CN110643699B - 一种环孢素a代谢基因检测试剂盒及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种环孢素A代谢基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测ABCB1 3435C>T基因位点突变的SEQ ID No.1‑2所示的引物对和SEQ ID No.3‑4所示的探针对、检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的SEQ ID No.5‑6所示的引物对和SEQ ID No.7‑8所示的探针对。所述试剂盒能对待测者对环孢素A代谢类型进行准确判断的同时，还能结合数据判断环孢素A代谢程度，为临床安全有效用药提供更可靠的参考依据。

Description

一种环孢素A代谢基因检测试剂盒及其应用方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测与环孢素A代谢相关的基因检测试剂盒及其应用方法。
背景技术
药物代谢(Drug metabolism)是指药物在机体内的生物转化过程，药物代谢反应是指药物在生物体内发生的生物转化反应，其产物为代谢产物。研究表明体内药物代谢主要受代谢酶的控制。药物代谢过程中的氧化与结合反应，对药物代谢酶的诱导或抑制，药物代谢的种属、器官组织、性别差异、药物代谢的立体选择性差异以及参与药物代谢的酶的基因多态性等均与药物毒性相关，进而影响临床用药安全。因此，药物代谢研究可以有效阐明临床用药中可能发生的毒副作用，为指导临床合理用药，预防毒副作用发生提供理论支持。
环孢素A(Cyclosporin A，CsA)为11个氨基酸组成的环形多肽，是从土壤霉菌中分离出来的一种强效、选择性的免疫抑制剂。环孢素A广泛用于器官移植及免疫性疾病的治疗，近年来已被用于治疗难治性肾病综合征和其他肾脏疾病。与其他免疫抑制剂相比，环孢素A的特点是选择性的作用于T淋巴细胞，对骨髓中的各系细胞无影响。但是，肾脏毒性是环孢素A治疗中最重要的问题，研究发现，环孢素A可引起肾小球间质及肾血管结构和功能的改变，导致肾间质纤维化、血管透明样变、肾小球硬化等，即使环孢素A血清浓度正常也可发生上述改变。目前临床上常规给药方法是先给不同患者相同剂量的环孢素A，然后通过实时检测患者服药后的血药浓度来调整剂量。虽然临床上使用的方法经过试验可以实现个体化给药，但是往往需要经过一定时间尝试且患者需要接受数次采血，而患者移植初期是最关键的时期，此时不能做到安全有效用药将会对治疗产生很大影响，可能会造成移植失败或肝肾毒性等不良反应。因此，针对不同患者的个体差异进行个体化给药是非常必须的。
P-pg是多药耐药基因(MDR1)编码的产物，研究认为P-gp是影响药物体内吸收和***的重要因素。环孢素A口服进人体内后首先通过被动扩散进人小肠上皮细胞，小肠上皮细胞内表达的P-gp不断将环孢素A外排转运至肠腔，使得环孢素A以原型形式排出的比例增加；同时在吸收细胞与肠腔间形成循环，延缓环孢素A进人血液循环，增加环孢素A与肠道CYP3A酶的接触，使得环孢素A在肠道的代谢明显提高，从而减少药物吸收；此外组织和血脑屏障中的P-gp可影响环孢素A在靶组织内的分布，减低环孢素A的抗排斥效能和毒性反应发生；胆小管和肾小管中的P-gp可影响环孢素A和其他底物的清除。
P-gp是由ABCB1(ATP-binding cassette subfamily B member 1)基因编码的，其cDNA全长4660bp，包含28个外显子，转录可得到4.5kb的mRNA。ABCB1基因的C3435T多态性位点(rs1045642)可通过密码子的改变而影响蛋白质的折叠结构，使其对调节分子或底物的亲和力发生变化，从而对药物的代谢产生影响。
专利文献CN201610654232.8公开了一种预测儿童患者药物性肾毒性的生物标志物及应用，说明书中提到CYP3A5*3、ABCB1 2677G>T、ABCB13435C>T、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C)、TGF-β1codon25(Arg(25)>Pro)基因多态性中的任何一个或多个多态性均可预测儿童患者使用环孢素A发生肾毒性的风险，若同时出现2个或2个以上的多态性预测能力更强；或者CYP3A5*3、ABCB1 2677G>T、ABCB13435C>T、PRKCB rs11074606、CypA-promoter(-11G/C)、TGF-β1 codon 25(Arg(25)>Pro)多态性中多个多态性组成的单倍型也可预测儿童患者使用环孢素A发生肾毒性的风险。
专利文献CN201510137264.6公开了一组基于ARMs-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因多态性的引物及制备的试剂盒。通过引物组合对人类CYP3A4、CYP3A5、MDR1基因的多态性进行分型，用于检测中国人群相关药物代谢能力。
现有技术中对于基因分型的检测多采用测序或PCR-RFLP方法，所述两种方法均需要血液、组织等样本进行检测。本申请利用唾液或口腔上皮细胞作为待检样本，相比血液、组织等样本检测具有无创的特点。另外，本发明以荧光定量PCR平台为基础，检测完成后通过检测荧光变化即可判定结果，脱离常规的凝胶成像的操作要求和仪器限制，检测成本大大降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种环孢素A代谢基因检测试剂盒及所述试剂盒的应用方法。所述试剂盒通过检测ABCB1 3435 C>T基因位点突变分型和ABCB1 1236C>T基因位点突变分型，结合特定算法，确定待测者对环孢素A的代谢类型，指导临床合理有效用药。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种环孢素A代谢基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测ABCB1 3435 C>T基因位点突变的SEQ ID No.1-2所示的引物对和SEQ ID No.3-4所示的探针对、检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的SEQ ID No.5-6所示的引物对和SEQ ID No.7-8所示的探针对。
SEQ ID No.1的序列为：5’-AAGTTGATCTGTGAACTCTTGT-3’
SEQ ID No.2的序列为：5’-CTATAGGCCAGAGAGGCTGCCA-3’
SEQ ID No.3的序列为：5’-AGATCGTGAGGGCAG-3’
SEQ ID No.4的序列为：5’-AGATTGTGAGGGCAG-3’
SEQ ID No.5的序列为：5’-AAGAGTTTCTGATGTTTTCTTG-3’
SEQ ID No.6的序列为：5’-AGCCTCTGCATCAGCTGGACTG-3’
SEQ ID No.7的序列为：5’-AAGGGCCTGAACCTG-3’
SEQ ID No.8的序列为：5’-AAGGGTCTGAACCTG-3’
优选的，每组检测基因突变位点的探针对的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记MGB。本发明对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用荧光基团即可。在本发明的优选实施方式中，所述探针对的5’端分别标记FAM荧光基团和VIC荧光基团。
优选的，所述试剂盒还包括real-time qPCR MasterMix和超纯水。
第二方面，本发明提供一种环孢素A代谢基因检测试剂盒的应用方法，所述方法包括(1)确定待测样品ABCB1 3435 C>T和ABCB1 1236C>T基因位点突变分型；(2)结果分析，所述结果根据公式P＝es/(1+es)计算P值，
其中，S＝6.66+0.32×M1+0.18×M2-0.07×M3，
M1与ABCB1 3435 C>T基因位点突变分型相关，当分型为CT或TT时M1＝1，分型为CC时M1＝2；
M2与ABCB1 1236C>T基因位点突变分型相关，当分型为CT或TT时M2＝1，分型为CC时M2＝2；
M3为年龄。
当P<0.813时，属于环孢素A慢代谢型；
当0.813<P<0.852时，属于环孢素A中间代谢型；
当P>0.852时，属于环孢素A快代谢型。
在本发明中，所述2种基因位点突变的分型如下表所示：
表1 2种基因位点突变的分型表
Figure GDA0002698542760000041
在本发明中，所述待测样品选自唾液或口腔上皮，所述待测样品总的游离DNA提取方法为常规DNA提取方法。
优选的，所述试剂盒的应用方法包括如下步骤：
(1)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.1-2的引物对和SEQ IDNo.3-4的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定ABCB1 3435C>T基因位点突变分型；
(2)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.5-6的引物对和SEQ IDNo.7-8的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型；
(3)根据公式P＝es/(1+es)计算P值，
其中，S＝6.66+0.32×M1+0.18×M2-0.07×M3，M1-3的取值如上所示。
优选的，所述PCR反应液制备方法如下：
向反应体系中加入引物对、探针对和待检测DNA模板，再加入real-time qPCRMasterMix和超纯水，制备成PCR反应液，进行PCR。
在本发明的优选实施例中，所述PCR反应程序如下：95℃、10min预变性；95℃、15s，60℃、1min，40个循环；10℃保存。
第三方面，本发明提供一种基因位点突变在制备检测环孢素A代谢类型的产品中的用途，所述基因位点突变包括ABCB1 3435 C>T基因位点突变和ABCB1 1236C>T基因位点突变。
第四方面，本发明提供一种制备检测环孢素A代谢类型的产品使用的引物对和探针对，包括检测ABCB1 3435 C>T基因位点突变的SEQ ID No.1-2所示的引物对和SEQ IDNo.3-4所示的探针对、检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的SEQ ID No.5-6所示的引物对和SEQ ID No.7-8所示的探针对。
优选的，每组检测基因突变位点的探针对的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记MGB。本发明对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用荧光基团即可。在本发明的优选实施方式中，所述探针对的5’端分别标记FAM荧光基团和VIC荧光基团。
通过本发明所述的环孢素A代谢基因检测试剂盒能将待测者对于环孢素A的代谢类型分为环孢素A慢代谢型、中间代谢型、快代谢型。与现有技术相比，本申请在判定代谢类型的基础上，利用特定算法能进一步判断该待测者对于环孢素A的代谢程度。因此，用本申请所提供的试剂盒检测结果更准确，特异性更好，能为临床安全有效用药提供更可靠的参考数据。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 环孢素A代谢基因检测试剂盒的制备
一种环孢素A代谢基因检测试剂盒，包括：
检测ABCB1 3435 C>T基因位点突变的引物和探针：
上游引物：5’-AAGTTGATCTGTGAACTCTTGT-3’
下游引物：5’-CTATAGGCCAGAGAGGCTGCCA-3’
探针1：5’-AGATCGTGAGGGCAG-3’，5’端标记FAM，3’端连接MGB
探针2：5’-AGATTGTGAGGGCAG-3’，5’端标记VIC，3’端连接MGB
检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的引物和探针：
上游引物：5’-AAGAGTTTCTGATGTTTTCTTG-3’
下游引物：5’-AGCCTCTGCATCAGCTGGACTG-3’
探针1：5’-AAGGGCCTGAACCTG-3’，5’端标记FAM，3’端连接MGB
探针2：5’-AAGGGTCTGAACCTG-3’，5’端标记VIC，3’端连接MGB
另外，所述试剂盒中还包括real-time qPCR MasterMix和超纯水。
具体的，检测ABCB1 3435 C>T基因位点突变的反应体系如下表所示：
表2 ABCB1 3435 C>T基因位点突变检测体系
成分 体积
qPCR MasterMix 10μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
探针1 0.5μL
探针2 0.5μL
超纯水 8μL
共计 20μL
检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的反应体系如下表所示：
表3 ABCB1 1236C>T基因位点突变检测体系
成分 体积
qPCR MasterMix 10μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
探针1 0.5μL
探针2 0.5μL
超纯水 8μL
共计 20μL
实施例2 利用环孢素A代谢基因检测试剂盒进行环孢素A代谢类型检测
(1)采集人体(A，女，37岁)口腔上皮细胞，并提取总游离DNA，使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行总游离DNA的提取，调整DNA浓度为10-40ng/μL；
(2)确定ABCB1 3435 C>T基因位点突变分型：向反应体系中加入上游引物(SEQ IDNo.1)0.5μL、下游引物(SEQ ID No.2)0.5μL、探针1(SEQ ID No.3)0.5μL、探针2(SEQ IDNo.4)0.5μL、real-time qPCR MasterMix10μL和超纯水8μL，再加入步骤(1)制备的DNA模板，制备成PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者ABCB1 3435 C>T基因位点突变为CC分型；
(3)确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型：向反应体系中加入上游引物(SEQ IDNo.5)0.5μL、下游引物(SEQ ID No.6)0.5μL、探针1(SEQ ID No.7)0.5μL、探针2(SEQ IDNo.8)0.5μL、real-time qPCR MasterMix10μL和超纯水8μL，再加入步骤(1)制备的DNA模板，制备成PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者ABCB1 1236C>T基因位点突变为CT分型；
(4)根据公式P＝es/(1+es)，S＝6.66+0.32×M1+0.18×M2-0.07×M3计算P值，其中，M1＝2，M2＝1，M3＝37，计算得到S＝4.89，P＝0.99，因此，待测者属于环孢素A快代谢型。
实施例3 利用环孢素A代谢基因检测试剂盒进行环孢素A代谢类型检测
(1)采集人体(B，女，82岁)口腔上皮细胞，并提取总游离DNA：方法同实施例2；
(2)确定ABCB1 3435 C>T基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者ABCB13435 C>T基因位点突变为CT分型；
(3)确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者ABCB11236C>T基因位点突变为CC分型；
(5)根据公式P＝es/(1+es)，S＝6.66+0.32×M1+0.18×M2-0.07×M3计算P值，其中，M1＝1，M2＝2，m3＝82，计算得到S＝1.6，P＝0.83，因此，待测者属于环孢素A中间代谢型。
实施例4 利用环孢素A代谢基因检测试剂盒进行环孢素A代谢类型检测
(1)采集人体(C，男，84岁)口腔上皮细胞，并提取总游离DNA：方法同实施例2；
(2)确定ABCB1 3435 C>T基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者ABCB13435 C>T基因位点突变为TT分型；
(3)确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者ABCB11236C>T基因位点突变为TT分型；
(5)根据公式P＝es/(1+es)，S＝6.66+0.32×M1+0.18×M2-0.07×M3计算P值，其中，M1＝1，M2＝1，M3＝84，计算得到S＝1.28，P＝0.78，因此，待测者属于环孢素A慢代谢型。
对比实施例1 利用现有技术检测环孢素A代谢类型
(1)对上述3名待测者(A，女，37岁；B，女，82岁；C，男，84岁)使用Streck无创采血管分别静脉采集血液10ml，将血液转移至15ml离心管中，低温4℃2000g离心10min，取上层血浆约4-6ml于新的15ml离心管中，继续低温4℃4000g离心10min；取上层血浆4-6ml于新的15ml离心管中，取4ml血浆，使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行总游离DNA的提取；
(2)采用常规基因测序方法对3组DNA模板进行DNA测序；
(3)分析结果，A属于CC型，B属于CT型，C属于TT型。
效果实施例1 环孢素A代谢基因检测试剂盒与常规方法对比
根据实施例2-4检测的结果，对比常规基因测序的检测方法，我们可以得出如下结果，如下表所示：
表4 本申请检测结果与常规方法结果比对表
Figure GDA0002698542760000101
经过上表总结可以看出，本申请提供的检测试剂盒对于受试者对环孢素A的代谢类型可以细化为慢代谢型、中间代谢型或快代谢型，并且本申请的判断标准为：当P<0.813时，属于环孢素A弱代谢型；当0.813<P<0.852时，是环孢素A中间代谢型；当P>0.852时，是环孢素A快代谢型。而现有的方法对于环孢素A代谢类型只能检测出ABCB1 3435 C>T基因位点突变分型，再根据现有研究结果根据分型判断受试者对环孢素A代谢水平的强或弱。虽然在本发明试验中的三个受试者检测结果与现有技术一致，但是，在后续大样本试验中则明显能体现出本发明的优势。
效果实施例2 环孢素A代谢基因检测试剂盒大样本试验
试验目的：为了验证本发明制备的环孢素A代谢基因检测试剂盒与现有的通过检测ABCB1 3435 C>T基因位点突变分型确定环孢素A代谢类型的方法在检测准确性方面的差异。
试验方法：招募100名受试者参与试验，同时参与试验组、对照组和标准参照组实验，试验组：按照实施例2所述的方法采集受试者口腔上皮细胞，并提取总游离DNA，分别检测ABCB1 3435 C>T基因位点突变分型和ABCB11236C>T基因位点突变分型，根据公式P＝es/(1+es)，S＝6.66+0.32×M1+0.18×M2-0.07×M3计算P值，根据P<0.813属于环孢素A慢代谢型，0.813<P<0.852属于环孢素A中间代谢型，P>0.852属于环孢素A快代谢型的标准对受试者的代谢类型进行分类。对照组：由于已经检测到ABCB13435 C>T基因位点突变分型，CC型为快代谢，CT型为正常代谢，TT型为慢代谢，将受试者再次进行分类。标准参照组：按照药品说明书给受试者服用环孢素A，通过测血药浓度的方式检测受试者临床代谢类型，以此作为参照标准。
试验结果：入组受试者在通过3种方法检测后，其环孢素A代谢类型如下表所示。
表5 大样本试验受试者环孢素A代谢类型
试验组 环孢素A快代谢型 环孢素A中间代谢型 环孢素A慢代谢型
人数 14 80 6
对照组 CC型(快代谢) CT型(正常) TT型(慢代谢)
人数 19 71 10
标准参照组 环孢素A快代谢型 正常 环孢素A慢代谢型
人数 9 87 4
结果显示，以标准参照组中正常代谢类型检出比例为准，标准参照组检出率为87％，试验组检出率为80％，对照组检出率为71％。因此，只检测ABCB13435 C>T基因分型判断代谢类型的准确率只有80％左右，而将ABCB1 3435C>T与ABCB1 1236C>T结合检测并通过算法判断代谢类型，准确率可以达到92％左右。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 成都仕康美生物科技有限公司
<120> 一种环孢素A代谢基因检测试剂盒及其应用方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagttgatct gtgaactctt gt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctataggcca gagaggctgc ca 22
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatcgtgag ggcag 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agattgtgag ggcag 15
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagagtttct gatgttttct tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcctctgca tcagctggac tg 22
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagggcctga acctg 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagggtctga acctg 15

Claims (4)

1.一种环孢素A代谢基因检测试剂盒，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物和探针由检测ABCB1 3435C>T基因位点突变的SEQ ID No.1-2所示的引物对和SEQ ID No.3-4所示的探针对以及检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的SEQ ID No.5-6所示的引物对和SEQ IDNo.7-8所示的探针对组成，
所述试剂盒的应用方法包括如下步骤：
(1)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.1-2的引物对和SEQ ID No.3-4的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定ABCB1 3435C>T基因位点突变分型；
(2)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.5-6的引物对和SEQ ID No.7-8的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型；
(3)根据公式P＝es/(1+es)计算P值，
其中，S＝6.66+0.32×M1+0.18×M2-0.07×M3，
M1与ABCB1 3435C>T基因位点突变分型相关，当分型为CT或TT时M1＝1，分型为CC时M1＝2；
M2与ABCB1 1236C>T基因位点突变分型相关，当分型为CT或TT时M2＝1，分型为CC时M2＝2；
M3为年龄；
当P<0.813时，属于环孢素A慢代谢型；
当0.813<P<0.852时，属于环孢素A中间代谢型；
当P>0.852时，属于环孢素A快代谢型。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测基因突变位点的探针对SEQ IDNo.3-4的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记MGB，检测基因突变位点的探针对SEQ IDNo.7-8的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记MGB。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针对SEQ ID No.3-4的5’端分别标记FAM荧光基团和VIC荧光基团，探针对SEQ ID No.7-8的5’端分别标记FAM荧光基团和VIC荧光基团。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括real-time qPCRMasterMix和超纯水。
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