CN110684829A

CN110684829A - 一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒

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Publication number: CN110684829A
Application number: CN201810732719.2A
Authority: CN
Inventors: 赵星; 金皓玄; 李罗权; 赵小莹; 冯太青; 齐晓娟; 周清; 李贵波; 李计广; 王磊; 李阳
Original assignee: Shenzhen Hua Made Dazhi Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Hua Made Dazhi Technology Co Ltd; MGI Tech Co Ltd
Priority date: 2018-07-05
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2020-01-14

Abstract

本申请公开了一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒。本申请的高通量单细胞转录组测序方法，包括采用液滴生成***将单细胞与带有标签的微珠包裹在一个液滴中，并在液滴中进行逆转录。本申请的方法，通量可达9000个细胞，与10×genomics相当，液滴破乳之后微珠相互污染小，提高了有效数据占比。本申请的方法在液滴中进行逆转录，所需试剂少，成本低。本申请的优选方案中，逆转录采用SMART模板转换技术，其产物可以直接用于后续的Tn5文库构建以及BGISeq‑500平台测序，无需进行文库转化；避免了多次扩增引入偏差，实现了液滴微流控平台与BGISeq‑500测序平台连用，简化并方便了大规模单细胞测序。

Description

一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒

技术领域

本申请涉及单细胞测序领域，特别是涉及一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒。

背景技术

疾病发生机制和他们的检测预防主要是通过对细胞基因组变异、转录组异常表达的检测来进行分析。而单细胞测序技术能够揭示组织内细胞复杂的异质性，为疾病的诊断和治疗提供精准的信息。受制于单细胞测序技术的处理通量和成本等问题，很多大规模的研究工作无法展开，微流控技术和单细胞测序技术相结合可以很好地解决这些问题；同时单分子测序技术能够避免核酸扩增所引起的误差，在基础科研和临床医学研究中具有极大的应用前景和需求。

美国Fludigm公司于2014年推出的C1单细胞全自动***，该仪器通量已提升到一次可以分析数百个单细胞。该***的出现成为全世界单细胞研究课题组关注的焦点。但是，Fluidigm的C1***，使用微阀区分单细胞，由于芯片上的腔室有限，通量较低，目前最多只能做938个细胞，且成本高。

Wafergen***，使用微孔芯片和机械臂实现单细胞的分离，微孔数量72*72，相对于Fluidigm的C1***，Wafergen***通量可以达到1000-2000个细胞；但是，通量仍然较低，不能很好的满足大规模研究工作的使用需求；而且，Wafergen***反应体系庞大，导致消耗试剂多、成本高、对样本损耗量大。

相较于Fludigm的C1***和Wafergen***，基于液滴微流控原理的10×genomics和Dolomite通量更高，利用微流控芯片将带有标签的微珠和单细胞包裹在一个液滴中，实现单细胞的分离与标记，可以同时对上万个细胞进行分析。但是，Dolomite***在破乳的时候，微珠上空载的引物容易结合游离mRNA，交叉污染大；形成的文库无法直接环化，不能直接连用BGISeq-500平台；需要额外的文库转换，引入数据偏差，降低数据有效使用率。而10×genomics对样本要求高，成本高；形成的文库也无法直接环化，不能直接连用BGISeq-500平台；同样的，需要额外的文库转换，引入数据偏差，降低数据有效使用率。

此外还有一些单细胞分离技术，例如口吸管、流式细胞仪等。但是，口吸管，显微操作，该方法通量低，耗时长，过程繁琐。流式细胞仪样本需求量大，需要精准控制，并且，对细胞有损伤，对后续建库要求高。

总的来说，目前现有的单细胞分离或单细胞转录组测序技术，受制于通量、成本等问题，很多大规模的研究工作无法展开。一方面，通量低较难实现细胞异质性和不同细胞亚群的细致分析。另一方面，提高通量后导致的双包率增高，成为目前高通量平台的一个瓶颈。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒。

本申请具体采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种高通量的单细胞转录组测序方法，包括采用液滴生成***将单细胞与带有标签的微珠包裹在一个液滴中，并且，在液滴中进行逆转录获得第一链cDNA。

需要说明的是，本申请的单细胞转录组测序方法，采用液滴技术分离单细胞，其通量单次实验可达约9000个细胞，与目前市场上最高通量的10×genomics相当。本申请通过研究实现并提出了在液滴中进行逆转录，其优点是，第一，有效的减少了液滴破乳之后的微珠相互污染，提高了有效数据的占比；第二，液滴中进行逆转录，所需试剂相对较少，成本低；为大规模的单细胞研究工作奠定了基础。

优选的，逆转录采用SMART模板转换技术在mRNA的转录本第一链cDNA的5’端引入碱基，以区分于3’端序列。

需要说明的是，本申请的单细胞转录组测序方法，通过SMART模板转换技术获得第一链cDNA，其产物可以直接用于后续的Tn5文库构建以及BGISeq-500平台测序，无需进行文库转化；这不仅避免了文库转化过程中多次扩增引入偏差，而且实现了液滴微流控平台与BGISeq-500测序平台的连用，极大的简化并方便了大规模的单细胞测序。

优选的，本申请的单细胞转录组测序方法，还包括采用SMART PCR PRIMER对SMART模板转换产物进行SMARTPCR预扩增，扩增获得3’端标记序列；其中，SMARTPCRPRIMER为3’端的特异性引物。

需要说明的是，SMARTPCR预扩增的目的是扩增出3’端目的产物，以方便后续文库构建时特异性扩增出被标记的3’序列。在本申请一种实现方式中，在逆转录转换模板的同时给3’端加上特异性标签，即SEQ ID NO.5所示序列。

优选的，SMARTPCRPRIMER为SEQ ID NO.1所示序列；

SEQ ID NO.1：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’。

需要说明的是，SEQ ID NO.1所示序列的SMARTPCRPRIMER只是本申请实施例中的一种具体实现方式，可以理解，在本申请基本构思下，还可以采用其它的3’端特异性引物，在此不做具体限定。

优选的，本申请的单细胞转录组测序方法还包括采用针对3’端标记序列的特异性引物组对3’端标记序列进行PCR扩增富集，然后对PCR扩增富集产物进行片段选择，将选择的片段环化后，直接采用BGISeq-500平台测序。

需要说明的是，PCR扩增富集是Tn5文库构建中的一个步骤，通过PCR扩增富集以及片段选择后，可以获得更加准确的测序文库，提高测序效率和质量。

优选的，PCR扩增富集中采用的特异性引物组，其上游引物为SEQ ID NO.2所示序列，下游引物为SEQ ID NO.3所示序列，并且，上游引物的5’端具有磷酸化修饰；

SEQ ID NO.2：

5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGCAGTGGTATCAACGCAG AGTAC-3’

其中，SEQ ID NO.2所示序列的上游引物的末位两个碱基进行硫代修饰；

SEQ ID NO.3：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCGTCTCGTGGGCTCGG-3’；

片段环化采用的Splint oligo为SEQ ID NO.4所示序列，

SEQ ID NO.4：5’-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3’。

需要说明的是，SEQ ID NO.2和3所示序列的引物，和SEQ ID NO.4所示序列的Splint oligo，也是本申请实施例中的一种具体实现方式，可以理解，在本申请基本构思下，还可以采用其它的特异性引物组或Splint oligo，在此不做具体限定。

还需要说明的是，SEQ ID NO.3所示序列的下游引物中，为了区别不同来源的样品，还可以在其引物序列中引入一段约10bp左右的索引序列，例如本申请一种实现方式中具体采用了如下序列的下游引物：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCNNNNNNNNNNGTCTCGTGG GCTCGG-3’。

优选的，逆转录中，1mL的逆转录反应液包括：10％Triton-X 10μL、0.1M DTT125μL、RnaseOUT 75μL、10Mm each dNTPs 50μL、5×RTbuffer 400μL、Super Script IIReverse Transcriptase 75μL、Template Switch Oligo 20μL、Rnase-free H₂O265μL；逆转录的反应条件为，37℃30min、65℃60min、4℃待机。

需要说明的是，本申请的单细胞转录组测序方法特别提供了适用于本申请的逆转录反应体系，该反应体系在现有技术中尚未有在试管内或液滴内进行过。

优选的，Template Switch Oligo为SEQ ID NO.5所示序列，

SEQ ID NO.5：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATGGG-3’

SEQ ID NO.5所示序列的Template Switch Oligo中，倒数第2和第3位碱基进行核糖鸟嘌呤核苷修饰，末位碱基进行LNA修饰。

需要说明的是，Template Switch Oligo即SMART转换模板，SEQ ID NO.5所示序列的Template Switch Oligo，也是本申请实施例中的一种具体实现方式，可以理解，在本申请基本构思下，还可以采用其它的SMART转换模板，在此不做具体限定。

优选的，带有标签的微珠中，标签为带有poly T随机序列的引物序列，引物序列为SEQ ID NO.6所示序列，并且，在引物序列的5’端和3’端分别具有poly T尾；引物序列的3’端与3’端的polyT尾之间具有两段barcode，第一段barcode为cellbarcode，用来标记单个细胞，第二段barcode为转录本标记；

SEQ ID NO.6：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’。

需要说明的是，微珠中带有poly T随机序列的引物序列，可以抓住细胞裂解后释放的mRNA；其中，第一段barcode为cell barcode，为随机序列，通常用J12表示，用来标记单个细胞，同一个微珠上cellbarcode相同；第二段barcode，也是随机序列，通常用N8表示，又称作UMI，用来标记转录本，同一个微珠上UMI不同。

优选的，标签序列为SEQ ID NO.7所示序列，

SEQ ID NO.7：

5’-TTTTTTTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

SEQ ID NO.7所示序列中，前12个N为第一段barcode的随机序列，后8个N为第二段barcode的随机序列。

需要说明的是，SEQ ID NO.7所示序列的标签序列，也是本申请实施例中的一种具体实现方式，可以理解，在本申请基本构思下，还可以采用其它的标签序列，在此不做具体限定。

本申请的另一面公开了一种用于高通量单细胞转录组测序的试剂盒，包括SMART转换模板、cDNA 3’端标记引物、PCR扩增富集引物组、Splint oligo，以及带有标签的微珠；其中，SMART转换模板为SEQ ID NO.5所示序列，用于在mRNA的转录本第一链cDNA的5’端引入碱基，以区分于3’端序列；cDNA3’端标记引物为SEQ ID NO.1所示序列，用于在扩增获得3’端标记序列；PCR扩增富集引物组的上游引物为SEQ ID NO.2所示序列，下游引物为SEQID NO.3所示序列，用于对3’端标记序列进行PCR扩增富集；Splint olig为SEQ ID NO.4所示序列，用于将片段化的核酸环化；带有标签的微珠中，标签序列为SEQ ID NO.7所示序列，其中，前12个N为第一段barcode的随机序列，后8个N为第二段barcode的随机序列。

需要说明的是，本申请的试剂盒实际上就是本申请实施例中，高通量的单细胞转录组测序方法所采用的试剂，将这些试剂组合成试剂盒，可以方便的进行高通量的单细胞转录组测序。可以理解，为了方便使用，试剂盒中还可以包括各反应体系中所需要的反应液、酶等，在此不做具体限定。

本申请的有益效果在于：

本申请的高通量单细胞转录组测序方法，单次实验通量可达约9000个细胞，与目前市场上最高通量的10×genomics相当，并且，液滴破乳之后的微珠相互污染小，提高了有效数据的占比；此外，本申请的方法在液滴中进行逆转录，所需试剂相对较少，成本低；为大规模的单细胞研究工作奠定了基础。本申请的优选方案中，逆转录采用SMART模板转换技术，其产物可以直接用于后续的Tn5文库构建以及BGISeq-500平台测序，无需进行文库转化；不仅避免了多次扩增引入偏差，而且实现了液滴微流控平台与BGISeq-500测序平台的连用，极大的简化并方便了大规模的单细胞测序。

附图说明

图1是本申请实施例中液滴生成***在芯片中生成液滴的情况说明图；

图2是本申请实施例中取1μL包裹微珠的液滴在4倍镜下的观察结果图；

图3是本申请实施例中用2100检测液滴中产生的逆转录产物的结果图；

图4是本申请实施例中，Tn5文库构建时，特异性引物组对3’端标记序列进行PCR扩增富集后，PCR扩增富集产物的片段选择产物的2100检测结果。

具体实施方式

高通量的单细胞转录组测序，在基础科研和临床医学研究中具有重要意义。虽然国外已经有C1***、Wafergen***、10×genomics和Dolomite等高通量的单细胞转录组测序方案，但是，这些方案都存在一些不足；并且，目前国内在高通量单细胞测序技术方面尚为空白。本申请率先建立了高通量单细胞转录组的测序平台。结合液滴微流控和单细胞RNA测序技术SMART-Seq，利用带标签的微珠捕获mRNA，同时在液滴中进行逆转录实验，高通量标记分离并获取数千个单个细胞的mRNA的3’端，通过在TSO序列上增加几个碱基，将mRNA的3’端和5’端序列区分开来，并巧妙设计特异性引物，扩增并富集带有标记3’端产物。在提高单细胞通量的同时降低了成本，单次实验细胞通量为2000-9000个，成本降低至1-0.35元/个细胞。在液滴中进行逆转录，降低了污染率同时简化操作；简化了建库流程，实现直接与BGISeq-500测序仪连用。

本申请在提高细胞通量的同时降低了成本，通量与目前市场上最高的10×genomics相当，单次实验可达约9000个细胞，试剂成本却为10×genomics的三分之一，人力成本也大大降低。使得大规模进行单细胞测序研究成为可能。本申请在液滴中进行逆转录，与已有的方法相比，有效的减少了液滴破乳之后的微珠相互污染，提高的有效数据的占比。另外，本申请针对BGISeq-500设计建库体系和测序方案，相比较其他商业平台，本申请构建的文库可以直接用于BGISeq-500测序，减少在文库转换中多次PCR引入的数据误差。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

1、准备试剂

(1)细胞重悬

配制BSA终浓度为0.01％的PBS-BSA5mL；采用PBS-BSA对H1975细胞系进行清洗，并用PBS-BSA重悬细胞，备用。

(2)裂解和逆转录反应试剂配制

1mL的裂解和逆转录反应试剂包括：10％Triton-X 10μL、0.1M DTT 125μL、RnaseOUT 75μL、10Mm each dNTPs 50μL、5×RT buffer400μL、Super Script II ReverseTranscriptase 75μL、Template Switch Oligo 20μL、Rnase-free H₂O 265μL。

其中，Template Switch Oligo为SEQ ID NO.5所示序列，

SEQ ID NO.5：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATGGG-3’

Template Switch Oligo中，倒数第2和第3位碱基进行核糖鸟嘌呤核苷修饰，末位碱基进行LNA修饰。

(3)微珠重悬

本例微珠上连有带有poly(T)随机序列的引物序列，可以抓住细胞裂解后释放的mRNA。引物序列为SEQ ID NO.6所示序列，SEQ ID NO.6：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’。

整个标签序列为SEQ ID NO.7所示序列，

SEQ ID NO.7：

其中，第一段barcode为cell barcode，即前12个N，为随机序列，通常用J12表示，用来标记单个细胞，同一个微珠上cellbarcode相同；第二段barcode，也是随机序列，即后8个N，通常用N8表示，又称作UMI，用来标记转录本，同一个微珠上UMI不同。

取适量微珠1000g 1min离心后，采用未添加DTT的裂解液重悬清洗至少一次，然后采用未添加DTT的裂解液重悬微珠，重悬终浓度为300微珠/μL。

其中，1mL未添加DTT的裂解液包括10％Triton-X 10μL、RnaseOUT 75μL、10Mmeach dNTPs 50μL、5×RTbuffer400μL、Super Script II Reverse Transcriptase75μL、Template Switch Oligo 20μL、Rnase-free H₂O 265μL；

2、液滴生成

采用常规的液滴生成***生成液滴。在生成液滴之前，先用30mL/h将管子中的空气排出，然后控制三个流道的速度分别为：油相流速10mL/h、微球相流速4mL/h、细胞相流速4mL/h，生成液滴。

液滴生成***在芯片中生成液滴的情况如图1所示。取本例生成的液滴1μL，在4倍镜下的观察，结果如图2所示。图2的结果显示，本例制备获得了均匀的单细胞与微珠包被的液滴。

3、液滴中进行逆转录

将生成的液滴200μL，加入到1mL的裂解和逆转录反应试剂中，混合均匀。然后，置于37℃反应30min、65℃反应60min，4℃待机。其中，每个液滴中包含有微球、细胞，以及裂解和逆转录反应试剂；因此，每个液滴中可以独立的进行裂解和逆转录反应。将200μL液滴添加到1mL裂解和逆转录反应试剂目的是从宏观上提供一个裂解和逆转录反应环境。

4、破乳

a)使用1mL的枪去除逆转录反应后的底部多余的油；

b)加入30mL室温的6×SSC；

c)在通风橱中加入1mL表面活性剂PFO，用力摇晃；

d)1000×g下离心1min；

e)小心将离心管从离心机中取出，放入冰中，使用移液器将上清去除，直至剩余少些液体为止；

f)再加入30mL 6×SSC到溶液，静置使大部分的油沉到底部，然后将上清转移到另一个50mL离心管中，此时微珠飘在上清中；

g)1000×g下离心1min；

h)这时微珠留在底部，小心的将上清吸去，留下大概1mL的液体；用枪将剩余的1mL液体混合转移到1.5mL离心管中，离心去除上清；

i)使用1mL的6×SSC清洗两遍，离心去除上清。

5、酶切

酶切的目的是去除微珠上未结合mRNA的引物，以防止交叉污染。具体的酶切反应体系包括：10×Exo I Buffer20μL、H₂O 170μL、20U/uL的Exo I 10μL。

将“4、破乳”获得的产物，用1ml 10mM的Tris pH8.0清洗后，加入200μL酶切反应体系，在37℃孵育45min，期间保持振荡；完成酶切反应。

酶切产物使用1mL TE-SDS清洗一次，使用1mL TE-TW清洗两次；如果后续要进行PCR再使用1mL H₂O清洗一次；然后用1mL H₂O重悬。

6、PCR预扩增

取酶切产物20μL，加入到计数板中，计算微珠的大概浓度，然后按照大约每个PCR管中加入2000微珠的量，将酶切产物加入PCR管中，离心，加入50μL PCR反应液。50μL的PCR反应液包括：H₂O 24.60μL、100μM的SMART PCR PRIMER 0.40μL、2×Kapa HiFiHotstartReady混合液25.00μL。

其中，SMARTPCRPRIMER为SEQ ID NO.1所示序列；

SEQ ID NO.1：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’。

PCR反应条件为，热盖温度105℃，95℃3min，然后进入6个循环：98℃20s、65℃45s、72℃3min，6个循环后进入如下11个循环：98℃20s、67℃20s、72℃3min，11个循环结束后72℃5min，4℃Hold。

7、cDNA纯化和质检

每个样品用0.6×AgencourtAMPure XP微珠，进行选择性纯化。

a)将PCR预扩增产物采用灭菌蒸馏水补齐至50μL。

b)涡旋震荡混匀AMPure XP微珠并吸取30μL体积至50μL的PCR预扩增产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育10分钟。

c)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清，小心移除上清。

d)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后小心移除上清。重复上步，总计漂洗两次。

e)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠3分钟。

f)将EP管从磁力架中取出，加入10μL灭菌超纯水洗脱；涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀；将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体；待溶液澄清，小心吸取上清至灭菌EP管中，于-20℃保存。

采用2100检测***对酶切产物进行检测，结果如图3所示。图3的结果显示，曲线呈单峰，无小片段拖尾，表明逆转录成功，产物的片段分布为600-10000bp，主峰在2000bp，符合cDNA片段大小。

8、Tn5文库构建

(1)片段化处理

于室温解冻5×TAG Buffer，上下颠倒混匀后备用；确认NF buffer或者0.1％SDS处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀。如有沉淀，于37℃加热并剧烈震荡充分混匀使沉淀溶解。片段化处理反应体系包括：酶切产物1μL、5×TAG Buffer4μL、FragmentEnzymeAdvanced混合液V5S 0.6μL、H₂O补齐20μL。反应液混匀后，55℃温浴7min，添加5μL的0.1％SDS室温5min，终止反应，置于冰上。

(2)PCR扩增富集

为了特异性扩增出被标记的3’序列，且后续产物可以直接环化，避免多次扩增引入偏差，本例采用5’磷酸化修饰的特异性引物Droplet-Ad153-F-tag对片段化处理的产物进行PCR扩增。

上游引物，即Droplet-Ad153-F-tag，为SEQ ID NO.2所示序列；下游引物，即Ad153-R-tag，可以采用SEQ ID NO.3所示序列；并且，上游引物的5’端具有磷酸化修饰，上游引物的末位两个碱基进行硫代修饰。

SEQ ID NO.2：

5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGCAGTGGTATCAACGCAG AGTAC-3’

SEQ ID NO.3：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCGTCTCGTGGGCTCGG-3’。

本例在SEQ ID NO.3所示序列的下游引物中加入了一段10bp的随机序列用于区别不同的样品，因此，下游引物Ad153-R-tag具体为如下序列：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCNNNNNNNNNNGTCTCGTGG GCTCGG-3’。

PCR反应体系包括：5×KAPAFidelity Buffer 10μL、10mM的each dNTPs1.5μL、20μM的Droplet-Ad153-F-tag 2.5μL、20μM的Ad153-R-tag 2.5μL、1U/μL的KAPAHiFiDNApolymerase 1μL、片段化处理的产物5-12.5μL，H₂O补齐至50μL。

PCR反应体系混合均匀后，将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，热盖温度105℃，72℃5min，95℃3min，然后进入18个循环：98℃20s、60℃15s、72℃25s，循环结束后，72℃5min，4℃Hold。

(3)扩增产物片段选择

每个样品使用0.6×+0.2×AgencourtAMPure XP微珠，进行选择性纯化。具体如下：

a)将PCR扩增产物采用灭菌蒸馏水补齐至50μL。

b)涡旋震荡混匀AMPure XP微珠并吸取30μL体积至50μL的PCR产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育10分钟。

c)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清，小心转移上清至干净EP管中，丢弃磁珠。

d)涡旋震荡混匀AMPure XP微珠并吸取10μL体积至上清中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟。

e)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清，小心移除上清。

f)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后小心移除上清。

g)重复上步，总计漂洗两次。

h)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠3分钟。

i)将EP管从磁力架中取出，加入15μL灭菌超纯水洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清，小心吸取上清至灭菌EP管中，于-20℃保存。

采用2100检测***对酶切产物进行检测，结果如图4所示。图4的结果显示，曲线呈单峰，主峰为498bp，符合目的产物片段大小。

(4)上样

a)按照DNA混合液总量550ng上样，根据样品上样基数，确定每个样品的上样体积；

b)为了保证测序时碱基平衡，目前上样基数只能是8的倍数，8×N个样品测1条lane则上样基数为8×N。

c)换算方法：例如，16个样品凑成1个文库，每个样品应取得总量为550/16＝34.375ng，样品1的浓度为5ng/μL，则样品1对应的体积为29.375ng/(5ng/μL)＝6.875μL；样品2按照此方法计算。

d)DNA混合液冻存到-20℃备用。

(5)ssDNA环化

将DNA混合液中的核酸片段环化，具体如下：

样品制备：将20μM的Splint oligo 5μL、DNA混合液约20μL、无核酸水补足到70μL。混合均匀后，95℃3min，然后置于冰上，获得混合样品液70μL，备用。

其中，Splint oligo为SEQ ID NO.4所示序列，

SEQ ID NO.4：5’-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3’。

ssDNA环化的反应体系包括：混合样品液70μL、10×TA buffer 12μL、100mM的ATP或者100mM dATP 1.2μL、600U/μL的T4DNAligase 0.42μL、无核酸水36.38μL，总计120μL。

配制好上述反应液后，振荡，轻甩5s；37℃孵育1h，4℃hold，获得ssDNA的连接环化产物。

产物取1μL测dsDNA浓度，结果显示，获得的ssDNA连接环化产物浓度为3.8ng/μL，可以用于后续分析。

(6)酶切

a)将反应液置于冰浴中，依次添加：ssDNA环化产物120μL、10×TAbuffer0.8μL、20U/μL的EXO I 3.9μL、100U/μL的EXO III 0.65μL、无核酸水2.65μL，总计128μL。

配制好上述反应液后，振荡，轻甩5s；37℃孵育30min，4℃hold；获得酶切产物。

酶切产物取1μL测dsDNA浓度；结果显示，酶切产物浓度为0.16ng/μL，可以用于后续分析。

(7)磁珠纯化

a)取170μL的PEG32微珠，加入到酶切反应产物中，涡旋震荡混匀，室温孵育10分钟；

b)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清，小心移除上清；

c)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后小心移除上清；

d)重复上步，总计漂洗两次；

e)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠3分钟；

f)将EP管从磁力架中取出，加入40μL灭菌超纯水洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清，小心吸取上清至灭菌EP管中，于-20℃保存；即获得可以直接用于BGISeq-500测序平台的Tn5文库。

纯化产物取1μL测ssDNA浓度；结果显示，Tn5文库的浓度为1.64ng/μL，能够满足测序需求。

9、BGISeq-500测序

直接对所获得的Tn5文库进行BGISeq-500测序，其中：

a)一链测序引物

R1-cell-UMIbarcode:SEQ ID NO.8：

5’-ATCCGACTTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’

b)二链测序引物

R2-insert:SEQ ID NO.9：

5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’

R2-sample index:SEQ ID NO.10：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTC-3’

c)MDA-Splint oligo:SEQ ID NO.11：

5’-GACAACAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATG-3’

d)三段式测序，测序方案为PE 30+100+10

与此同时，本例采用Sanger测序对“6、PCR预扩增”的产物进行了测序验证；并采用Sanger测序对本例构建的Tn5文库进行测序验证。

10、测序结果

根据BGISeq-500测序平台的质检报告，本例构建的Tn5文库，其合格的文库下机质量ESR>75％，具体的，ESR为76.42％；Q30>80％，具体的Q30为90.32。

以上结果说明，本例在液滴中进行逆转录的方法可以产生合格的测序文库，并且，能够很好的与BGISeq-500测序平台连用。

本例采用Sanger测序对“6、PCR预扩增”的产物进行测序验证，测序结果为SEQ IDNO.12所示序列；其中，SEQ ID NO.12所示序列中，第1位碱基至第69位碱基为微珠上的序列结构，测序结果表明微珠上的引物能够成功捕获RNA；第26位碱基至第37位碱基为cellbarcode，用以标记单细胞；第38位碱基至第45位碱基为UMI，用以标记转录本；SEQ IDNO.12所示序列的3’端第1224位碱基至第1247位碱基为5’端的TSO序列，表明捕获住的RNA在液滴中成功进行逆转录；SEQ ID NO.12所示序列的中间段序列，即第70位碱基至第1223位碱基为cDNA序列。Sanger测序验证结果表明，本例的方法能够成功捕获RNA，并且捕获的RNA在液滴中成功进行了逆转录。

Sanger测序对本例构建的Tn5文库进行测序验证，测序结果为SEQ ID NO.13所示序列；SEQ ID NO.13所示序列中，第1位碱基至第103位碱基为微珠上的序列结构；第67位碱基至第78为碱基为cell barcode，用以标记单细胞；第79位碱基至第86位碱基为UMI，用以标记转录本；SEQ ID NO.12所示序列的3’端第317位碱基至第363位碱基为ad153R-tag序列，其中第332位碱基至第340位碱基为sample index，用以标记不同样本；SEQ ID NO.12所示序列的中间段序列，即第104位碱基至第316位碱基为cDNA序列。Sanger测序验证结果表明，本例的方法成功的将中间产物和5’端产物去除，特异性扩增并富集了3’端目标产物。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒

<130> 17I25785

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaacgacatg gctacgatcc gacttaagca gtggtatcaa cgcagagtac 50

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtgagccaa ggagttgttg tcttcgtctc gtgggctcgg 40

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccatgtcgt tctgtgagcc aagg 24

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagcagtggt atcaacgcag agtgaatrgr gg 32

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagcagtggt atcaacgcag agtac 25

<210> 7

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(52)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

tttttttaag cagtggtatc aacgcagagt acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tt 82

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atccgactta agcagtggta tcaacgcaga gtac 34

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtgagccaa ggagttgttg tcttc 25

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacaacaact ccttggctca cagaacgaca tg 32

<210> 12

<211> 1247

<212> DNA

<213> 逆转录产物Sanger测序结果

<400> 12

aagcagtggt atcaacgcag agtacactag tgtgtaacca agcgcttttt tttttttttt 60

ttttttttta aagactgaat tctttatttg gaatgaaata ttcttgtctt acacagtaga 120

taataaaaag gaataacgta tacacattat taatcataaa tgaaaagaga aaaccagtgc 180

aaaatgcggc agacagtaca tctctaacat attgcaaagg ctgataccgg gacaacacta 240

cttcagaaag gtgccagcaa aatggtgaat gtgtgaaaac aaagaaaaat attgtgttta 300

tagggtgcag aaagtttccc agaaactgac agagcccatg catctctgca cccagaatac 360

acttagagaa taatttaacc atgacaatag ggactacaga aaatggtata ttgtgtataa 420

acctggcctc tctaatcgcc tccttatgtg cctggaacat cttgacgttg ttcatgttcg 480

actgccaata tttcacatat cctccgtggt ctgctgtcaa catccacatg tcattatgtg 540

accacgtcat ggccctcact gggctgtcgt gagcctgtaa tattgtttca aaattgaaag 600

tgagtccatt ccacagggta aactccccac tagaagctcc agtgaccaag cgtcttcctt 660

ctggagtcca cctaacaaca aatacaggac actttacttt atttgttgat gtccgaacaa 720

attttgttgt tactgcattc ataggattat tcaacattcc tataggtggg accagatcat 780

tgtaataacc tgcatcaggc tgaattgccc gcatatctct ctggtctctt tgccatattc 840

tgttctccaa atacttaatt acagatggat tgtagtctat ggtttttcgg ttcacagctt 900

ttctcattcg ttttccatca aaagtaagct gttgcattgc ttgctgttgt gcaaaatcag 960

gtcgcttata aaacagctgt cgaggtgcct ggtgctggaa ccttggcata tggaaaaaac 1020

gaggaggaga accaatttct gtagccatgg tgatgttttc cttctaggat acgtctggct 1080

ttgagcagag ctcctaaatg gccagcgaag cgttcgcctt cagagccaga aatgtctctc 1140

ttgtttggtc tccccacccc gatcctctca atcccgctcc tccaaaggag cagccgccat 1200

cttcccctat gggcccccca ttcactctgc gttgatacca ctgctta 1247

<210> 13

<211> 363

<212> DNA

<213> Tn5打断后筛选片段的测序结果

<400> 13

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctgtccgcg gaagcagtgg tatcaacgca 60

gagtaccgcc ctctccggac atggtgtttt tttttttttt tttggctctc tgctcctcct 120

gttcgacagt cagccgcatc ttcttttgcg tcgccagccg agccacatcg ctcagacacc 180

atggggaagg tgaaggtcgg agtcaacgga tttggtcgta ttgggcgcct ggtcaccagg 240

gctgctttta actctggtaa agtggatatt gttgccatca atgacccctt cattgacctg 300

tctcttatac acatctccga gcccacgaga ctaaggcgaa tctcgtatgc cgtcttctgc 360

ttg 363

Claims

1.一种高通量的单细胞转录组测序方法，其特征在于：包括采用液滴生成***将单细胞与带有标签的微珠包裹在一个液滴中，并且，在所述液滴中进行逆转录获得第一链cDNA。

2.根据权利要求1所述的单细胞转录组测序方法，其特征在于：所述逆转录采用SMART模板转换技术在mRNA的逆转录本第一链cDNA的5’端引入碱基，以区分于3’端序列。

3.根据权利要求2所述的单细胞转录组测序方法，其特征在于：还包括采用SMART PCRPRIMER对SMART模板转换产物进行SMART PCR预扩增，扩增获得3’端标记序列；其中，SMARTPCR PRIMER为3’端的特异性引物。

4.根据权利要求3所述的单细胞转录组测序方法，其特征在于：所述SMART PCR PRIMER为SEQ ID NO.1所示序列；

SEQ ID NO.1：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’。

5.根据权利要求3所述的单细胞转录组测序方法，其特征在于：还包括采用针对所述3’端标记序列的特异性引物组对所述3’端标记序列进行PCR扩增富集，然后对PCR扩增富集产物进行片段选择，将选择的片段环化后，直接采用BGISeq-500平台测序。

6.根据权利要求5所述的单细胞转录组测序方法，其特征在于：所述特异性引物组的上游引物为SEQ ID NO.2所示序列，下游引物为SEQ ID NO.3所示序列，并且，上游引物的5’端具有磷酸化修饰；

SEQ ID NO.2：5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’

SEQ ID NO.3：5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCGTCTCGTGGGCTCGG-3’

片段环化采用的Splint oligo为SEQ ID NO.4所示序列，

SEQ ID NO.4：5’-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3’

其中，SEQ ID NO.2所示序列的上游引物的末位两个碱基进行硫代修饰。

7.根据权利要求1-6任一项所述的单细胞转录组测序方法，其特征在于：所述逆转录中，1mL的反应液包括10％Triton-X 10μL、0.1M DTT 125μL、RnaseOUT 75μL、10Mm eachdNTPs 50μL、5×RT buffer 400μL、Super Script II Reverse Transcriptase 75μL、Template Switch Oligo 20μL、Rnase-free H₂O 265μL；逆转录的反应条件为，37℃30min、65℃60min、4℃待机。

8.根据权利要求7所述的单细胞转录组测序方法，其特征在于：所述Template SwitchOligo为SEQ ID NO.5所示序列，

SEQ ID NO.5：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATGGG-3’

9.根据权利要求1-6任一项所述的单细胞转录组测序方法，其特征在于：所述带有标签的微珠中，所述标签为带有poly T随机序列的引物序列，所述引物序列为SEQ ID NO.6所示序列，并且，在所述引物序列的5’端和3’端分别具有poly T尾；引物序列的3’端与3’端的poly T尾之间具有两段barcode，第一段barcode为cell barcode，用来标记单个细胞，第二段barcode为转录本标记；

SEQ ID NO.6：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’；

优选的，所述标签序列为SEQ ID NO.7所示序列，

SEQ ID NO.7：5’-TTTTTTTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

10.一种用于高通量单细胞转录组测序的试剂盒，其特征在于：包括SMART转换模板、cDNA 3’端标记引物、PCR扩增富集引物组、Splint oligo，以及带有标签的微珠；

所述SMART转换模板为SEQ ID NO.5所示序列，用于在mRNA的转录本第一链cDNA的5’端引入碱基，以区分于3’端序列；

所述cDNA3’端标记引物为SEQ ID NO.1所示序列，用于在扩增获得3’端标记序列；

所述PCR扩增富集引物组的上游引物为SEQ ID NO.2所示序列，下游引物为SEQ IDNO.3所示序列，用于对所述3’端标记序列进行PCR扩增富集；

所述Splint olig为SEQ ID NO.4所示序列，用于将片段化的核酸环化；

所述带有标签的微珠中，标签序列为SEQ ID NO.7所示序列，其中，前12个N为第一段barcode的随机序列，后8个N为第二段barcode的随机序列。