CN113063862A - 一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测鱼腥草中4种马兜铃酸类物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简单快捷的同时检测鱼腥草中4种马兜铃酸类物质（马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII）的超高效液相色谱‑质谱分析方法，属于分析化学技术领域。鱼腥草是一种传统的“食药两用”物质，作为草药，有着清热解毒，消痈排脓，利尿通淋的功效；作为菜肴，它已经成为大众餐桌上的“大路野菜”。然而，鱼腥草中有着马兜铃酸类物质，其含量水平如何，是否会存在风险，也引起社会的普遍关注。本发明提供了一种可简单、快速、灵敏地检测鱼腥草中4种马兜铃酸类物质的分析新方法，仪器检出限为0.0001 mg/L~0.01 mg/L，对鱼腥草安全评估及质量监控有重要意义。

Description

一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测鱼腥草中4种马兜 铃酸类物质的方法

技术领域

本发明涉及一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测鱼腥草中四种马兜铃酸类物质（马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII）的方法，属于分析技术领域。

背景技术

鱼腥草是一种传统的“食药两用”物质。一方面鱼腥草有着清热解毒，消痈排脓，利尿通淋，肺痈吐脓，痰热喘咳，热痢，痈肿疮毒的功效，同时还有显著的杀菌和抗病毒的作用，在我国爆发的一些流行性疾病中，鱼腥草作为杀菌或抗病毒的药物，发挥了重要作用。另一方面，在我国各地，野生或者家种的鱼腥草已经成为大众餐桌上的“大路野菜”。

自1993年起在全世界发生的一系列“马兜铃酸事件”，将马兜铃酸类物质推至舆论的风口浪尖，马兜铃酸类物质引起的生命安全问题迅速成为了大家关注的焦点。2002年，世界卫生组织将马兜铃酸列为I类致癌物。由于鱼腥草中含有马兜铃酸类物质，因此建立鱼腥草中马兜铃酸类物质快速、简便、灵敏的分析技术对鱼腥草安全评估及质量监控有重要意义。

目前，在2020年版《中国药典》中尚未规定鱼腥草中的马兜铃酸类物质的测定方法，文献中关于马兜铃酸类物质的测定方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法、毛细管电泳法和液相色谱紫外检测法，液相色谱质谱法，但关于鱼腥草中的马兜铃酸类物质的测定的报道很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简便、灵敏的超高效液相色谱-质谱方法以同时检测鱼腥草中4种马兜铃酸类物质（马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII）。

本发明的技术方案：一种基于超高效液相色谱-质谱法实现鱼腥草中4种马兜铃酸类物质（马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII）同时检测的分析方法。鱼腥草中4种马兜铃酸类物质（马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII）用甲醇超声提取，将提取液用水稀释至甲醇含量为80%，采用HC-C18材料净化后，上清液经过氮吹浓缩，采用超高效液相色谱-质谱测定。

本发明主要包括以下几个步骤：超高效液相色谱-质谱条件；马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII的同时检测；样品的前处理；样品的检测。

一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测鱼腥草中四种马兜铃酸类物质（马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII）的分析方法，其特征在于：主要包括以下几个步骤：

（1）超高效液相色谱-质谱条件

本发明中所使用的仪器是UPLC超高效液相色谱（日本岛津公司）- Triple TOF^TM5600⁺四极杆飞行时间质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）。色谱条件：色谱柱：Shim-packGIST C18柱（2.1 mm×75 mm×2.0 μm）；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。流动相：A相为水（含0.1%甲酸），B相为乙腈（含0.1 %甲酸）。梯度洗脱程序：0 min，40 %B；7 min，50 %B；7.1~9 min，90 %B；9.1 min，40 %B；保持3min。流速：0.3 mL/min。质谱条件：离子源，ESI源；负离子模式；气帘气（CUR gas）35 psi；雾化气（GAS 1）50 psi；辅助气（GAS 2）50 psi；离子源温度550 ℃；一级质谱：扫描范围，50-350 Da；数据采集时间100 ms；去簇电压（DP）80 V；碰撞能（CE）10 V；二级质谱：扫描范围：200-350 Da。

（2）马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII的检测

配制一系列质量浓度的4种马兜铃酸类物质混合标准溶液，在上述色谱-质谱条件下进行分析，以各组分峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，得到线性方程。马兜铃酸I（0.04-2 mg/L）、马兜铃酸II（0.04-2 mg/L）、马兜铃内酰胺I（0.04-2 mg/L）和马兜铃内酰胺AII（0.004-2 mg/L）线性关系良好（R²>0.9987）。四种目标分析物的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别在0.0001~0.01 mg/L和0.0003~0.03 mg/L范围内。

（3）样品的前处理

将干鱼腥草样品粉碎并全部过80目筛，称取0.2 g（精确至0.001 g）至50 mL刻度离心管中，加入15.0 mL 甲醇，涡旋2 min混匀，超声提取20 min，以3000 rpm离心5 min，取上层清液，加水稀释使甲醇含量为80 %。取2.0 mL上述提取液，加入280 mg HC-C18吸附材料，涡旋振荡吸附20 min，13800 rpm离心10 min，上清液用氮气吹干，用200 μL甲醇溶解残渣，过0.22 μm滤膜，即得上机溶液。

（4）样品的检测

称取0.2 g（精确至0.001 g）鱼腥草样品，分别添加高、中、低三个不同浓度水平的马兜铃酸类物质混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行UPLC-Q/TOF-MS分析，计算样品加标回收率。

本发明的有益效果：本发明设计了一种同时检测鱼腥草中4种马兜铃酸类物质的超高效液相色谱-质谱方法，可简便、快速、灵敏地检测鱼腥草中的四种马兜铃酸类物质，为今后的生产、监管提供了方便，可满足国内对其生产、监管的需要。

附图说明

图1为马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII提取离子色谱图；1：马兜铃内酰胺AII （0.008 mg/L）；2：马兜铃内酰胺I （1 mg/L）；3：马兜铃酸II （5mg/L）；4：马兜铃酸I（5 mg/L）。

具体实施方式

实施例1：

采用UPLC超高效液相色谱（日本岛津公司）- Triple TOF^TM 5600⁺四极杆飞行时间质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）。色谱条件：色谱柱：Shim-pack GIST C18柱（2.1 mm×75mm×2.0 μm）；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。流动相：A相为水（含0.1 %甲酸），B相为乙腈（含0.1 %甲酸）；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min。质谱条件：离子源：ESI源；负离子模式；气帘气（CUR gas）35 psi；雾化气（GAS 1）50 psi；辅助气（GAS 2）50 psi；离子源温度550 ℃；一级质谱：扫描范围，50-350 Da；数据采集时间100 ms；去簇电压（DP）80 V；碰撞能（CE）10 V。二级质谱：扫描范围：200-350 Da；采集方式：选择离子扫描模式。4种目标化合物的质谱检测参数：母离子、子离子、喷雾电压（ISVF）、去簇电压（DP）和碰撞能（CE）如表2所示。

实施例2：

配制一系列质量浓度的4种马兜铃酸类物质混合标准溶液，在上述色谱-质谱条件下进行分析，以峰面积（y）对分析物浓度（x）进行线性回归，线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表3。

实施例3：

样品前处理：使用Ohanus电子天平称取鱼腥草细粉0.2 g（精确至0.001 g）至50mL聚丙烯离心管中，加入15.0 mL 甲醇，将混合物用MS3涡旋混匀器以3000 rpm剧烈涡旋2min，再超声提取20min，用TDL-5C低速台式大容量离心机以3000 rpm离心5 min。取上层清液，加水稀释至甲醇含量为80 %，取2.0 mL上述提取液于5 mL离心管中，加入280 mg HC-C18材料，涡旋振荡吸附20 min，将混合物用TG20.5高速离心机以13800 rpm离心10 min。上清液用氮气吹干，用200 μL甲醇溶解残渣，过0.22 μm滤膜，即得上机溶液。

实施例4：

称取0.2 g（精确至0.001 g）鱼腥草粉末样品，分别添加三个不同浓度水平的马兜铃酸类物质混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行UPLC-Q/TOF-MS分析，计算样品加标回收率和精密度，结果见表4。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和发明构思，作出相应改变和替代，而且性能或用途相同，都应当视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测鱼腥草中4种马兜铃酸类物质（马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII）的分析方法，其特征在于：主要包括以下几个步骤：

（1）超高效液相色谱-质谱条件；

（2）马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII的同时检测；

（3）样品的前处理；

（4）样品的检测。

2.一种基于超高效液相色谱-质谱法同时检测鱼腥草中4种马兜铃酸类物质（马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII）的分析方法，其特征在于：主要包括以下几个步骤：

（1）超高效液相色谱-质谱条件

本发明中所使用的仪器是UPLC超高效液相色谱（日本岛津公司）- Triple TOF^TM 5600⁺四极杆飞行时间质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）；色谱条件：色谱柱：Shim-pack GIST C18柱（2.1 mm×75 mm×2.0 μm）；柱温：35 ℃；进样量：5 μL；流动相：A相为水（含0.1 %甲酸），B相为乙腈（含0.1 %甲酸）；梯度洗脱程序：0 min，40 %B；7 min，50 %B；7.1~9 min，90 %B；9.1 min，40 %B；保持3min；流速：0.3 mL/min；质谱条件：离子源，ESI源；负离子模式；气帘气（CUR gas）35 psi；雾化气（GAS 1）50 psi；辅助气（GAS 2）50 psi；离子源温度550 ℃；一级质谱：扫描范围，50-350 Da；数据采集时间100 ms；去簇电压（DP）80 V；碰撞能（CE）10 V；二级质谱：扫描范围：200-350 Da；

（2）马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺AII的同时检测

配制一系列质量浓度的4种马兜铃酸类物质混合标准溶液，在上述色谱-质谱条件下进行分析，以各组分峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，得到线性方程；马兜铃酸I（0.04-2 mg/L）、马兜铃酸II（0.04-2 mg/L）、马兜铃内酰胺I（0.04-2 mg/L）和马兜铃内酰胺AII（0.004-2 mg/L）线性关系良好（R²>0.9987）4种目标分析物的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别在0.0001~0.01 mg/L和0.0003~0.03 mg/L范围内；

（3）样品的前处理

将干鱼腥草样品粉碎并全部过80目筛，称取0.2 g（精确至0.001 g）至50 mL刻度离心管中，加入15.0 mL 甲醇，涡旋2 min混匀，超声提取20 min，以3000 rpm离心5 min，取上层清液，加水稀释使甲醇含量为80 %；取2.0 mL上述提取液，加入280 mg HC-C18吸附材料，涡旋振荡吸附20 min，13800 rpm离心10 min，上清液用氮气吹干，用200 μL甲醇溶解残渣，过0.22 μm滤膜，即得上机溶液;

（4）样品的检测

称取0.2 g（精确至0.001 g）鱼腥草样品，分别添加高、中、低三个不同浓度水平的马兜铃酸类物质混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行UPLC-Q/TOF-MS分析，计算样品加标回收率。

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