CN107338324B - 用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒 - Google Patents
用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程领域,涉及用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒。所述血清lncRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第一lncRNA、与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第二lncRNA、与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第三lncRNA、与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第四lncRNA、与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第五lncRNA和与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第六lncRNA。血清lncRNA是新颖的生物标志物,能大大提高复发性流产诊断的敏感性和特异性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,更具体地,涉及用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒。
背景技术
复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指临床上连续2次或2次以上的孕20W前或胎儿体重不足500g的妊娠丢失,其发生率约占妊娠结局的1%~3%。RSA的病因极其复杂,目前已明确的病因有染色体异常、生殖解剖结构异常、内分泌失调、生殖***感染、自身免疫和环境因素等,但临床上仍有50%~60%的RSA找不到明确的病因,称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)。有研究表明,胚胎发育异常与URSA密切相关。作为一种病理性妊娠,URSA对孕妇的生理及心理均产生不良影响,其病因和发病机制一直是国内外生殖领域研究的热点。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)通常是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本。近年来,lncRNA在表观遗传、转录以及转录后等多个层面上调控基因的表达,使其成为生命科学研究的一大焦点。人类基因组研究计划的成果表明,在人类基因组序列中仅有1.5%的核酸序列用于蛋白质编码,而在占据人类基因组98.5%的非蛋白编码序列中,绝大多数被转录成所谓的“长链非编码RNA”。尽管lncRNA在序列上缺乏整体同源性,然而在其分子内部,却含有若干较为保守的局部区段,这些区域可能会和一些特异的蛋白因子发生相互作用,这些现象都提示了lncRNA具有重要的生物学功能。
研究发现,lncRNA的表达或功能异常与人类的疾病的发生密切相关,可以通过基因印记、细胞周期调控、剪接调控、翻译调控、染色质重塑和mRNA降解等机制发挥作用。胚胎发育是有机体从其生命起始到成熟的复杂进程,受一系列环境因素、遗传因素和表观遗传修饰的调控。大量研究表明,lncRNA作为关键性的转录元件在胚胎发育和疾病发生过程中发挥重要的作用,可能是决定胚胎发育中基因时空表达的最早期分子之一,并且可能参与调控生长发育相关的基因。有研究报道,在生殖细胞的发育过程中,lncRNA通过调控特定基因的开启或关闭,在复杂的表观遗传过程中发挥了关键作用。在胚胎干细胞方面,Samir等发现lncRNA及其靶基因可调控胚胎心脏发育,证实了lncRNA在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中也发挥一定作用。
研究发现血清中存在着上百种的lncRNA,性质相对稳定、表达量丰富,特异性较高,且易于定量检测。据报道,在肺癌、结肠癌等疾病中已经证实血浆lnRNA的表达谱对早期诊断有一定的提示作用,可作为这些疾病的潜在生物标志物。因此,我们有理由相信,血清lncRNA作为一类长链非编码RNA,其差异表达谱同样也可以作为复发性流产早期诊断的生物标志物。
目前,临床上关于将lncRNA应用于复发性流产辅助诊断的还未经报道,若能筛选出复发性流产相关的lncRNA作为早期诊断的生物标志物,并研制相应的诊断试剂盒,对复发性流产的诊断现状必将是一次有力的推动,也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了一条新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物、引物组及应用和试剂盒。所述试剂盒具有测定lncRNA标志物在血清中表达量的特异度和灵敏度。
本发明人通过分离和检测复发性流产病例和非医学原因选择流产对照血清中的lnRNAs,发现了血清中存在可用于评估复发性流产发生风险的特异性和敏感性的lncRNA组合,从而提出了复发性流产患者的血清lncRNA标志物组合,以及所述血清lncRNA标志物或其引物在制备复发性流产辅助诊断试剂中的应用,研制出便于临床应用的复发性流产诊断试剂盒。
具体地,本发明的第一方面提供一组用于诊断不明原因复发性流产的血清lncRNA标志物,所述血清lncRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第一lncRNA、与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第二lncRNA、与SEQID NO:3所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第三lncRNA、与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第四lncRNA、与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第五lncRNA和与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第六lncRNA。
优选地,所述血清lncRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第一lncRNA、与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第二lncRNA、与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第三lncRNA、与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第四lncRNA、与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第五lncRNA和与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第六lncRNA。
进一步优选地,所述血清lncRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有96%、97%、98%、99%以上同源性的第一lncRNA、与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有96%、97%、98%、99%以上同源性的第二lncRNA、与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有96%、97%、98%、99%以上同源性的第三lncRNA、与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有96%、97%、98%、99%以上同源性的第四lncRNA、与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列具有96%、97%、98%、99%以上同源性的第五lncRNA和与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有96%、97%、98%、99%以上同源性的第六lncRNA。
最优选地,所述血清lncRNA标志物包括:具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第一lncRNA(lnc-CHAC1-1)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第二lncRNA(lnc-FMN1-1)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的第三lncRNA(lnc-TAX1BP1-4)、具有如SEQ IDNO:4所示核苷酸序列的第四lncRNA(lnc-C2CD4A-3)、具有如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的第五lncRNA(lnc-CES1-1)和具有如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的第六lncRNA(lnc-ATF3-3)。
本发明的第二方面提供用于检测上述的血清lncRNA标志物的引物组,所述引物组包括:
用于检测第一lncRNA的上游引物和下游引物;
用于检测第二lncRNA的上游引物和下游引物;
用于检测第三lncRNA的上游引物和下游引物;
用于检测第四lncRNA的上游引物和下游引物;
用于检测第五lncRNA的上游引物和下游引物;
用于检测第六lncRNA的上游引物和下游引物。
本领域技术人员可根据常规手段设计上述引物,优选地,
用于检测第一lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列;
用于检测第二lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列;
用于检测第三lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:12所示核苷酸序列;
用于检测第四lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:13所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:14所示核苷酸序列;
用于检测第五lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:15所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:16所示核苷酸序列;
用于检测第六lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:17所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:18所示核苷酸序列。
本发明的第三方面提供上述的血清lncRNA标志物和/或引物组在制备不明原因复发性流产诊断或监测试剂中的应用。
本发明的第四方面提供一种不明原因复发性流产诊断或监测试剂盒,该试剂盒包括上述的引物组。
所述试剂盒还可以包括内参,以及相关PCR技术常用的其他试剂。优选地,所述试剂盒还包括:
(1)检测GAPDH的正反向引物;和/或
(2)DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、水和核酸染料中的至少一种。
本发明的优越性在于:
(1)血清lncRNA是新颖的生物标志物,不仅稳定、微创、易于检测,而且定量精确,能大大提高复发性流产诊断的敏感性和特异性。该类小分子非编码RNA生物标志物的成功开发,颠覆了以蛋白为主的传统生物标志物的检测方法,为复发性流产的防治开创全新局面,同时为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明提供的血清lncRNA标志物可用于复发性流产辅助诊断标志物,通过微创方式对复发性流产进行早期辅助诊断,从而为临床医生进一步深入检查提供依据,达到快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度的效果。同时,为下一步及时采取更具个性化的防治方案提供支持,延缓和阻止疾病进展。
(3)本发明采用符合复发性流产病例和非医学原因选择流产对照人群的样本进行验证,证明所述几种lncRNA标志物表达量存在显著性差异并具有一定的稳定性,以说明该标志物具有特异性,可作为复发性流产生物标志物应用。
(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系。第一阶段,通过预实验高通量测序筛选多种蜕膜组织差异lncRNAs。第二阶段,应用qRT-PCR等方法对研究人群血清样本进行验证和独立人群验证,采用分层评分***对诊断结果进行标化。第三阶段,在另一组独立人群中对血清lncRNA标志物和诊断试剂盒进行盲法评价,保证了该血清lncRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。
图 1为Real-time PCR检测lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3在复发性流产蜕膜组织样本中的表达示意图;
图2为Real-time PCR检测lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3在复发性流产血清样本中的表达示意图;
图3为个体血清lncRNA表达水平波动性分析;纵轴均为血清lncRNA表达量;
图4为正常对照组和复发性流产病例组之间的ROC曲线。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式,然而应该理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为本领域常规方法,一般按照试剂商所建议的条件与步骤进行。
实施例1:蜕膜组织lncRNA筛选
1材料
1.1研究对象选择和样本采集
(1)根据诊断标准:连续2次或2次以上的孕20周前或胎儿体重不足500g的妊娠丢失的孕妇为病例组;根据年龄、妊娠周数、BMI等指标,以频数匹配法选择生育能力正常、非医学原因选择流产的孕妇(无流产征兆及体征,无流产史,且至少有一个正常小孩出生)为对照组。
(2)B超显示无胚芽或无胎心搏动,且需排除因单基因遗传病、多基因遗传病、染色体异常以及基因突变等因素引发的流产。
(3)研究对象分组:
A组:非医学原因选择流产孕妇对照组(n=63,3人测序筛选,30人一期验证,30人独立人群验证);
B组:不明原因复发性流产孕妇(n=63,3人测序筛选,30人一期验证,30人独立人群验证)。
(4)经知情同意,样本采集纳入此次研究孕妇的血清和蜕膜组织。
注:BMI(即身体质量指数,Body Mass Index,简称BMI),是体重公斤数与身高米数平方的比值,是目前国际上常用的衡量人体胖瘦程度以及是否健康的一项标准。
1.2试剂
TRIzolTM Reagent购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒(DRR036A)购自日本Takara公司。荧光实时(Real-time)定量PCT所用SYBR试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司。所有引物由上海英骏(Invitrogen)生物有限公司设计并合成。转录组测序和数据分析工作由上海天昊生物科技有限公司完成。
2方法
选取3例不明原因复发性流产病例和3例非医学原因选择流产对照样本蜕膜组织,采用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台完成转录本RNA测序(双向配对末端测序)。依据RNA提取试剂(Reagent)说明书的步骤提取蜕膜组织总RNA。所提取的RNA样本经过严格质控后,采用去除rRNA,富集剩余mRNA,long noncoding RNA方法构建测序文库。对测序得到的原始数据(Fastq格式)进行接头过滤和污染序列过滤,滤除质量低和长度小于35bp的读长(read)。进而运用FastQC软件对测序数据的质量进行整体评估,包括碱基的质量值分布、读长质量、GC含量、PCR重复含量等。进行质控后,利用TopHat软件将读长数据比对(mapping)到参考基因组(hg19版本),去除无法mapping到基因组上的片段及重复片段,最终得到每个转录本的FPKM值。为了保证分析结果的准确性,选用两种方法(Cuffdiff和DESeq)做lncRNA差异表达分析,取二者交集作为最终结果。差异lncRNA筛选标准为:FoldChange>2或Fold Change<0.5,FDR<0.05。再将筛选出的差异基因进行基于KEGG及GO数据库的基因通路注释,得到基因参与的所有通路信号,采用基于超几何分布(hypergeometricdistribution)的Fisher检验计算每个通路的显著性水平,多重比较校正后筛选出差异基因所体现的显著性通路信号(FDR<0.05)。
3结果
通过Cuffdiff和DESeq两种方法对差异lncRNAs进行筛选,取两者的交集为最终结果。结合生物信息学分析,筛选出6条与复发性流产相关的候选lncRNA并进行下一步验证,具体为:lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3。
实施例2:检测lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3在蜕膜组织中表达水平
1材料
1.1研究对象选择和样本采集
本实施例的研究对象选择和样本采集同实施例1。
1.2试剂
qPCR所用试剂同实施例1。
2方法
2.1提取总RNA
以63例正常对照组和63例复发性流产病例组的蜕膜组织为对象。
(1)取50-100mg蜕膜组织于液氮中磨碎,加入1mL TRIzol,用匀浆超声仪进行匀浆处理,室温(15~30℃)放置放置5min,使核酸蛋白酶完全分离。(2)每使用1mL TRIzol加入200μl氯仿,剧烈震荡30s,冰上放置15-30min。(3)4℃,12000rpm离心15min,样品分为3层:底层为红色有机相,上层为无色水相和一个中间层,RNA主要在水相中。(4)将水相转移至新的去RNA酶的1.5mL EP管中,用与水相等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA,室温放置10min后,-20℃沉淀过夜。(5)4℃,12000rpm离心15min,弃上清。(6)用1mL新鲜的75℅乙醇洗涤RNA沉淀,4℃不超过7500g离心10min,弃上清,重复两次。(7)室温干燥RNA沉淀至透明或半透明,加入200μlDEPC水,4℃放置2-3小时,使RNA充分溶解,用Nanodrop2000测定浓度。(8)提取的RNA置于-70℃保存。
2.2逆转录合成cDNA
取经前处理的蜕膜组织RNA,通过PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect RealTime)(TaKaRa RR036A)试剂盒,逆转录反应得到cDNA样品。逆转录反应时间设置:37℃孵育15分钟,85℃孵育5秒钟,即可获得cDNA。该cDNA可用于后续lncRNAs Real-time PCR检测。
按下表所示配制反转录体系:
2.3引物设计
所有引物由上海英骏(Invitrogen)生物有限公司设计并合成。具体引物序列如下表所示:
2.4实时定量PCR
检测样品中lncRNAs表达水平使用如下体系:
按下列条件进行qPCR反应:预变性(1循环):95℃30s;循环反应(40循环):95℃10s+60℃30s;溶解曲线(1循环):95℃15s+60℃1min+95℃15s。检测并比较正常对照组和复发性流产病例组蜕膜组织中lncRNA表达量的变化。分析引物的特异性及扩增效率,根据溶解曲线判断引物的反应的特异性。依据扩增曲线获得ct值,采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析,可用方程2–△ct计算lncRNA相对表达量(△ct=ctlncRNA–ctGAPDH)。
3结果
根据结果分析得出,lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3这6条lncRNA在两组之间均有显著差别(如图1所示)。提示上述lncRNAs可能参与调控复发性流产的发生过程,具有应用于复发性流产辅助诊疗的潜在可能。
实施例3:检测lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3在血清中表达水平
1材料
1.1研究对象选择和样本采集
本实施例的研究对象选择和样本采集同实施例1。
1.2试剂
qPCR所用试剂同实施例1。
2方法
2.1提取总RNA
以63例正常对照组和63例复发性流产病例组的血清样品为对象。
(1)取5ml新鲜肝素抗凝血于离心机3000rpm离心5min,取上清分装至洁净1.5mlEP管中,每管100μl。(2)向EP管中加入900μl TRIzol,充分震荡混匀后,4℃,12000rpm离心15min,立即取上清转移至洁净1.5ml EP管中。(3)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇,充分混匀后转移至离心柱,10000rpm 4℃离心15秒,弃下层废液。(4)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液(Qiagen miRNeasy Mini Kit,货号217004),10000rpm 4℃离心15秒,弃下层废液。(5)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液(Qiagen miRNeasy Mini Kit,货号217004),10000rpm 4℃离心15秒,弃下层废液。此步骤重复一遍。(6)往离心柱加入一个新的2ml的管子,10000rpm 4℃离心1分钟,目的用于去除RPE缓冲液。(7)将离心柱安装于一新的1.5ml的离心管中,同时在柱子上加入50μl DEPC处理的水,离心1分钟。(8)-70℃保存处理后的样本。
2.2逆转录合成cDNA
取经前处理的血清RNA,通过PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect RealTime)(TaKaRa RR036A)试剂盒,逆转录反应得到cDNA样品。逆转录反应时间设置:37℃孵育15分钟,85℃孵育5秒钟,即可获得cDNA。该cDNA可用于后续lncRNAs Real-time PCR检测。
按下表所示配制反转录体系:
2.3引物设计
所有引物由上海英骏(Invitrogen)生物有限公司设计并合成。具体引物序列如表5所示:
表5
2.4实时定量PCR
检测样品中lncRNAs表达水平使用如下体系:
按下列条件进行qPCR反应:预变性(1循环):95℃30s;循环反应(40循环):95℃10s+60℃30s;溶解曲线(1循环):95℃15s+60℃1min+95℃15s。检测并比较正常对照组和复发性流产病例组血清中lncRNA表达量的变化。分析引物的特异性及扩增效率,根据溶解曲线判断引物的反应的特异性。依据扩增曲线获得ct值,采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析,可用方程2–△ct计算lncRNA相对表达量(△ct=ctlncRNA–ctGAPDH)。
3结果
根据结果分析得出,lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3这6条lncRNA在两组之间均有显著差别(如图2所示),并且与蜕膜组织中表达趋势水平一致,进一步验证了上述lncRNAs应用于复发性流产辅助诊疗的可能性。
实施例4:个体血清lncRNA表达量的稳定性分析
1材料
1.1研究对象选择和样本采集
本实施例的研究对象选择和样本采集同实施例1。从中选取6名(3名对照组和3名复发性流产病例组)成人,连续三次采集研究对象血清(间隔时间为1周,间隔期内无疾病)作为样本。
1.2试剂
qPCR所用试剂同实施例1。
2方法
采用实施例3的方法对6名(3名对照组和3名复发性流产病例组)成人血清lncRNA水平的稳定性进行评价。
3结果
血清中lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3这6条lncRNA表达水平较稳定(如图3所示)。这些都提示了上述个体血清lncRNA的表达量较为稳定,具备作为诊断标志物的特性。
实施例5:lncRNA组合对复发性流产的判断
根据上述qRT-PCR方法,本发明人通过对病例和对照组血清样品的lncRNAs表达水平的分析,以正常对照组lncRNAs表达量的五分位数为阈值,对lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3进行评分,进一步求得总得分,以此绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性,进而评估这6条lncRNAs表达水平对复发性流产的评估能力。ROC分析结果显示,lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3以73.7%的AUC(ROC曲线下面积)将正常对照组和复发性流产病例组分开(如图4所示),最佳临界点的敏感度=0.796,特异度=0.621。
上述一系列研究结果证明了采用lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3能够很好地将复发性流产病例和正常对照组分开,从而证明了血清中lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3是辅助诊断复发性流产的有效、稳定的生物标志物。
实施例6:用于复发性流产监测和风险评估的lncRNA诊断试剂盒的制作
本发明人提出的该lncRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于上述qRT-PCR技术。首先通过RNA测序的方法筛选出对照组和复发性流产病例组具有差异的lncRNA,并用qRT-PCR方法验证两组中差异的候选lncRNA。结合生物信息学,最后筛选出对应的血清lncRNA的数量控制在6条,以此作为复发性流产监测和风险评估的指标,这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。
此试剂盒包括一批血清lncRNA引物,其中lncRNA的引物主要包括lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-CES1-1、lnc-ATF3-3和GAPDH的正反向引物。同时,还包括PCR技术常用的相关试剂,如DEPC水、PCR缓冲液、ROX染料等试剂,这些试剂均可采用相应的市售产品。本发明试剂盒的价值在于只需要一次提供少量血液(2ml),即可检测血清lncRNA生物标志物的变化趋势,再通过该变化趋势来预测复发性流产发生的可能性,并易于进行动态监测。
以上已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (1)
1.用于检测血清lncRNA标志物的引物组在制备不明原因复发性流产诊断或监测试剂中的应用,其特征在于,所述引物组由以下引物组成:
用于检测第一lncRNA的上游引物和下游引物;所述第一lncRNA为lnc-CHAC1-1;
用于检测第二lncRNA的上游引物和下游引物;所述第二lncRNA为lnc-FMN1-1;
用于检测第三lncRNA的上游引物和下游引物;所述第三lncRNA为lnc-TAX1BP1-4;
用于检测第四lncRNA的上游引物和下游引物;所述第四lncRNA为lnc-C2CD4A-3;
用于检测第五lncRNA的上游引物和下游引物;所述第五lncRNA为lnc-CES1-1;
用于检测第六lncRNA的上游引物和下游引物;所述第六lncRNA为lnc-ATF3-3;
用于检测第一lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列,下游引物具有SEQID NO:8所示核苷酸序列;
用于检测第二lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列,下游引物具有SEQID NO:10所示核苷酸序列;
用于检测第三lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:12所示核苷酸序列;
用于检测第四lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:13所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:14所示核苷酸序列;
用于检测第五lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:15所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:16所示核苷酸序列;
用于检测第六lncRNA的上游引物具有SEQ ID NO:17所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:18所示核苷酸序列;
采用lncRNA组合对复发性流产的判断的方法包括:通过检测所述引物组扩增片段的表达水平,扩增曲线获得ct值,采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析,从而检测所述引物组扩增片段的表达水平,与正常对照组相比,其中,lnc-CHAC1-1、lnc-FMN1-1、lnc-TAX1BP1-4、lnc-C2CD4A-3、lnc-ATF3-3在复发性流产的受试者血清中表达量上调,lnc-CES1-1在复发性流产的受试者血清中表达量下调。
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Non-Patent Citations (2)
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Differential expression profile of long noncoding RNAs in human chorionic villi of early recurrent miscarriage;Leilei Wang et al.;《Clinica Chimica Acta》;20170131;第464卷;摘要,第18页左栏第3段-右栏第3段,第20页右栏第2段,表2 * |
Polymorphisms in lncRNA HOTAIR and susceptibility to breast cancer in a Chinese population;RuiYan et al.;《Cancer Epidemiology》;20151231;第39卷(第6期);第978-985页 * |
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