱口剂或口香糖，用于龋齿的管理。

结果

表10显示了二氢白藜芦醇和DR1至DR11对经一周培养后的须发藓菌生长的抑制作用。在供试化合物中，DR8对须发藓菌的抑制作用最强。

表10不同浓度的化合物对须发藓菌生长的抑制作用。

表11显示了二氢白藜芦醇和DR1至DR11对红色毛癣菌培养一周后生长的抑制作用。在试验化合物中，DR8对红色毛癣菌的抑制作用最强。

表11不同浓度化合物对红色毛癣菌生长的抑制作用

表12显示了二氢白藜芦醇和DR1到DR11对变形链球菌培养10小时后生长的抑制作用。在试验化合物中，DR8对变形链球菌的抑制作用最强。

表12。不同浓度化合物对变形链球菌生长的抑制作用

表13显示了二氢白藜芦醇和DR1至DR11对10小时培养后远缘链球菌生长的抑制作用。在试验化合物中，DR8对远缘链球菌的抑制作用最强。

表13。不同浓度化合物对远缘链球菌生长的抑制作用

工业适用性

本发明涉及包含反式-3,5,4’-三羟基二苯甲酰(也称为二氢白藜芦醇)或其二氢二苯乙烯衍生物和/或化学变体的抗菌成分。更具体地说，它涉及到使用二氢白藜芦醇或其衍生物来减少红色毛癣菌和须发藓菌、变形链球菌和远缘链球菌的微生物生长。本发明涉及所述组合物在局部杀菌或抑菌凝胶、洗剂、乳膏、乳剂、糊剂、溶液或湿润喷雾制剂中的应用，用于治疗皮肤癣菌病。本发明还涉及所述组合物在牙膏、口腔凝胶、牙刷消毒剂、漱口剂或口香糖配方中的应用，用于龋齿的管理。