CN110650790A - 用于样品分析的方法和*** - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于分析生物样品以对所述样品中的血小板进行标识、分类和/或量化的方法。本公开还提供了用于分析血液样品以确定所述样品中存在血小板团块的***和方法。还提供了被配置成执行所公开的方法的***和存储用于执行所公开的方法的步骤的指令的计算机可读媒体。

Description

用于样品分析的方法和***
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年5月25日提交的美国临时专利申请第62/511,237号的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
背景技术
本公开涉及血液学***和方法。更具体地说，本公开涉及检测如血液样品等生物样品中的血小板。本公开还涉及检测如血液样品等生物样品中的血小板团块。
血小板(也称为凝血细胞)是大量存在于血液中并参与凝血的无细胞核的小型无色盘状细胞碎片。未活化的血小板为透镜形状的双凸盘状结构，直径为2-3μm，并且是血液中最小的细胞。
血小板浓度低为血小板减少症并且原因是产生减少或破坏增加。血小板浓度升高为血小板增多症并且是先天性的、反应性的(对细胞因子有反应)或者原因是产生不受控制：骨髓增生性肿瘤或其它某些髓系肿瘤之一。血小板功能的障碍被称为血小板病。
对血小板的检测通常受分析仪中的噪声的限制。噪声可能由光源(如激光功率的波动)、放大电子装置或其它源引起。本文所公开的方法将血小板与噪声分离。
血小板团块可能存在于血液样品中，并且通常可能在所收集的样品中形成，并且可能干扰细胞计数。本文所公开的方法识别样品中存在血小板团块。
发明内容
本公开的各方面包含一种用于在流式细胞仪中将血小板事件与噪声区分的方法。所述方法可以包含：使包括血小板的样品流过所述流式细胞仪的流动池；光学地探询流过所述流动池的所述样品；检测来自经过探询的样品的光信号；将检测到的信号分成对应于红细胞(RBC)事件的信号和对应于小于RBC事件的事件的信号；将所述对应于小于RBC事件的事件的信号分成推定血小板事件和推定噪声；将对应于推定血小板事件和推定噪声的信号转换成对数尺度；使用高斯混合模型拟合经过转换的信号以生成所述推定血小板事件和所述推定噪声的拟合分布；以及当所述拟合分布的位置和宽度处于血小板事件的范围内时，将所述推定血小板事件标识为血小板事件。
在其它方面，所述方法包含：在所述标识之前，将所述推定血小板事件的所述拟合分布的位置和宽度与所述推定噪声的所述拟合分布的位置和宽度进行比较，其中当所述分布处于接受的范围之外时，拟合具有较高噪声约束的高斯混合模型。
在一些方面，使用高斯混合模型拟合经过转换的信号可以涉及使用期望最大化算法。例如，可以将推定血小板事件和推定噪声的对数绘制为直方图并且使用高斯混合模型对所述对数进行建模。
在一些方面，计算机实施的数据分析***可以执行期望最大化(EM)算法以产生推定PLT事件和推定噪声的对数数据的高斯混合模型(GMM)。在一些方面，可以迭代地执行EM算法以改进针对GMM的解决方案。
在一些方面，计算机实施的数据分析***可以执行期望最大化(EM)算法以产生推定PLT事件和推定噪声以及推定WBC事件和推定RBC事件的对数数据的高斯混合模型(GMM)。在这种情况下，GMM可以用于拟合小于WBC和RBC的事件。
在其它方面，所述方法包含其中以100记录/秒、1000记录/秒、10,000记录/秒或100,000记录/秒的频率执行所述检测来自经过询问的样品的信号。
在其它方面，所述方法包含其中所述信号包括中间角度散射(IAS)、偏振侧向散射(PSS)或轴向光损失(ALL)中的一个或多个。
在其它方面，所述方法包含其中所述信号包括中间角度散射(IAS)和偏振侧向散射(PSS)。
在一些方面，所述样品为全血样品。在一些方面，所述样品是含有完整RBC的未裂解的全血样品。在一些方面，所述样品是用与核酸结合并且含有RBC的细胞渗透性荧光染料染色的全血样品。在其它方面，所述样品是用与核酸结合的细胞渗透性荧光染料染色的并且被裂解以去除完整RBC的全血样品。在其它方面，已经将所述样品与RBC裂解剂一起温育并且未用与核酸结合的细胞渗透性荧光染料对所述样品进行染色。
在其它方面，所述方法包含其中光学地探询所述颗粒包括使用激光器激发所述细胞。
在其它方面，提供了一种用于执行用于在流式细胞仪中将血小板事件与噪声区分的方法的***。在某些方面，所述***可以包括流式细胞仪。
本公开的各方面包含一种非暂时性计算机可读媒体，其存储有指令，所述指令当由计算装置执行时使所述计算装置执行如本文所提供的用于在流式细胞仪中将血小板事件与噪声区分的步骤。
本公开的各方面包含一种用于将样品标识为包括血小板团块的方法。所述方法可以包含：将样品与包括细胞渗透性荧光染料和红细胞裂解剂的试剂一起温育，持续足以裂解红细胞并且将含细胞核细胞荧光染色的时间段；使所述样品流过流式细胞仪的流动池；光学地探询流过所述流动池的所述样品；检测来自经过探询的样品的光信号；标识与低于阈值的荧光信号相关联的事件，其中所标识事件的荧光信号低于来自白细胞(WBC)的荧光信号；以及确定所述所标识事件的大小，其中大小大于血小板的大小的事件的存在表明所述样品包括血小板团块。
在其它方面，所述方法包含：选择大小大于血小板的大小的所述所标识事件；用线对所选事件进行拟合；将所述线延长到与WBC相关联的信号中；以及将所述线附近的WBC重新分类为血小板团块。所述重新分类从WBC事件中去除血小板团块事件以提供正确的WBC计数。
在其它方面，所述方法包含其中所述信号包括中间角度散射(IAS)、偏振侧向散射(PSS)、轴向光损失(ALL)或荧光(FL)中的一个或多个。
在其它方面，所述方法包含其中所述信号包括FL和PSS。
在一些方面，所述样品为全血样品。在其它方面，已经用与核酸结合的荧光染料对所述样品进行染色。在其它方面，已经将所述样品与RBC裂解试剂一起温育。
在其它方面，所述方法包含其中光学地探询所述颗粒包括使用激光器激发所述细胞。
在其它方面，提供了一种用于执行用于如本文所公开的将样品标识为包括血小板团块的方法的***。在某些方面，所述***可以包括流式细胞仪。
本公开的各方面包含一种非暂时性计算机可读媒体，其存储有指令，所述指令当由计算装置执行时使所述计算装置执行如本文所提供的用于将样品标识为包括血小板团块的步骤。
附图说明
图1描绘了用于将从血液学分析仪检测到的血小板与噪声信号区分的示例性方法。
图2描绘了用于检测在血液学分析仪中分析的样品中存在血小板(PLT)团块的示例性方法。
图3提供了第一样品的源自从血液学分析仪检测到的PSS信号和IAS信号的对数偏振侧向散射(log PSS)和对数中间角度散射3(log IAS3)的绘图。
图4提供了图3中描绘的噪声和血小板相关数据的直方图。
图5提供了第二样品的源自从血液学分析仪检测到的PSS信号和IAS信号的对数偏振侧向散射(log PSS)和对数中间角度散射3(log IAS3)的绘图。
图6供了图5中描绘的噪声和血小板相关数据的直方图。
图7A描绘了从流式细胞仪记录的PSS(X轴)和FL(Y轴)的绘图。FL信号低于WBC的FL信号的事件通过+指示。图7B描绘了通过将对所标识PLT团块进行拟合的线延长到WBC的信号中来对另外的PLT团块进行分类。
图8A描绘了从流式细胞仪记录的PSS(X轴)和FL(Y轴)的绘图。FL信号低于WBC的FL信号的事件通过+指示。图8B描绘了通过将对所标识PLT团块进行拟合的3D线延长到WBC的信号中来对另外的PLT团块进行分类。
定义
术语“评估”包含任何形式的测量并且包含确定要素是否存在。术语“确定(determining)”、“测量(measuring)”、“评估(evaluating、assessing)”和“测定(assaying)”可互换使用并且包含定量和定性测定。评估可以是相对的或绝对的。
如本文所用的术语“体液”总体上是指源自“生物样品”的流体，所述生物样品包含从个体或个体群体获得的各种样品类型并且可以用于诊断、监测或筛选测定。所述定义涵盖生物来源的血液和其它液体样品。所述定义还包含在采购之后以任何方式处理的样品，如通过混合或汇集单独的样品、用试剂处理、溶解或富集如有核细胞、无核细胞、病原体等某些组分操纵的样品。
术语“生物样品”涵盖临床样品并且还包含培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。术语“生物样品”包含尿液、唾液、脑脊髓液、间质液、眼内液、滑液、全血、血液部分(如血浆和血清)等。
如本文所用，术语“事件”是指颗粒产生足以触发至少一个检测器(如例如，IAS检测器)的信号，借此所述至少一个检测器用信号通知分析仪在分析仪上启用的所有检测器上收集该颗粒的测量值(例如，ALL、IAS、PSS和DSS)。颗粒包含但不限于白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、红细胞碎片、血小板(PLT)、脂质和血小板(PLT)团块。
如本文所用，术语和短语“稀释液”、“鞘液”和“稀释液/鞘液”等意指适于与
Figure BDA0002260102810000051
SapphireTM、
Figure BDA0002260102810000052
RubyTM、3000系列和
Figure BDA0002260102810000054
4000系列血液学分析仪一起使用的类型的鞘液稀释液，所述鞘液稀释液可从加利福尼亚州圣克拉拉雅培公司(Abbott Laboratories,Santa Clara,Calif.)商购获得并且通过引用并入本文。
如本文所用，术语“DNA”意指脱氧核糖核酸，其是活细胞核的聚合染色体成分。如本文所用，术语“RNA”意指核糖核酸。
具体实施方式
本公开包含方法。还提供了被配置成执行所公开方法的***和存储用于执行所公开方法的步骤的指令的计算机可读媒体。
在更详细地描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于所描述的具体实施例，因为此类实施例当然可以改变。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
在提供了值范围的情况下，应当理解的是，介于该范围的上限与下限之间的每个中间值(到下限的单位的十分之一，除非另外明确说明)以及所述范围中的任何其它所陈述或中间值均涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在更小的范围中，并且也涵盖在本发明内，这受制于所陈述的范围中的任何具体排除的极限。在所陈述的范围包含极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些被包括在内的极限中的任一个或两个极限的范围也包含在本发明中。
某些范围在本文中以前面有术语“约(about)”的数值呈现。术语“约”在本文中用于为其后面的准确数字以及接近或近似于所述术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于具体叙述的数字时，接近或近似于未叙述的数字可以为这样的数字：在其被呈现的上下文中，其提供与具体叙述的数字的实质等效物。
除非另外定义，否则本文中使用的全部技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管与本文中描述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料也可以用于实践或测试本发明，但是现在对代表性的说明性方法和材料进行描述。
在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利被确切且单独地指示为通过引用并入一样，并且通过引用并入本文以结合所引用的出版物来公开和描述所述方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在提交日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本发明因先前的发明而无权先于这种出版物。另外，所提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际公开日期不同。
应当指出，如本文以及在所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另外明确指示。另外，应指出，权利要求可能被撰写为排除任何任选要素。因此，此陈述旨在充当结合权利要求要素的叙述使用如“单独(solely)”、“仅(only)”等排他性术语或使用“否定型(negative)”限制的前置基础。
如对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，在阅读本公开时，本文所描述和说明的单独实施例中的每一个实施例都具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本发明的范围或精神的情况下易于与其它几个实施例中的任何实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其它顺序来执行任何所叙述的方法。
方法
用于将血小板事件与噪声区分的方法
本公开包含用于在流式细胞仪中将血小板事件与噪声区分的方法。本发明的方法可用于揭开可能被噪声掩盖的血小板(PLT)群体，并且因此其提供的PLT计数比现有技术方法提供的PLT计数更准确。
用于将PLT事件与噪声区分的方法的各方面包含：使包括血小板的样品流过流式细胞仪的流动池；光学地探询流过所述流动池的所述样品；检测来自经过探询的样品的光信号；将检测到的信号分成对应于红细胞(RBC)事件的信号和对应于小于RBC事件的事件的信号；将所述对应于小于RBC事件的事件的信号分成推定血小板事件和推定噪声；将对应于推定血小板事件和推定噪声的信号转换成对数尺度；使用高斯混合模型拟合经过转换的信号以生成所述推定血小板事件和所述推定噪声的拟合分布；以及当所述拟合分布的位置和宽度处于血小板事件的范围内时，将所述推定血小板事件标识为血小板事件。
本发明的方法涉及使用比现有技术方法的阈值更低的阈值，其中较低阈值允许包含还可能包含噪声的PLT数据。然后，本发明的方法从噪声中解析出PLT数据以便检测已被噪声掩盖的这些PLT。在一些方面，检测到的信号是高于1厘升的大小阈值的信号。相反，现有技术方法具有较高的阈值，所述阈值在降低噪声的同时还会错误地降低PLT计数。
用于将PLT事件与噪声区分的本发明的方法可以包含第一阈值，所述第一阈值将对应于RBC的信号与对应于小于RBC的事件的信号分离，所述较小事件包含血小板、以及细胞碎片、碎片和噪声。
对应于小于RBC的事件的信号经受另外的阈值，即，低于第一阈值的第二阈值。第二阈值被设置为使得还包含可能对应于噪声的一些信号。此较低阈值使得能够包含来自较小PLT的较弱信号，如果使用较高阈值，则所述较弱信号可能被丢弃。在一些实施例中，可以将第二阈值设置成用于筛选出对应于大小小于1厘升的事件或噪声的数据。在一些情况下，可以将第一阈值设置为使得对应于最大直径为6μm或更高的事件的数据与较小事件分离。可以使最大直径小于6μm的事件的数据经受第二阈值，所述第二阈值将最大直径小于1μm的事件的数据与最大直径为1μm到小于6μm的事件分离。然后，可以分析对应于最大直径为1μm到小于6μm的事件的这种数据以标识这些事件中的PLT并且将其与噪声区分。
标识PLT并将其与噪声区分的步骤可以涉及将对应于推定血小板事件和推定噪声的信号转换成对数尺度。
可以以至少100事件/秒，如至少1000-250,000事件/秒、10,000-250,000事件/秒、10,000-250,000事件/秒、100,000-250,000事件，例如，100,000事件/秒或250,000事件/秒的速率对所收集的信号执行本发明的方法。
在某些方面，可以将所收集的原始数据转换为对数(log)尺度。转换可以涉及将模拟数据转换为数字数据的步骤。模拟数据到数字数据的转换可以在应用第一阈值之前、在应用第二阈值之前或在应用第二阈值之后执行。在一些情况下，可以在已经应用第一阈值并且已经将小于RBC事件的事件与RBC事件分离之后并且在应用将作为明显噪声信号的信号(例如，对应于大小小于1厘升的颗粒的信号)分离出来的第二阈值之前执行模拟数据到数字数据的转换以产生对数数据。
所述方法可以进一步包含将高斯混合模型应用于经过转换的数据以将推定PLT事件与噪声分离。在某些情况下，所述方法可以包含使用高斯混合模型拟合所述经过转换的信号以生成推定血小板事件和推定噪声的拟合分布。在某些实施例中，当推定PLT事件的拟合分布的位置和宽度处于PLT事件的范围内时，推定PLT事件被标识为血小板。
在某些情况下，所述方法可以包含：在所述标识之前，将推定血小板事件的拟合分布的位置和宽度与推定噪声的拟合分布的位置和宽度进行比较，其中当所述分布处于接受的范围之外时，可以以不同的方式拟合经过转换的数据。例如，可以使用具有较高噪声约束的高斯混合模型拟合经过转换的数据，然后标识PLT事件和噪声。
在某些情况下，通过流式细胞仪检测并且通过本发明的方法分析的信号可以包含中间角度散射(IAS)、偏振侧向散射(PSS)或轴向光损失(ALL)中的一个或多个。在其它情况下，通过流式细胞仪检测并且通过本发明的方法分析的信号可以包含中间角度散射(IAS)和偏振侧向散射(PSS)。
在某些情况下，所述方法可以结合通过检测全血样品中的WBC、RBC和血小板并对其进行计数执行全血分析的方法来执行。全血样品可以是未裂解且未染色的(例如，未用与核酸结合的细胞渗透性荧光染料进行染色)。
图1展示了涉及标识血液样品中的PLT的示例性过程。作为第一步骤，收集原始数据并将其分成大事件的数据和小事件的数据。大事件最终将被分类为RBC(或WBC)，并且小事件代表PLT和噪声两者。应用阈值以切出明显为噪声的数据(例如，对应于小于1厘升的粒径的数据)。将剩余的数据变换为对数。在一些情况下，使用IAS3通道将事件峰变换为对数，并且使用针对小事件(即，小于WBC和RBC的事件)的GMM(高斯混合模型)来进行拟合。接下来，分析经过拟合的PLT和噪声分布的位置和宽度以确定所述分布是否处于可接受的范围内。如果模型拟合，则小事件被分成PLT和噪声。如果模型不拟合，则应用针对较大事件(例如，小于WBC和RBC并且大于3厘升、2厘升或1厘升)的有限GMM并且对PLT和噪声进行分类。如本文所述，此过程可以结合确定全血样品的全血细胞计数来执行，并且因此可以不涉及RBC的裂解。在某一情况下，所述方法可以不涉及用荧光染料对血液样品中的细胞的细胞核进行染色。
检测血小板团块的方法
有时，在将样品呈递到血小板计数仪器(例如，血液学分析仪)以供分析之前，可能在测试样品中形成血小板团块。因此，所获得的血小板(PLT)计数可能虚假地较低。此外，PLT团块可能被计为WBC。本公开的各方面包含一种用于将样品标识为包括血小板团块的方法。所述方法可以进一步包含在减去来自PLT团块的信号之后提供经过校正的WBC浓度。在某些方面，当PLT团块的数量高于PLT团块的可接受数量的阈值时，可以标记样品并忽略针对样品所获得的细胞计数。***可以进一步向用户传达测试失败的消息。
在某些实施例中，将样品标识为包括血小板团块的方法可以包含：将样品与包括细胞渗透性荧光染料和红细胞裂解剂的试剂一起温育，持续足以裂解红细胞并且将含细胞核细胞荧光染色的时间段；使所述样品流过流式细胞仪的流动池；光学地探询流过所述流动池的所述样品；检测来自经过探询的样品的光信号；标识与低于阈值的荧光信号相关联的事件，其中所标识事件的荧光信号低于来自白细胞(WBC)的荧光信号；以及确定所述所标识事件的大小，其中大小大于血小板的大小的事件的存在表明所述样品包括血小板团块。
在某些情况下，可以将大小阈值设置为使得最大直径大于8μm并且FL信号小于WBC的阈值的颗粒可以被标识为PLT团块。
在某些方面，所述方法可以进一步涉及：选择大小大于血小板的大小的所述所标识事件；用线对所选事件进行拟合；将所述线延长到与WBC相关联的信号中；以及将所述线附近的WBC重新分类为血小板团块。将WBC重新分类为PLT团块进而校正WBC计数。
在某些方面，PLT团块的数量可能高于阈值。在这种情况下，样品可以被标记为含有的PLT团块比可以容许的PLT团块多，并且所述方法可以涉及丢弃针对此样品确定的细胞计数。
在某些方面，标识PLT团块的方法可以包含使用3维(3D)线对团块进行分类。例如，代替用线对所选事件进行拟合，可以用3D线对FL信号低于WBC的FL信号的阈值的事件进行拟合。当PLT计数中超过5％是PLT团块时，可以使用3D线拟合。换句话说，当使用线拟合标识的PLT团块的数量高于血液样品中的PLT数量的5％时，使用3D线来拟合阈值低于用于标识WBC的阈值的事件并且通过将3D线延长到与WBC相关联的信号中来重复所述方法；以及将所述线附近的WBC重新分类为血小板团块。将WBC重新分类为PLT团块进而校正WBC计数。
在某些情况下，被分析以标识PLT团块的信号可以是荧光(FL)、中间角度散射(IAS)、偏振侧向散射(PSS)或轴向光损失(ALL)中的一个或多个。在一些方面，被分析以标识PLT团块的信号可以是荧光(FL)和偏振侧向散射(PSS)。
在一些方面，可以用具有细胞渗透性的并且与核酸结合的荧光染料对样品进行染色。使用这种荧光染料确保标记WBC，而不标记正常的RBC和血小板。在一些情况下，还可以裂解样品以去除RBC。
图2展示了涉及标识血液样品中的PLT团块并对其进行分类的示例性过程。作为第一步骤，对数据进行分析以选择具有低荧光(即，低于为如WBC等有核血细胞设定的阈值)的颗粒。这些颗粒被指示为非FL颗粒。PLT团块具有低荧光但其大小与WBC的大小类似。用线对PLT团块进行拟合，并且将线延长到荧光(FL)颗粒中以确定线附近的颗粒数量。如果几乎没有颗粒处于线附近，则将这些颗粒重新分类为PLT团块(而不是WBC)。在线附近存在大量颗粒表明3D线拟合将更准确，并且用3D线对如上定义的具有低荧光的颗粒进行拟合。将经过拟合的3D线延长到FL颗粒中以确定线附近的颗粒数量，并且将这些颗粒重新分类为PLT团块(而不是WBC)。
如本文所使用的，术语“触发器”意指信号的测量结果必须超过以被认为有效的信号最小值。对提供的信号值高于触发值的事件进行分析。数据分析中不包含提供的信号值低于触发值的事件。每个检测通道使用的尺度为0到5000或0到6000。尺度上的每一个值表示信号强度的等级，其中值0是最低强度，并且值5000(或6000)是最高强度。在如本文所描述的用于将PLT与噪声区分的方法中，可以将触发器设置为使得较低信号触发在允许检测更多噪声的同时将确保检测来自PLT的信号的检测器。
在一些方面，可以针对血液分析和本文公开的方法而收集的原始数据可以包含具有至少五个信息维度的事件，即ALL、IAS、PSS、DSS和FL1，以及时间标签和其它相关信息。在一些方面，这些类型的原始数据中只有两种或三种原始数据可以在本文所公开的方法中使用。例如，在用于将PLT与噪声区分的方法中，可以使用对应于PSS和ALL的原始数据。在其它方面，如在用于标识PLT团块的方法中，可以使用FL和PSS以及FL和ALL。
可以从中获取样本的受试者包含但不限于人类受试者、哺乳动物受试者(例如，灵长类动物(猿、大猩猩、类人猿、狒狒、猩猩等))、有蹄类动物(例如，马、牛、骆驼科动物、猪等)、犬科动物、猫科动物、啮齿动物(小鼠、大鼠等)等。样本可以包含可以在评估之前进行处理(例如，稀释、裂解等)的生物流体样品和生物样品(如血液学样品，例如，血液样品)，例如，美国专利第9,011,773号和第9,028,778号中描述的样品；所述美国专利的公开内容通过引用并入本文。
WBC在其细胞核中含有相对高浓度的DNA。当适当设计时，荧光染料可以用于区分不同WBC亚群并且将WBC与非有核细胞区分。例如，尽管淋巴细胞和嗜碱性粒细胞具有类似的光散射特征，但是其荧光特征有所不同。进一步地，成熟的RBC不含有DNA。因此，可以选择荧光染料以区分血细胞群。染料的目的为轻松地渗透到活细胞中、以高亲和力结合DNA并且在用适当的光源激发染料时，发出具有足够斯托克斯位移(Stokes shift)的强荧光。可见波段中染料的峰值吸收可以与光源的波长(在光源波长的50nm内，更优选地在光源波长的25nm内)基本上匹配，以便正确地激发染料并且达到最佳效果。
荧光染料被选择为使得所述荧光染料：1)能够结合核酸；2)能够透过WBC和有核红细胞(nRBC)的细胞膜；3)当经受光源时，可以在所选波长下激发；4)在通过光源激发时发出荧光；并且5)具有生物稳定性并且可溶于液体中。染料可选自由以下组成的组：吖啶橙、SYBR 11、SYBR Green系列染料、碘化乙啶、SYTO 11、SYTO 12、SYTO 13、SYTO 14、SYTO 16、SYTO 21、SYTO RNA Select、SYTO 24、SYTO 25以及其任何等同物。染料用于标记WBC和nRBC，基于血液学分析仪中配置的荧光触发器“筛选出”未裂解的RBC和RBC的碎片以及血小板，并且区分WBC亚群。染料通常以约0.1ng/mL到约0.1mg/mL的浓度存在。虽然可以获得各种染料，但所选择的染料通常与血液学分析仪的激发源配对，使得单个专用染料用于对想要标识、量化和/或分析的nRBC和所有WBC亚群中的荧光发射进行染色和激发。因此，单个(即，专用)染料可以用于同时标识、定量和分析WBC亚群。
在一个实施例中，在试剂中提供荧光染料与1)至少一种表面活性剂；2)至少一种缓冲液；3)至少一种盐；和/或4)至少抗微生物剂的组合，其量足以实现每微升对多达1,000×103个细胞进行染色和活化。所述至少一种表面活性剂(如“TRITON”X-100或皂苷)用于破坏RBC的膜并且减小RBC碎片的大小。所述至少一种表面活性剂通常以约0.001％到约5％的浓度存在。所述至少一种抗微生物剂(如来自“TRIADINE”或“PROCLIN”家族的抗微生物剂)用于防止试剂被微生物污染。所述至少一种抗微生物剂的浓度足以使试剂在所要求的保质期内得以保存。所述至少一种缓冲液(如磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES))用于调节反应混合物的pH以控制RBC的裂解和保存WBC。所述至少一种缓冲液通常以约0.01％到约3％的浓度存在。pH通常为约3到约12。所述至少一种盐(如NaCl或Na2SO4)用于调节同渗重摩以增加裂解效果和/或优化WBC保存。所述至少一种盐可以以约0.01％到约3％的浓度存在。在某些情况下，所述至少一种缓冲液可以充当所述至少一种盐，或者所述至少一种盐可以充当所述至少一种缓冲液。
通常，较低的同渗重摩或低渗透压用于加速RBC的裂解。同渗重摩通常为约20mOsm到约250mOsm。可以在以约一体积份样品:约35体积份试剂的比率将血液样品与试剂混合之后使RBC的裂解在高于室温的温度(例如，介于约30℃到约50℃之间，如约40℃)下在相对短的时间段(例如，小于约25秒、小于约17秒或甚至小于约9秒)内发生。
通常用多个光学通道和至少一个荧光通道收集用于分析的散射数据和荧光数据，如上所述。
在某些方面，可以使用荧光(FL)触发器。在美国专利第9,091,625号中详细描述了FL触发器，所述美国专利通过引用并入本文。
因此，本文呈现的***和方法的各方面使用荧光触发器来收集和分析WBC和WBC亚群。在一个实施例中，在血小板(PLT)团块检测之前，荧光触发器被设置成介于来自RBC的信号与来自WBC(以及nRBC，当存在时)的信号之间。然后，可以使用收集到的光学和荧光信息将WBC和WBC亚群与PLT团块区别(或区分)。例如，可以使用二维细胞直方图(cytogram)来标识和区别颗粒。如本文所述，在一些方面，对于要针对血小板与噪声之间的重叠而进行分析的数据，可以将FL触发器设置为较低。在其它情况下，在用于分析血小板与噪声之间的重叠的方法中，不使用荧光信号，并且因此可以不使用FL触发器。
如本文所用，表述“荧光信息”意指从血液学分析仪的荧光通道收集的数据。如本文所用，表述“荧光通道”意指如光电倍增管等被设置成处于适于测量从样品发射的荧光的量的波段的检测装置。
本文所描述的方法可以涉及用于同时分析如例如血液等液体中的白细胞分类计数、成红血细胞、红细胞和血小板和PLT团块的自动方法。可以使用其它生物流体(如例如，脑脊髓液、腹水、胸膜液、腹膜液、心包液、滑液、透析液和引流液)来确定这些流体的各种参数。
***
本公开包含用于在流式细胞仪中将血小板事件与噪声区分的***。本公开的***涉及被配置成执行用于在流式细胞仪中将血小板事件与噪声区分的方法的组件。
本公开还包含用于以下的***：将样品标识为包括血小板团块；任选地，基于检测到的PLT团块的数量校正WBC计数；和/或如果PLT团块的数量妨碍了准确的细胞分析，则标记样品。
在某些实施例中，所述***可以包含流式细胞仪，所述流式细胞仪包含：流动池；光学颗粒探询***，其光学地耦接到所述流动池；以及如本文进一步描述的非暂时性计算机可读媒体。这种***可以包含被配置成执行如本文所描述的方法的步骤中的一个或多个步骤的电路***。
本发明的***的组件可以组装在单个装置中，或者可以以由彼此分离的组件构成的***的形式组装在两个或更多个装置中。在一些情况下，执行所述功能的装置、***或其组件可以处于处理样品的血液学分析仪的外部但是靠近所述血液学分析仪(即，附接到血液学分析仪的外部壳体或与血液学分析仪处于同一工作表面上或与血液学分析仪处于同一房间或建筑物内等)。在其它情况下，执行所述功能的装置、***或其组件可以定位在处理样本和/或获得数据的血液学分析仪的内部(即，处于血液学分析仪内、处于其内部或容纳在血液学分析仪内)。
如本文所使用的“数据处理单元”是指将执行所需的功能的任何硬件和/或软件组合。例如，本文中的任何数据处理单元可以是如可以以电子控制器、大型机、服务器或个人计算机(台式计算机或便携式计算机)的形式获得的可编程数字微处理器。在数据处理单元可编程的情况下，可以将合适的编程从远程位置传送到数据处理单元，或者可以将合适的编程预先保存在计算机程序产品中(如便携式或固定式计算机可读存储媒体，无论是磁性的、光学的还是基于固态装置的)。
可以将基本上任何电路***被配置成用于执行本文所公开的方法的装置和***内的功能布置。这种电路***的硬件架构(包含例如专门配置的计算机)是本领域技术人员所熟知的，并且可以包括硬件组件，包含一个或多个处理器(CPU)、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、内部或外部数据存储媒体(例如，硬盘驱动器)。这种电路***还可以包括用于处理并向显示器件输出图形信息的一个或多个图形板。上述组件可以通过电路***内(例如，专用计算机内部)的总线适当地互连。电路***可以进一步包括用于与如监视器、键盘、鼠标、网络等通用外部组件通信的适当接口。在一些实施例中，电路***可以能够进行并行处理或可以是被配置成用于进行并行或分布式计算的网络的一部分，以提高本发明的方法和程序的处理能力。在一些实施例中，可以将从存储媒体中读出的程序代码写入到在***电路***中的扩展板或连接到电路***的扩展单元中设置的存储器中，并且在扩展板或扩展单元中设置的CPU等实际上可以根据编程的指令执行部分操作或全部操作，从而实现所描述的功能。
本公开的***还可以进一步包含“存储器”，所述存储器能够存储信息，使得日后可以通过计算机访问和检索所述信息。可以基于用于访问所存储信息的器件选择任何方便的数据存储结构。在某些方面，信息可以存储在“永久性存储器”(即，不会因计算机或处理器的电力供应终止而被擦除的存储器)或“非永久性存储器”中。计算机硬盘驱动器、CD-ROM、软盘、便携式闪存驱动器和DVD全都是永久性存储器的实例。随机存取存储器(RAM)是非永久性存储器的实例。永久性存储器中的文件可以是可编辑且可重写的。
除了本公开的装置和***的组件(例如，如上文所描述的组件)之外，本公开的***可以包含多个另外的组件，如数据输出装置(例如，监视器和/或扬声器)、数据输入装置(例如，接口端口、键盘等)、流体处理组件、滑动处理组件、电源等。
用于检测来自流过血液学分析仪的流动池的样品的信号的血液学分析仪可以包含适于血液学分析(包含流式细胞术)的设备的照明和检测光学装置。
在一个实施例中，通过多角度偏振散射分离(Multiple Angle PolarizedScattering Separation，MAPSS)技术进行血液样品分析，其中通过荧光信息得到任选的增强。使用至少一个光电二极管、或至少一个光电倍增管或至少一个光电二极管和至少一个光电倍增管两者来检测由穿过流动池的每一个血细胞散射的光。使用两个或更多个光电二极管来测量轴向光损失(ALL)信号(其测量为约0°散射(例如，0°-1°))以及中间角度散射(IAS)信号(其测量为低角度(例如，约3°到约15°)散射)。使用两个或更多个光电倍增管来检测90°偏振侧向散射(PSS)信号和90°去偏振侧向散射(DSS)信号。使用另外的光电倍增管进行一个或多个适当波长范围内的荧光(FL1)测量，所述波长范围取决于光源的波长选择。因此，在***上捕获的每一个事件展现多个信息维度，如ALL、IAS(一个或多个通道，如2或3个通道)、PSS、DSS和荧光(一个或多个通道，如2个通道)。来自这些检测通道的信息用于血细胞的进一步分析。在某些方面，适于血液学分析的装置的照明和检测光学装置可以包含美国专利第9,091,625号的图1中描绘的组件，所述专利通过引用整体并入本文。参照美国专利第9,091,625号的图1，设备10包括光源12；用于光束弯曲的前反射镜14和后反射镜16；光束扩展器模块18，其含有第一柱面透镜20和第二柱面透镜22；聚焦透镜24；精细光束调节器26；流动池28；前向散射透镜30；靶心检测器(bulls-eye detector)32；第一光电倍增管34；第二光电倍增管36；和第三光电倍增管38。
光源可以是激光器。在替代性实施例中，选择所发射的光的波长介于约350nm到约700nm之间的激光器；例如，在一个实施例中，使用发射的光的波长为约488nm的激光器。光源12可以是竖直偏振的空气冷却的Coherent Cube激光器，其可从加利福尼亚州圣克拉拉科希伦公司(Coherent，Inc.，Santa Clara，CA)商购获得。可以使用波长范围为350nm到700nm的激光器。激光器的操作条件基本上类似于目前与“CELL-DYN”自动血液学分析仪一起使用的激光器的操作条件。但是，还可以使用其它光源；如例如，灯(例如，汞灯、氙灯)。
与流动池、透镜、聚焦透镜、精细光束调节机构和激光聚焦透镜有关的另外细节可以在通过引用并入本文的美国专利第5,631,165号中，特别是在第41栏第32行到第43栏第11行处找到。美国专利第5,631,165号的图1中所示出的前向光路***包含球面平凸透镜30和位于透镜的后焦平面中的双元件光电二极管检测器32。在此配置中，双元件光电二极管检测器32内的每一个点映射到来自移动穿过流动池28的细胞的特定光收集角。检测器32可以是能够检测轴向光损失(ALL)和中间角度前向散射(IAS)的靶心检测器。美国专利第5,631,165号在第43栏第12-52行处描述了此检测器的各种替代性方案。
第一光电倍增管34(PMT1)测量去偏振侧向散射(DSS)。第二光电倍增管36(PMT2)测量偏振侧向散射(PSS)，并且第三光电倍增管38(PMT3)测量约360nm到约750nm的荧光发射，这取决于所选择的荧光染料和所采用的光源。在一个实施例中，PMT3测量约440nm到约680nm，或更具体地约500nm到约550nm的荧光发射。光电倍增管收集宽范围波长的荧光信号以增加信号强度。通过二向色分束器40和42将侧向散射和荧光发射引导到这些光电倍增管，所述二向色分束器在所需波长下高效地透射和反射以实现高效检测。美国专利第5,631,165号在第43栏第53行到第44栏第4行处描述了与光电倍增管相关的各种另外的细节。
当通过使用浸没收集***测量荧光时，灵敏度在光电倍增管34、36和38处得到增强。浸没收集***是通过折射率匹配层将第一透镜30光学地耦接到流动池28从而实现宽角度的光收集的***。美国专利第5,631,165号在第44栏第5-31行处描述了这种光学***的各种另外的细节。
光电倍增管34、36和38检测侧向散射(在轴线大致垂直于入射激光束的锥形体中散射的光)或荧光(从细胞发射的波长不同于入射激光束的波长的光)。
虽然上面引用了美国专利第5,631,165号的精选部分，但美国专利第5,631,165号通过引用整体并入本文。
计算机可读媒体
本公开包含计算机可读媒体(包含非暂时性计算机可读媒体)，其存储用于在流式细胞仪中将血小板事件与噪声区分的指令。本公开的各方面包含计算机可读媒体，其存储有指令，所述指令当由计算装置执行时使所述计算装置执行用于在流式细胞仪中将血小板事件与噪声区分的步骤中的一个或多个步骤。
在某些方面，非暂时性计算机可读媒体存储有指令，所述指令在由计算装置执行时使所述计算装置：检测来自经过探询的样品的光信号，其中所述光信号通过使样品流过流式细胞仪的流动池并且光学地探询流动样品来生成；将检测到的信号分成对应于红细胞(RBC)事件的信号和对应于小于RBC事件的事件的信号；将所述对应于小于RBC事件的事件的信号分成推定血小板事件和推定噪声；将对应于推定血小板事件和推定噪声的信号转换成对数尺度；使用高斯混合模型拟合经过转换的信号以生成所述推定血小板事件和所述推定噪声的拟合分布；并且当所述拟合分布的位置和宽度处于血小板事件的范围内时，将所述推定血小板事件标识为血小板事件。
在一些情况下，所述指令包括使所述计算装置进行以下的指令：在所述标识之前，将所述推定血小板事件的所述拟合分布的位置和宽度与所述推定噪声的所述拟合分布的位置和宽度进行比较，其中当所述分布处于接受的范围之外时，拟合具有较高噪声约束的高斯混合模型。
在某些方面，所述指令包括用于将所收集的原始数据转换为对数(对数)尺度的指令。转换可以涉及将模拟数据转换为数字数据的步骤。模拟数据到数字数据的转换可以在应用第一阈值之前、在应用第二阈值之前或在应用第二阈值之后执行。在一些情况下，可以在已经应用第一阈值并且已经将小于RBC事件的事件与RBC事件分离之后并且在应用将作为明显噪声信号的信号(例如，对应于大小小于1厘升的颗粒的信号)分离出来的第二阈值之前执行模拟数据到数字数据的转换以产生对数数据。
在某些方面，所述指令包含用于将高斯混合模型应用于经过转换的数据以将推定PLT事件与噪声分离的指令。在某些情况下，所述指令包含用于使用高斯混合模型拟合所述经过转换的信号以生成所述推定血小板事件和所述推定噪声的拟合分布的指令。在某些实施例中，当推定PLT事件的拟合分布的位置和宽度处于PLT事件的范围内时，推定PLT事件被标识为血小板。
在某些情况下，所述指令包含用于以下的指令：在所述标识之前，将所述推定血小板事件的所述拟合分布的位置和宽度与所述推定噪声的所述拟合分布的位置和宽度进行比较，其中当所述分布处于接受的范围之外时，可以以不同的方式拟合经过转换的数据。例如，可以使用具有较高噪声约束的高斯混合模型拟合经过转换的数据，然后标识PLT事件和噪声。
在某些情况下，通过流式细胞仪检测并且通过本发明的方法分析的信号可以包含中间角度散射(IAS)、偏振侧向散射(PSS)或轴向光损失(ALL)中的一个或多个。在其它情况下，通过流式细胞仪检测并且通过本发明的方法分析的信号可以包含中间角度散射(IAS)和偏振侧向散射(PSS)。
在一些情况下，本公开的计算机可读媒体存储有指令，所述指令使计算装置执行用于以下的步骤：将样品标识为包括血小板团块；任选地，基于检测到的PLT团块的数量校正WBC计数；和/或如果PLT团块的数量妨碍了准确的细胞分析，则标记所述样品。
在一些方面，所述非暂时性计算机可读媒体存储有指令，所述指令当由计算装置执行时使所述计算装置检测来自经过探询的样品的光信号，其中所述光信号通过使所述样品流过流式细胞仪的流动池并且光学地探询流动样品来生成，其中所述样品已经与包括细胞渗透性荧光染料和红细胞裂解剂的试剂一起温育，持续足以裂解红细胞并且将含细胞核细胞荧光染色的时间段；标识与低于阈值的荧光信号相关联的事件，其中所标识事件的荧光信号低于来自白细胞(WBC)的荧光信号；并且确定所述所标识事件的大小，其中大小大于血小板的大小的事件的存在表明所述样品包括血小板团块。
在某些实施例中，所述指令包括使所述计算装置进行以下的指令：选择大小大于血小板的大小的所述所标识事件；用线对所选事件进行拟合；将所述线延长到与WBC相关联的信号中；并且将所述线附近的WBC重新分类为血小板团块。
在某些实施例中，可以将根据本文所述的方法的指令以“编程”的形式编码到计算机可读媒体上，其中如本文使用的术语“计算机可读媒体”是指参与向计算机提供指令和/或数据以供执行和/或处理的任何存储媒体或传输媒体。存储媒体的实例包含软盘、硬盘、光盘、磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光光盘、固态磁盘和网络附接存储装置(NAS)，无论这种装置处于计算机内部还是外部。包含信息的文件可以“存储”在计算机可读媒体上，其中“存储”是指记录信息，使得日后可以通过计算机访问和检索所述信息。
本文描述的计算机实施的方法可以使用编程来执行，所述编程可以以任何数量的计算机编程语言中的一种或多种语言来编写。此类语言包含例如Java(加利福尼亚州圣克拉拉太阳计算机***公司(Sun Microsystems,Inc.,Santa Clara,CA))、Visual Basic(华盛顿州雷德蒙德微软公司(Microsoft Corp.,Redmond,WA))和C++(新泽西州贝德明斯特AT&T公司(AT&T Corp.,Bedminster,NJ))以及任何许多其它语言。
以下实例以说明性方式而不是以限制性方式提供。
实例
实例1：用于使用血液学分析仪将血小板与噪声区分的方法
血小板是血液中最小的细胞，并且对血小板的检测通常受分析仪中的噪声的限制。光源(1％激光功率的波动)、放大电子装置或其它源可能引起噪声。此处，收集少量噪声事件和超过噪声的所有血小板的光散射信息。对此数据使用EM(期望最大化)算法来找到最可能的噪声和血小板分布。此算法提高了血小板计数的准确性，因为所述算法可以估计有多少血小板被噪声掩盖。
使用具有以下的血液学分析仪：流动池；前向和侧向散射检测器；以及用于在存在噪声的情况下估计血液样本中的血小板的数量的软件算法。
血液学分析仪在触发器通道中设置有低阈值。阈值被设置为如此之低，以致于在血小板分布的下端可以看到很大的噪声尖峰。首先对数据进行对数变换，并且然后通过EM算法对数据进行分析，所述EM算法将高斯分布与噪声和血小板拟合。算法的输出是数据收集时捕获的总事件的血小板的分数。然后通过使用血容量、稀释度、流速和数据收集时间将血小板事件计数转换为血液中的血小板浓度。
在图3中描绘了根据PSS触发的数据，所述数据以IAS3和PSS的对数变换形式显示。如图3所见，两条平行线消除了第一明显噪声。仅进一步考虑了落在两条平行线之间的事件。
将落在两条平行线之间的事件绘制为直方图，并使用EM算法获得最可能的噪声分布(图左侧的曲线)和血小板分布(图右侧的曲线)(见图4)。
图4示出了在噪声峰内存在血小板。图左侧的曲线与噪声相关，并且图右侧的曲线对应于血小板。EM算法找到拟合观察数据的最可能的噪声和血小板分布。这种情况的最终结果是25.5％的经过过滤的事件是噪声，并且74.5％的经过过滤的事件是血小板。使用这些数字，可以容易地得出总血小板事件计数和血小板的血液浓度。
图5和6展示了用于将血小板浓度低于图3和4中的血小板浓度的样品中的血小板与噪声区分的另一个实例。图5描绘了使用两条平行线来消除最明显的噪声。将落在两条平行线之间的事件绘制为直方图，并使用EM算法获得最可能的噪声分布(图左侧的曲线)和血小板分布(图右侧的曲线)(见图6)。
如图6所示，图左侧的曲线是噪声分布，并且图右侧的曲线是血小板分布。几乎一半的血小板计数隐藏在噪声峰以下。但是，EM算法在此测量中提供了血小板事件的良好估计。这种情况的最终结果是72％的经过过滤的事件是噪声，并且28％的经过过滤的事件是血小板。
因此，使用较低阈值使得能够在标识并滤除噪声之后对低于阈值的血小板进行计数。
实例2：用于使用血液学分析仪对PLT团块进行分类的方法
图7A描绘了从流式细胞仪记录的PSS(X轴)和FL(Y轴)的绘图。将FL信号低于WBC的FL信号的事件选择为PLT团块并且通过+指示。图7B描绘了通过将对图7A中的所标识PLT团块进行拟合的线延长到WBC的信号中来对另外的PLT块进行分类。重新分类为PLT团块的WBC通过+表示。
图8A描绘了从流式细胞仪记录的PSS(X轴)和FL(Y轴)的绘图。将FL信号低于WBC的FL信号的事件选择为PLT团块并且通过+指示。图8B描绘了通过将对所标识PLT团块进行拟合的3D线延长到WBC的信号中来对另外的PLT团块进行分类。重新分类为PLT团块的WBC通过+指示。
尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式较为详细地描述了前述发明，但是本领域的技术人员根据本发明的教导很容易明白的是，在不偏离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。
因此，前述内容仅说明了本发明的原理。应当理解的是，本领域的技术人员将能够设计各种布置，尽管没有在本文中明确地描述或显示，但所述各种布置体现本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。另外，本文中叙述的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和诸位发明人所贡献的概念以推动本领域发展，并且将被解释为而不限于这种特别叙述的实例和条件。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施例以及其特定实例的所有陈述旨在涵盖其结构等效物和功能等效物两者。另外，这种等效物旨在包括当前已知的等效物以及将来开发的等效物两者，即，所开发的执行相同功能的任何要素，而不论结构如何。因此，本发明的范围不旨在受限于本文所示出和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。

Claims (25)

1.一种用于在流式细胞仪中将血小板事件与噪声区分的方法，所述方法包括：
使包括血小板的样品流过所述流式细胞仪的流动池；
光学地探询流过所述流动池的所述样品；
检测来自经过探询的样品的光信号；
将检测到的信号分成对应于红细胞(RBC)事件的信号和对应于小于RBC事件的事件的信号；
将所述对应于小于RBC事件的事件的信号分成推定血小板事件和推定噪声；
将对应于推定血小板事件和推定噪声的信号转换成对数尺度；
使用高斯混合模型拟合经过转换的信号以生成所述推定血小板事件和所述推定噪声的拟合分布；以及
当所述拟合分布的位置和宽度处于血小板事件的范围内时，将所述推定血小板事件标识为血小板事件。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：在所述标识之前，将所述推定血小板事件的所述拟合分布的位置和宽度与所述推定噪声的所述拟合分布的位置和宽度进行比较，其中当所述分布处于接受的范围之外时，拟合具有较高噪声约束的高斯混合模型。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述信号包括中间角度散射(IAS)、偏振侧向散射(PSS)或轴向光损失(ALL)中的一个或多个。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述信号包括中间角度散射(IAS)和偏振侧向散射(PSS)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为全血样品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述样品为未裂解的全血样品。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中光学地探询所述颗粒包括使用激光器激发所述细胞。
8.一种非暂时性计算机可读媒体，其存储有指令，所述指令当由计算装置执行时使所述计算装置：
检测来自经过探询的样品的光信号，其中所述光信号通过使所述样品流过流式细胞仪的流动池并且光学地探询流动样品来生成；
将检测到的信号分成对应于红细胞(RBC)事件的信号和对应于小于RBC事件的事件的信号；
将所述对应于小于RBC事件的事件的信号分成推定血小板事件和推定噪声；
将对应于推定血小板事件和推定噪声的信号转换成对数尺度；
使用高斯混合模型拟合经过转换的信号以生成所述推定血小板事件和所述推定噪声的拟合分布；并且
当所述拟合分布的位置和宽度处于血小板事件的范围内时，将所述推定血小板事件标识为血小板事件。
9.根据权利要求8所述的非暂时性计算机可读媒体，其中所述指令包括使所述计算装置进行以下的指令：
在所述标识之前，将所述推定血小板事件的所述拟合分布的位置和宽度与所述推定噪声的所述拟合分布的位置和宽度进行比较，其中当所述分布处于接受的范围之外时，拟合具有较高噪声约束的高斯混合模型。
10.根据权利要求8到9中任一项所述的非暂时性计算机可读媒体，其中所述信号包括中间角度散射(IAS)、偏振侧向散射(PSS)或轴向光损失(ALL)中的一个或多个。
11.根据权利要求8到10中任一项所述的非暂时性计算机可读媒体，其中所述信号包括中间角度散射(IAS)和偏振侧向散射(PSS)。
12.根据权利要求8到11中任一项所述的非暂时性计算机可读媒体，其中所述样品为全血样品。
13.根据权利要求12所述的非暂时性计算机可读媒体，其中所述样品为未裂解的血液样品。
14.一种流式细胞仪，其包括：
流动池；
光学颗粒探询***，所述光学颗粒探询***光学地耦接到所述流动池；以及
根据权利要求8到13中任一项所述的非暂时性计算机可读媒体。
15.一种将样品标识为包括血小板团块的方法，所述方法包括：
将样品与包括细胞渗透性荧光染料和红细胞裂解剂的试剂一起温育，持续足以裂解红细胞并且将含细胞核细胞荧光染色的时间段；
使所述样品流过流式细胞仪的流动池；
光学地探询流过所述流动池的所述样品；
检测来自经过探询的样品的光信号；
标识与低于阈值的荧光信号相关联的事件，其中所标识事件的荧光信号低于来自白细胞(WBC)的荧光信号；以及
确定所述所标识事件的大小，其中大小大于血小板的大小的事件的存在表明所述样品包括血小板团块。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括
选择大小大于血小板的大小的所述所标识事件；
用线对所选事件进行拟合；
将所述线延长到与WBC相关联的信号中；以及
将所述线附近的WBC重新分类为血小板团块。
17.根据权利要求15或16中任一项所述的方法，其中所述信号包括荧光(FL)、中间角度散射(IAS)、偏振侧向散射(PSS)或轴向光损失(ALL)中的一个或多个。
18.根据权利要求15到17中任一项所述的方法，其中所述信号包括荧光(FL)和偏振侧向散射(PSS)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为全血样品。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中光学地探询所述颗粒包括使用激光器激发所述细胞。
21.一种非暂时性计算机可读媒体，其存储有指令，所述指令当由计算装置执行时使所述计算装置：
检测来自经过探询的样品的光信号，其中所述光信号通过使所述样品流过流式细胞仪的流动池并且光学地探询流动样品来生成，其中所述样品已经与包括细胞渗透性荧光染料和红细胞裂解剂的试剂一起温育，持续足以裂解红细胞并且将含细胞核细胞荧光染色的时间段；
标识与低于阈值的荧光信号相关联的事件，其中所标识事件的荧光信号低于来自白细胞(WBC)的荧光信号；并且
确定所述所标识事件的大小，其中大小大于血小板的大小的事件的存在表明所述样品包括血小板团块。
22.根据权利要求21所述的非暂时性计算机可读媒体，其中所述指令包括使所述计算装置进行以下的指令：
选择大小大于血小板的大小的所述所标识事件；
用线对所选事件进行拟合；
将所述线延长到与WBC相关联的信号中；并且
将所述线附近的WBC重新分类为血小板团块。
23.根据权利要求21或22中任一项所述的非暂时性计算机可读媒体，其中所述信号包括荧光(FL)、中间角度散射(IAS)、偏振侧向散射(PSS)或轴向光损失(ALL)中的一个或多个。
24.根据权利要求21到23中任一项所述的非暂时性计算机可读媒体，其中所述信号包括中间角度散射(IAS)和偏振侧向散射(PSS)。
25.一种流式细胞仪，其包括：
流动池；
光学颗粒探询***，所述光学颗粒探询***光学地耦接到所述流动池；以及
根据权利要求21到24中任一项所述的非暂时性计算机可读媒体。
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