CN110643698B - 一种他克莫司代谢基因检测试剂盒及其应用方法 - Google Patents

一种他克莫司代谢基因检测试剂盒及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种他克莫司代谢基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测CYP3A5 6986A>G基因位点突变的SEQ ID No.1‑2所示的引物对和SEQ ID No.3‑4所示的探针对、检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的SEQ ID No.5‑6所示的引物对和SEQ ID No.7‑8所示的探针对和检测POR 1508C>T基因位点突变的SEQ ID No.9‑10所示的引物对和SEQ ID No.11‑12所示的探针对。所述试剂盒能对待测者对他克莫司代谢类型进行准确判断的同时，还能结合数据判断他克莫司代谢程度，为临床安全有效用药提供更可靠的参考依据。

Description

一种他克莫司代谢基因检测试剂盒及其应用方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测与他克莫司代谢相关的基因检测试剂盒及其应用方法。
背景技术
药物代谢(Drug metabolism)是指药物在机体内的生物转化过程，药物代谢反应是指药物在生物体内发生的生物转化反应，其产物为代谢产物。研究表明体内药物代谢主要受代谢酶的控制。药物代谢过程中的氧化与结合反应，对药物代谢酶的诱导或抑制，药物代谢的种属、器官组织、性别差异、药物代谢的立体选择性差异以及参与药物代谢的酶的基因多态性等均与药物毒性相关，进而影响临床用药安全。因此，药物代谢研究可以有效阐明临床用药中可能发生的毒副作用，为指导临床合理用药，预防毒副作用发生提供理论支持。
他克莫司是器官移植后预防排斥反应的临床常用药，是免疫抑制剂类药物之一。我国每年大约有150万名患者需要进行器官移植，他克莫司作为一种强有效的免疫抑制剂，其个体差异较大，治疗指数较窄，临床不良反应比较明显，其中最主要的是肾毒性和神经毒性。相同的给药剂量对于不同的患者其血药浓度和体内代谢速率不同。他克莫司强代谢型患者体内血药浓度低，影响治疗效果；而他克莫司弱代谢型患者体内需要浓度过高会出现药物毒性反应。因此，根据患者具体情况制定合理的个体化、安全化治疗方案来降低不良反应的发生具有很大的必要性。
研究表明，CYP3A5是他克莫司代谢的主要酶，其对他克莫司的代谢程度直接影响他克莫司在患者体内的血药浓度，从而影响治疗的效果。研究发现CYP3A5的基因多态性影响CYP3A5酶活性的表达。CYP3A5基因中的一个SNP(单核苷酸多态性)rs776746(CYP3A5*3，6986A>G)会导致CYP3A5基因的mRNA过短地剪切，形成一个“不完整的”CYP3A5蛋白，从而导致CYP3A5酶蛋白活性的降低甚至消失。携带CYP3A5突变型等位基因的患者在临床药物治疗过程中的表现与野生型携带者大相径庭。CYP3A5基因出现突变，则会导致病人体内他克莫司的血药浓度大幅度增高，并出现肾毒性、神经毒性、高血压和胃肠道紊乱等一系列药物毒副作用。据统计，目前在中国人群内发现CYP3A5*3突变型频率高达75％，因此在临床中检测CYP3A5基因分型对实现个体化用药和安全用药具有很好的指导作用。
在此基础上，本发明研究者认为CYP450氧化还原酶(POR)是所有肝微粒体细胞色素P450氧化酶的唯一电子供体，在CYP450介导的药物代谢中发挥着重要作用，其特定基因位点如POR 1508C>T的突变可能通过影响CYP450的活性进而影响他克莫司在患者体内的代谢水平。ABCB1基因在人类7号染色体上，包含28个外显子，编码一个长度为170KDa的跨膜糖蛋白P-gp。研究认为P-gp蛋白是影响药物体内吸收和***的重要因素。因此，ABCB11236C>T基因位点上突变能导致P-gp表达量发生显著变化，进一步影响人体对他克莫司的吸收和代谢。
现有技术对于他克莫司体内代谢类型的研究关注点仅在于检测CYP3A5SNPrs776746分型上，而忽略了其他可能影响他克莫司体内代谢的点。如专利文献CN201310316741.6、公开了一种用于检测CYP3A5基因分型的引物组及试剂盒，所述试剂盒能检测CYP3A5基因分型，指导临床对患者他克莫司给药计划。再如专利文献CN201510784899.5公开了一种CYP3A5基因的检测引物组，所述引物组也是通过检测CYP3A5基因分型来指导临床用药。
另外，现有技术中对于基因分型的检测多采用测序或PCR-RFLP方法，所述两种方法均需要血液、组织等样本进行检测，且检测成本较高，临床中难以推广。本发明以荧光定量PCR平台为基础，检测完成后通过检测荧光变化即可判定结果，脱离常规的凝胶成像的操作要求和仪器限制，检测成本大大降低。
综上所述，本发明提供一种他克莫司代谢相关基因检测试剂盒及其应用方法，以常规的CYP3A5基因分型结合POR基因和ABCB1基因，共同判定待检测生物体对于他克莫司的代谢类型，检测特异性更高。且本发明通过荧光定量PCR平台进行检测，检测时间短，检测成本低。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种他克莫司代谢基因检测试剂盒；本发明的另一个目的是提供一种他克莫司代谢基因检测试剂盒的应用方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种他克莫司代谢基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测CYP3A5 6986A>G基因位点突变的SEQ ID No.1-2所示的引物对和SEQ ID No.3-4所示的探针对、检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的SEQ ID No.5-6所示的引物对和SEQ ID No.7-8所示的探针对和检测POR 1508C>T基因位点突变的SEQ ID No.9-10所示的引物对和SEQ IDNo.11-12所示的探针对。
SEQ ID No.1的序列为：5’-AGTATTTTAAACATATAAAAC-3’
SEQ ID NO.2的序列为：5’-TTCTAGTTCATTAGGGTGTGA-3’
SEQ ID NO.3的序列为：5’-TTCAATATCTCTTCC-3’
SEQ ID NO.4的序列为：5’-TTCAGTATCTCTTCC-3’
SEQ ID NO.5的序列为：5’-ACAGTGATAAATGATTAATCAA-3’
SEQ ID NO.6的序列为：5’-ATGTGACTGCTGATCACCGCAG-3’
SEQ ID NO.7的序列为：5’-AGGGCCTGAACCTGA-3’
SEQ ID NO.8的序列为：5’-AGGGTCTGAACCTGA-3’
SEQ ID NO.9的序列为：5’-AACGGGACTTGGGGCCGGGGCT-3’
SEQ ID NO.10的序列为：5’-GCAGCCAGGCCCGCTCCTGGAT-3’
SEQ ID NO.11的序列为：5’-CCTGCCGGGGAGAAC-3’
SEQ ID NO.12的序列为：5’-CCTGTCGGGGAGAAC-3’
优选的，每组检测基因突变位点的探针对的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记MGB。本发明对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用荧光基团即可。在本发明的优选实施方式中，所述探针对的5’端分别标记FAM荧光基团和VIC荧光基团。
优选的，所述试剂盒还包括real-time qPCR MasterMix和超纯水。
第二方面，本发明提供一种他克莫司代谢基因检测试剂盒的应用方法，所述方法包括(1)确定待测样品CYP3A5 6986A>G、ABCB1 1236C>T和POR1508C>T基因位点突变分型；(2)结果分析，所述结果根据公式P＝es/(1+es)计算P值，
其中，S＝5.38-0.24×M1-0.37×M2-0.19×M3-0.03×M4，
M1与CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型相关，当分型为AA时M1＝1，分型为AG或GG时M1＝2；
M2与ABCB1 1236C>T基因位点突变分型相关，当分型为CT或TT时M2＝1，分型为CC时M2＝2；
M3与POR 1508C>T基因位点突变分型相关，当分型为CC时M3＝1，分型为CT或TT时M3＝2；
M4为年龄。
当P<0.93时，属于他克莫司慢代谢型；
当0.93<P<0.967时，属于他克莫司中间代谢型；
当P>0.967时，属于他克莫司快代谢型。
在本发明中，所述3种基因位点突变的分型如下表所示：
表1 3种基因位点突变的分型表
Figure BDA0002235923700000051
在本发明中，所述待测样品选自唾液或口腔上皮，所述待测样品总的游离DNA提取方法为常规DNA提取方法。
优选的，所述试剂盒的应用方法包括如下步骤：
(1)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.1-2的引物对和SEQ IDNo.3-4的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型；
(2)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.5-6的引物对和SEQ IDNo.7-8的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型；
(3)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.9-10的引物对和SEQ IDNo.11-12的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定POR 1508C>T基因位点突变分型；
(4)根据公式P＝es/(1+es)计算P值，
其中，S＝5.38-0.24×M1-0.37×M2-0.19×M3-0.03×M4，M1-4的取值如上所示。
优选的，所述PCR反应液制备方法如下：
向反应体系中加入引物对、探针对和待检测DNA模板，再加入real-time qPCRMasterMix和超纯水，制备成PCR反应液，进行PCR。
在本发明的优选实施例中，所述PCR反应程序如下：95℃、10min预变性；95℃、15s，60℃、1min，40个循环；10℃保存。
第三方面，本发明提供一种基因位点突变在制备检测他克莫司代谢类型的产品中的用途，所述基因位点突变包括CYP3A5 6986A>G基因位点突变、ABCB1 1236C>T基因位点突变和POR 1508C>T基因位点突变。
第四方面，本发明提供一种制备检测他克莫司代谢类型的产品使用的引物对和探针对，包括检测CYP3A5 6986A>G基因位点突变的SEQ ID No.1-2所示的引物对和SEQ IDNo.3-4所示的探针对、检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的SEQ ID No.5-6所示的引物对和SEQ ID No.7-8所示的探针对和检测POR 1508C>T基因位点突变的SEQ ID No.9-10所示的引物对和SEQ ID No.11-12所示的探针对。
优选的，每组检测基因突变位点的探针对的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记MGB。本发明对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用荧光基团即可。在本发明的优选实施方式中，所述探针对的5’端分别标记FAM荧光基团和VIC荧光基团。
通过本发明所述的他克莫司代谢基因检测试剂盒能将待测者对于他克莫司的代谢类型细分为3种，分别是他克莫司慢代谢型、中间代谢型、快代谢型。传统的仅对CYP3A5基因分型进行检测的方法仅能对他克莫司代谢快慢进行大致的判断，并不能再细致的分类。基于本发明所述的三个基因检测结果并通过算法计算出的结论，比单独测一种基因分型得出的结论更为准确，例如，只测CYP3A5基因分型判断代谢类型，准确率只有60％左右，而检测CYP3A5 6986A>G、ABCB1 1236C>T和POR 1508C>T三种基因分型，并通过算法判断代谢类型，准确率可达到90％以上。因此，用本申请所提供的试剂盒进行检测的方法，检测结果更准确，特异性更好，能为临床安全有效用药提供更可靠的参考数据。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1他克莫司代谢基因检测试剂盒的制备
一种他克莫司代谢基因检测试剂盒，包括：
检测CYP3A5 6986A>G基因位点突变的引物和探针：
上游引物：5’-AGTATTTTAAACATATAAAAC-3’
下游引物：5’-TTCTAGTTCATTAGGGTGTGA-3’
探针1：5’-TTCAATATCTCTTCC-3’，5’端标记FAM，3’端连接MGB
探针2：5’-TTCAGTATCTCTTCC-3’，5’端标记VIC，3’端连接MGB
检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的引物和探针：
上游引物：5’-ACAGTGATAAATGATTAATCAA-3’
下游引物：5’-ATGTGACTGCTGATCACCGCAG-3’
探针1：5’-AGGGCCTGAACCTGA-3’，5’端标记FAM，3’端连接MGB
探针2：5’-AGGGTCTGAACCTGA-3’，5’端标记VIC，3’端连接MGB
检测POR 1508C>T基因位点突变的引物和探针：
上游引物：5’-AACGGGACTTGGGGCCGGGGCT-3’
下游引物：5’-GCAGCCAGGCCCGCTCCTGGAT-3’
探针1：5’-CCTGCCGGGGAGAAC-3’，5’端标记FAM，3’端连接MGB
探针2：5’-CCTGTCGGGGAGAAC-3’，5’端标记VIC，3’端连接MGB，
另外，所述试剂盒中还包括real-time qPCR MasterMix和超纯水。
具体的，检测CYP3A5 6986A>G基因位点突变的反应体系如下表所示：
表2 CYP3A5 6986A>G基因位点突变检测体系
成分 体积
qPCR MasterMix 10μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
探针1 0.5μL
探针2 0.5μL
超纯水 8μL
共计 20μL
检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的反应体系如下表所示：
表3 ABCB1 1236C>T基因位点突变检测体系
成分 体积
qPCR MasterMix 10μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
探针1 0.5μL
探针2 0.5μL
超纯水 8μL
共计 20μL
检测POR 1508C>T基因位点突变的反应体系如下表所示：
表4 POR 1508C>T基因位点突变检测体系
Figure BDA0002235923700000081
Figure BDA0002235923700000091
实施例2利用他克莫司代谢基因检测试剂盒进行他克莫司代谢类型检测
(1)采集人体(A，男，34岁)口腔上皮细胞，并提取总游离DNA，使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行总游离DNA的提取，调整DNA浓度为10-40ng/μL；
(2)确定CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型：向反应体系中加入上游引物(SEQ IDNo.1)0.5μL、下游引物(SEQ ID No.2)0.5μL、探针1(SEQ ID No.3)0.5μL、探针2(SEQ IDNo.4)0.5μL、real-time qPCR MasterMix10μL和超纯水8μL，再加入步骤(1)制备的DNA模板，制备成PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者CYP3A5 6986A>G基因位点突变为AA分型；
(3)确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型：向反应体系中加入上游引物(SEQ IDNo.5)0.5μL、下游引物(SEQ ID No.6)0.5μL、探针1(SEQ ID No.7)0.5μL、探针2(SEQ IDNo.8)0.5μL、real-time qPCR MasterMix10μL和超纯水8μL，再加入步骤(1)制备的DNA模板，制备成PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者ABCB1 1236C>T基因位点突变为CC分型；
(4)确定POR 1508C>T基因位点突变分型：向反应体系中加入上游引物(SEQ IDNo.9)0.5μL、下游引物(SEQ ID No.10)0.5μL、探针1(SEQ ID No.11)0.5μL、探针2(SEQ IDNo.12)0.5μL、real-time qPCR MasterMix 10μL和超纯水8μL，再加入步骤(1)制备的DNA模板，制备成PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者POR 1508C>T基因位点突变为CC分型；
(5)根据公式P＝es/(1+es)，S＝5.38-0.24×M1-0.37×M2-0.19×M3-0.03×M4计算P值，其中，M1＝1，M2＝2，M3＝1，M4＝34，计算得到S＝3.19，P＝0.96，因此，待测者属于他克莫司中间代谢型。
实施例3利用他克莫司代谢基因检测试剂盒进行他克莫司代谢类型检测
(1)采集人体(B，女，86岁)口腔上皮细胞，并提取总游离DNA：方法同实施例2；
(2)确定CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者CYP3A56986A>G基因位点突变为AG分型；
(3)确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者ABCB11236C>T基因位点突变为CC分型；
(4)确定POR 1508C>T基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者POR 1508C>T基因位点突变为CC分型；
(5)根据公式P＝es/(1+es)，S＝5.38-0.24×M1-0.37×M2-0.19×M3-0.03×M4计算P值，其中，M1＝2，M2＝2，M3＝1，M4＝86，计算得到S＝1.39，P＝0.80，因此，待测者属于他克莫司慢代谢型。
实施例4利用他克莫司代谢基因检测试剂盒进行他克莫司代谢类型检测
(1)采集人体(C，男，10岁)口腔上皮细胞，并提取总游离DNA：方法同实施例2；
(2)确定CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者CYP3A56986A>G基因位点突变为AG分型；
(3)确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者ABCB11236C>T基因位点突变为CC分型；
(4)确定POR 1508C>T基因位点突变分型：方法同实施例2，反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中读取结果，待测者POR 1508C>T基因位点突变为TT分型；
(5)根据公式P＝es/(1+es)，S＝5.38-0.24×M1-0.37×M2-0.19×M3-0.03×M4计算P值，其中，M1＝2，M2＝2，M3＝2，M4＝84，计算得到S＝3.48，P＝0.97，因此，待测者属于他克莫司快代谢型。
对比实施例1利用现有技术检测他克莫司代谢类型
(1)对上述3名待测者(A，男，34岁；B，女，86岁；C，男，10岁)使用Streck无创采血管分别静脉采集血液10ml，将血液转移至15ml离心管中，低温4℃2000g离心10min，取上层血浆约4-6ml于新的15ml离心管中，继续低温4℃4000g离心10min；取上层血浆4-6ml于新的15ml离心管中，取4ml血浆，使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行总游离DNA的提取；
(2)采用常规基因测序方法对3组DNA模板进行DNA测序；
(3)分析结果，A属于AA型，B属于AG型，C属于AG型。
效果实施例1他克莫司代谢基因检测试剂盒与常规方法对比
根据实施例2-4检测的结果，对比常规基因测序的检测方法，我们可以得出如下结果，如下表所示：
表5本申请检测结果与常规方法结果比对表
Figure BDA0002235923700000121
经过上表总结可以看出，本申请提供的检测试剂盒对于受试者对他克莫司的代谢类型可以细化为慢代谢型、中间代谢型或快代谢型，本申请的判断标准为：当P<0.93时，属于他克莫司慢代谢型；当0.93<P<0.967时，属于他克莫司中间代谢型；当P>0.967时，属于他克莫司快代谢型。而现有的方法对于他克莫司代谢类型只能检测出CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型，再根据现有研究结果根据分型判断受试者对他克莫司代谢水平的强或弱，通常是GG型突变体因代谢酶的缺失，服用相同剂量的他克莫司时，血药浓度高于AA型和AG型。虽然本试验受试者中没有出现GG型，但是受试者B和C都是AG分型，受试者A属于AA分型，按照常规方法三者他克莫司代谢水平应该相当，但是用本发明提供的方法可以判断出三人的他克莫司代谢水平是有差异的，尤其是A和C受试者，P值相差不大，但通过本发明给出的判断标准将两人分别归属为中间代谢型和快代谢型。由此可以看出，本申请提供的方法检测结果对他克莫司代谢类型的分类更精准。
效果实施例2他克莫司代谢基因检测试剂盒大样本试验
试验目的：为了验证本发明制备的他克莫司代谢基因检测试剂盒与现有的通过检测CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型确定他克莫司代谢类型的方法在检测准确性方面的差异。
试验方法：招募100名受试者参与试验，同时参与试验组、对照组和标准参照组实验，试验组：按照实施例2所述的方法采集受试者口腔上皮细胞，并提取总游离DNA，分别检测CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型、ABCB11236C>T基因位点突变分型和POR 1508C>T基因位点突变分型，根据公式P＝es/(1+es)，S＝5.38-0.24×M1-0.37×M2-0.19×M3-0.03×M4计算P值，根据P<0.93属于他克莫司慢代谢型，0.93<P<0.967属于他克莫司中间代谢型，P>0.967属于他克莫司快代谢型的标准对受试者的代谢类型进行分类。对照组：由于已经检测到CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型，GG型为慢代谢，AG和AA是正常代谢，将受试者再次进行分类。标准参照组：按照药品说明书给受试者服用他克莫司，通过测血药浓度的方式检测受试者临床代谢类型，以此作为参照标准。
试验结果：入组受试者在通过3种方法检测后，其他克莫司代谢类型如下表所示。
表6大样本试验受试者他克莫司代谢类型
试验组 他克莫司快代谢型 他克莫司中间代谢型 他克莫司慢代谢型
人数 7 79 14
对照组 AA型(正常) AG型(正常) GG型(慢代谢)
人数 37 54 9
标准参照组 他克莫司快代谢型 正常 他克莫司慢代谢型
人数 9 76 15
与临床标准参照结果对比可以发现，试验组整体检测结果与标准参照组更接近，对照组误差较大。以慢代谢类型检出率为例，标准参照组慢代谢比例是15％，本发明制备的试剂盒检出率为14％，对照组检出率为9％，则对照组代谢类型的检测准确率只有60％左右，而试验组检测准确率可以达到90％以上，说明将CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型、ABCB1 1236C>T基因位点突变分型和POR 1508C>T基因位点突变分型结合检测并通过算法判断代谢类型的检测方法准确率更高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 成都仕康美生物科技有限公司
<120> 一种他克莫司代谢基因检测试剂盒及其应用方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtattttaa acatataaaa c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttctagttca ttagggtgtg a 21
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcaatatct cttcc 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcagtatct cttcc 15
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acagtgataa atgattaatc aa 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgtgactgc tgatcaccgc ag 22
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agggcctgaa cctga 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agggtctgaa cctga 15
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aacgggactt ggggccgggg ct 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcagccaggc ccgctcctgg at 22
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctgccgggg agaac 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctgtcgggg agaac 15

Claims (7)

1.一种他克莫司代谢基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测CYP3A56986A>G基因位点突变的SEQ ID No.1-2所示的引物对和SEQ ID No.3-4所示的探针对、检测ABCB1 1236C>T基因位点突变的SEQ ID No.5-6所示的引物对和SEQ ID No.7-8所示的探针对和检测POR1508C>T基因位点突变的SEQ ID No.9-10所示的引物对和SEQ ID No.11-12所示的探针对；
所述试剂盒的应用方法包括：(1)确定待测样品CYP3A5 6986A>G、ABCB1 1236C>T和POR1508C>T基因位点突变分型；(2)结果分析，所述结果根据公式P＝es/(1+es)计算P值，
其中，S＝5.38-0.24×M1-0.37×M2-0.19×M3-0.03×M4，
M1与CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型相关，当分型为AA时M1＝1，分型为AG或GG时M1＝2；
M2与ABCB1 1236C>T基因位点突变分型相关，当分型为CT或TT时M2＝1，分型为CC时M2＝2；
M3与POR 1508C>T基因位点突变分型相关，当分型为CC时M3＝1，分型为CT或TT时M3＝2；
M4为年龄。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每组检测基因突变位点的探针对的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记MGB。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针对的5’端分别标记FAM荧光基团和VIC荧光基团。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括real-time qPCRMasterMix和超纯水。
5.一种权利要求1所述的他克莫司代谢基因检测试剂盒的应用方法，所述方法不以疾病诊断为目的，包括：(1)确定待测样品CYP3A5 6986A>G、ABCB1 1236C>T和POR 1508C>T基因位点突变分型；(2)结果分析，所述结果根据公式P＝es/(1+es)计算P值，
其中，S＝5.38-0.24×M1-0.37×M2-0.19×M3-0.03×M4，
M1与CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型相关，当分型为AA时M1＝1，分型为AG或GG时M1＝2；
M2与ABCB1 1236C>T基因位点突变分型相关，当分型为CT或TT时M2＝1，分型为CC时M2＝2；
M3与POR 1508C>T基因位点突变分型相关，当分型为CC时M3＝1，分型为CT或TT时M3＝2；
M4为年龄。
6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述待测样品选自唾液或口腔上皮。
7.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述试剂盒的应用方法包括如下步骤：
(1)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.1-2的引物对和SEQ ID No.3-4的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定CYP3A5 6986A>G基因位点突变分型；
(2)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.5-6的引物对和SEQ ID No.7-8的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定ABCB1 1236C>T基因位点突变分型；
(3)以待测样品的总的游离DNA为模板，加入SEQ ID No.9-10的引物对和SEQ IDNo.11-12的探针对，制备PCR反应液，将制备好的反应液转移至96孔板中，进行PCR反应；反应结束后，将96孔板转移至荧光定量PCR读取仪中，读取结果并确定POR 1508C>T基因位点突变分型；
(4)根据公式P＝es/(1+es)计算P值，
其中，S＝5.38-0.24×M1-0.37×M2-0.19×M3-0.03×M4，M1-4的取值如权利要求5所示。
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CN103361433A (zh) * 2013-07-26 2013-10-23 天津市秀鹏生物技术开发有限公司 用于检测人类细胞色素p450酶系3a5(cyp3a5)基因分型的引物组及试剂盒
CN105602947B (zh) * 2015-11-16 2019-01-11 北京晋祺生物科技有限公司 Cyp3a5基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用
CN108179180A (zh) * 2017-10-25 2018-06-19 广州和康医疗技术有限公司 一种对cyp3a5*3位点进行基因型检测的方法和试剂盒

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