CN110632041B - 一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，通过石蒜碱对羟自由基的荧光响应，以及石蒜碱的荧光强度与加入的羟自由基量的关系，能够对微摩尔级的羟自由基进行精确定量。具体包括以下步骤：首先确定石蒜碱的激发与发射波长，然后对石蒜碱进行不同离子，不同浓度过氧化氢和不同浓度羟自由基的荧光响应检测，得出1.176μM的石蒜碱对过氧化氢与硫酸亚铁产生的羟自由基有响应，可以作为羟自由基的荧光探针，其对过氧化氢没有荧光响应，不能够作为过氧化氢的荧光探针及石蒜碱的荧光强度与所加的羟自由基浓度存在着二次函数关系，说明石蒜碱可以作为羟自由基的荧光探针，检测很灵敏，可以对微摩尔级的羟自由基进行精确地定量。

Description

一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，尤其是涉及一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法。
背景技术
目前，用于检测细胞活性氧的方法主要有电子自旋共振法、高效液相色谱法、紫外分光光度计法以及荧光法。荧光探针检测法是荧光方法中的一种，主要是借助具有特异性受体结合的探针来进行检测，具有特异性受体结合的探针与目标物质进行识别，使得探针分子结构发生改变，进一步改变探针荧光的性质，从而获得目标分子的信息，再借助荧光成像技术使目标物质分子成为可检测的荧光信号，从而在生物体内或者环境中达到可视化检测。荧光探针检测技术灵敏度高，高活性、应用便利，并且荧光探针可以进入细胞与细胞内的活性氧结合，因而主要应用于医学等方面。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，通过石蒜碱对羟自由基的荧光响应，以及石蒜碱的荧光强度与加入的羟自由基量的关系，能够对微摩尔级的羟自由基进行精确定量。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)确定石蒜碱的激发与发射波长：使用荧光分光光度计进行检测，在四面光比色皿中加入3200μL浓度为0.6623μM的石蒜碱溶液，开始设置参数先选定一个激发波长为360nm(初始设定，后续再精确选择激发波长)，扫描波长范围设为380-640nm(扫描初始波长应比激发波长长10-20nm,扫描结束波长应小于激发波长2倍以避免仪器的倍频峰)，发现石蒜碱最大激发波长为248nm，最大发射波长为410nm，
(2)对石蒜碱进行不同离子荧光响应的检测：将所确定的激发波长248nm设置为固定值，扫描范围为258nm-478nm开始扫描，所得的曲线为石蒜碱原溶液的荧光曲线，然后依次在含有1.176μM的石蒜碱溶液中依次加入20μL浓度为10mM的氯化钙、氯化钾、硫酸镁、次氯酸钠、过氧化氢、硫酸亚铁溶液，并进行扫描，得出不同离子对石蒜碱溶液的荧光响应图，保存数据，
(3)不同浓度过氧化氢对石蒜碱的荧光响应检测：在四面光比色皿中加入3400μL浓度为1.176μM的石蒜碱溶液，设置激发波长为248nm，扫描范围为258nm-478nm进行扫描，得到石蒜碱原溶液曲线，之后在比色皿中依次加入20μL的10μM、200μM、500μM、50mM、80mM、100mM、500mM的过氧化氢溶液，并进行扫描，得到不同浓度对石蒜碱溶液的荧光响应图，将扫描得到的数据保存，
(4)不同浓度的羟自由基对石蒜碱的荧光响应检测：羟自由基由3％过氧化氢与硫酸亚铁反应产生，先对石蒜碱原溶液进行扫描，在四面光比色皿中加入3400μL浓度为1.176μM的石蒜碱溶液，设置激发波长为248nm，扫描范围为258nm-478nm，得到石蒜碱原溶液荧光曲线，先加入20μL10mM的过氧化氢，开始扫描，扫描结束后等待2-5分钟再次扫描，直至荧光曲线稳定不再变化(减少过氧化氢造成的误差)，删除加入的过氧化氢曲线；然后加入20μL2.5mM硫酸亚铁溶液，开始扫描，此时得到的曲线是5s后0.1162mM羟基自由基对石蒜碱溶液的荧光响应图，等待5分钟后再次扫描，记录保存所出现的曲线图；继续加入20μL10mM的过氧化氢进行扫描，观察曲线直至不再变化再删除；再加入20μL10mM硫酸亚铁溶液，进行扫描得到5s和5min的0.1449mM羟基自由基对石蒜碱溶液的荧光响应图，直至加入的羟基自由基的浓度为0.3954mM时不再继续加，记录保存所得5s和5min的曲线图以及数据以便后期进行数据分析。
在步骤(2)中，为了验证不同的离子对石蒜碱的荧光响应，将20μL浓度为5.8μM的KCl、MgSO4，5.7μM的CaCl2、NaClO、H2O2分别加入到含有1.176μM的石蒜碱中，以248nm为EX(激发波长)，EM(发射波长)为414nm，由荧光光谱变化图得出在最大发射波长414nm处的荧光强度没有变化，当加入20μM浓度为5.6μM的FeSO4后荧光强度有所下降，是因为加入的过氧化氢与硫酸亚铁反应产生了羟自由基，继续加入20μL浓度为5.7μM的过氧化氢时荧光强度没有变化，当再加入20μL浓度为5.6μM的FeSO4时荧光强度又开始下降，是因为石蒜碱对过氧化氢与硫酸亚铁产生的羟自由基有荧光响应。
在步骤(3)中，为了验证石蒜碱对过氧化氢的荧光响应，将20μL不同浓度的过氧化氢依次加入到含有1.176μM的石蒜碱中，以248nm为EX(激发波长)，EM(发射波长)为414nm，观察到随着加入过氧化氢浓度的不同，石蒜碱的荧光强度与没有加过氧化氢的荧光强度相比有所下降，但是变化很微小。
在步骤(4)中，由5分钟后荧光光谱变化图得出，在浓度为1.176μM的石蒜碱中，以248nm为EX(激发波长)，EM(发射波长)为411nm，在没有加入羟自由基前，最大发射峰出现在414nm处，而当加入的羟自由基浓度为0.1162mM时，在EM为364nm开始出现了新峰，新的发射峰荧光强度为100nm，随着加入的羟自由基浓度不断增加，石蒜碱的荧光强度也在不断地增强，当加入的羟自由基量达到0.3954mM时，在364nm最大发射峰的荧光强度增强了8倍，石蒜碱荧光强度的增强与所加入的羟自由基浓度密切相关，且在浓度0.1449mM-0.3683mM之间有二次函数关系。
由于采用上述技术方案，(1)本发明在含有1.176μM的石蒜碱中加入20μL浓度为5.8μM的KCl、MgSO4，5.7μM的CaCl2、NaClO、H2O2时荧光强度没有变化，当加入了20μL 5.6μM的FeSO4时在最大发射峰414nm处荧光强度有所下降，而继续加入20μL5.7μMH2O2时荧光强度也没有变化，直到加入20μL 5.6μM FeSO4后荧光强度又开始下降，由此可以得出1.176μM的石蒜碱对过氧化氢与硫酸亚铁产生的羟自由基有响应，可以作为羟自由基的荧光探针。(2)本发明在含有1.176μM的石蒜碱溶液中加入20μL的过氧化氢后，随着所加过氧化氢浓度的增加，石蒜碱溶液的荧光强度并没有很大的变化，其对过氧化氢没有荧光响应，不能够作为过氧化氢的荧光探针。(3)本发明在含有1.176μM石蒜碱溶液中加入0.1162mM的羟自由基后，石蒜碱最大发射峰414nm处的荧光强度开始下降，且在发射峰为364nm处有新峰出现，当加入的羟自由基浓度为0.3954mM时最大发射峰出现在364nm，石蒜碱的荧光强度增强了8倍。石蒜碱在加入很低浓度的羟自由基(0.1162mM)时就可以产生荧光响应，而且石蒜碱的荧光强度与所加的羟自由基浓度存在着二次函数关系，这些都说明，石蒜碱可以作为羟自由基的荧光探针，而且检测很灵敏，甚至可以对微摩尔级的羟自由基进行精确地定量。
本发明的石蒜碱对羟自由基有很好的荧光响应，且石蒜碱的荧光强度与加入的羟自由基量有着密切的关系，能够对微摩尔级的羟自由基进行精确定量。
附图说明
下面通过参考附图并结合实例具体地描述本发明，本发明的优点和实现方式将会更加明显，其中附图所示内容仅用于对本发明的解释说明，而不构成对本发明的任何意义上的限制，在附图中：
图1为石蒜碱结构图
图2为本发明石蒜碱(1.176μM)中加入不同离子(5.8μM～56.49μM)后荧光光谱变化图，其中a表示1.176μM的石蒜碱；b表示5.8μM氯化钾；c表示5.8μM硫酸镁；d表示5.7μM氯化钙；e表示5.7μM次氯酸钠；f表示5.7μM过氧化氢；g表示5.6μM硫酸亚铁；h表示56.49μM过氧化氢；r表示56.49μM硫酸亚铁
图3为本发明石蒜碱(1.176μM)中加入不同浓度的过氧化氢(0～500mM)后的荧光光谱变化图，其中None表示1.176μM的石蒜碱溶液；10μM、200μM、500μM、50mM、80mM、100mM、500mM分别表示加入的不同浓度的过氧化氢。
图4为本发明石蒜碱(1.176μM)中加入不同浓度的羟基自由基(0～0.3954mM)5分钟后荧光光谱变化图，其中None表示1.176μM的石蒜碱溶液；0.1162mM、0.1449mM、0.2017mM、0.2579mM、0.2857mM、0.3409mM、0.3954mM分别表示加入的不同浓度的羟基自由基。
图5为本发明在石蒜碱(1.176μM)中加入不同离子后的荧光强度变化柱形图，其中T0表示在石蒜碱中未加入·OH、KCl、MgSO4、CaCl2、NaClO、H2O2、FeSO4时在EX为248nm，EM为364nm处的荧光强度；T1表示在石蒜碱中加入0.3683mM(·OH)、58μM(KCl、MgSO4)、57μM(CaCl2、NaClO、H2O2)、56μM(FeSO4)时在发射波长为364nm处荧光强度。
图6为本发明在石蒜碱(1.176μM)中加入不同浓度的羟自由基5分钟后在发射波长为364nm处的二次函数关系图。
具体实施方式
如图1至图6所示，本发明一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，包括以下步骤：
(1)确定石蒜碱的激发与发射波长：使用荧光分光光度计进行检测，在四面光比色皿中加入3200μL浓度为0.6623μM的石蒜碱溶液，开始设置参数先选定一个激发波长为360nm(初始设定，后续再精确选择激发波长)，扫描波长范围设为380-640nm(扫描初始波长应比激发波长长10-20nm,扫描结束波长应小于激发波长2倍以避免仪器的倍频峰)，发现石蒜碱最大激发波长为248nm，最大发射波长为410nm，
(2)对石蒜碱进行不同离子荧光响应的检测：将所确定的激发波长248nm设置为固定值，扫描范围为258nm-478nm开始扫描，所得的曲线为石蒜碱原溶液的荧光曲线，然后依次在含有1.176μM的石蒜碱溶液中依次加入20μL浓度为10mM的氯化钙、氯化钾、硫酸镁、次氯酸钠、过氧化氢、硫酸亚铁溶液，并进行扫描，得出不同离子对石蒜碱溶液的荧光响应图，保存数据，
(3)不同浓度过氧化氢对石蒜碱的荧光响应检测：在四面光比色皿中加入3400μL浓度为1.176μM的石蒜碱溶液，设置激发波长为248nm，扫描范围为258nm-478nm进行扫描，得到石蒜碱原溶液曲线，之后在比色皿中依次加入20μL的10μM、200μM、500μM、50mM、80mM、100mM、500mM的过氧化氢溶液，并进行扫描，得到不同浓度对石蒜碱溶液的荧光响应图，将扫描得到的数据保存，
(4)不同浓度的羟自由基对石蒜碱的荧光响应检测：羟自由基由3％过氧化氢与硫酸亚铁反应产生，先对石蒜碱原溶液进行扫描，在四面光比色皿中加入3400μL浓度为1.176μM的石蒜碱溶液，设置激发波长为248nm，扫描范围为258nm-478nm，得到石蒜碱原溶液荧光曲线，先加入20μL10mM的过氧化氢，开始扫描，扫描结束后等待2-5分钟再次扫描，直至荧光曲线稳定不再变化(减少过氧化氢造成的误差)，删除加入的过氧化氢曲线；然后加入20μL2.5mM硫酸亚铁溶液，开始扫描，此时得到的曲线是5s后0.1162mM羟基自由基对石蒜碱溶液的荧光响应图，等待5分钟后再次扫描，记录保存所出现的曲线图；继续加入20μL10mM的过氧化氢进行扫描，观察曲线直至不再变化再删除；再加入20μL10mM硫酸亚铁溶液，进行扫描得到5s和5min的0.1449mM羟基自由基对石蒜碱溶液的荧光响应图，直至加入的羟基自由基的浓度为0.3954mM时不再继续加，记录保存所得5s和5min的曲线图以及数据以便后期进行数据分析。
石蒜碱对不同离子的荧光检测，如图2所示，为了验证不同的离子对石蒜碱的荧光响应，将20μL浓度为5.8μM的KCl、MgSO4，5.7μM的CaCl2、NaClO、H2O2分别加入到含有1.176μM的石蒜碱中，以248nm为EX，EM为414nm，由图2可以看出在最大发射波长414nm处的荧光强度没有变化。当加入20μM浓度为5.6μM的FeSO4后荧光强度有所下降，是因为加入的过氧化氢与硫酸亚铁反应产生了羟自由基，继续加入20μL浓度为5.7μM的过氧化氢时荧光强度没有变化，当再加入20μL浓度为5.6μM的FeSO4时荧光强度又开始下降，是因为石蒜碱对过氧化氢与硫酸亚铁产生的羟自由基有荧光响应。
由图2可以看出，在含有1.176μM的石蒜碱中加入20μL浓度为5.8μM的KCl、MgSO4，5.7μM的CaCl2、NaClO、H2O2时荧光强度没有变化，当加入了20μL 5.6μM的FeSO4时在最大发射峰414nm处荧光强度有所下降，而继续加入20μL5.7μMH2O2时荧光强度也没有变化，直到加入20μL 5.6μM FeSO4后荧光强度又开始下降，由此可以得出1.176μM的石蒜碱对过氧化氢与硫酸亚铁产生的羟自由基有响应，可以作为羟自由基的荧光探针。
不同浓度的过氧化氢对石蒜碱的荧光响应，如图3所示，为了验证石蒜碱对过氧化氢的荧光响应，将20μL不同浓度的过氧化氢依次加入到含有1.176μM的石蒜碱中，以248nm为EX，EM为414nm，观察到随着加入不氧化氢浓度的不同，石蒜碱的荧光强度与没有加过氧化氢的荧光强度相比有所下降，但是变化很微小。
由图3可以看出，在含有1.176μM的石蒜碱溶液中加入20μL的过氧化氢后，随着所加过氧化氢浓度的增加，石蒜碱溶液的荧光强度并没有很大的变化，其对过氧化氢没有荧光响应，不能够作为过氧化氢的荧光探针。
石蒜碱对不同浓度的羟自由基的荧光响应，如图4至图6所示。
如图4所示，在石蒜碱(1.176μM)中，以248nm为EX，EM为411nm，在没有加入羟自由基前，最大发射峰出现在414nm处，而当加入的羟自由基浓度为0.1162mM时，在EM为364nm开始出现了新峰，新的发射峰荧光强度为100nm。
如图5所示，随着加入的羟自由基浓度不断增加，石蒜碱的荧光强度也在不断地增强，当加入的羟自由基量达到0.3954mM时，在364nm最大发射峰的荧光强度增强了8倍。
如图6所示，石蒜碱荧光强度的增强与所加入的羟自由基浓度密切相关，且在浓度0.1449mM-0.3683mM之间有二次函数关系。
含有1.176μM石蒜碱溶液中加入0.1162mM的羟自由基后，石蒜碱最大发射峰414nm处的荧光强度开始下降，且在发射峰为364nm处有新峰出现，当加入的羟自由基浓度为0.3954mM时最大发射峰出现在364nm，石蒜碱的荧光强度增强了8倍。石蒜碱在加入很低浓度的羟自由基(0.1162mM)时就可以产生荧光响应，而且石蒜碱的荧光强度与所加的羟自由基浓度存在着二次函数关系，这些都说明，石蒜碱可以作为羟自由基的荧光探针，而且检测很灵敏，甚至可以对微摩尔级的羟自由基进行精确地定量。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (4)

1.一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)确定石蒜碱的激发与发射波长：使用荧光分光光度计进行检测，在四面光比色皿中加入3200μL浓度为0.6623μM的石蒜碱溶液，开始设置参数先选定一个激发波长为360nm，扫描波长范围设为380-640nm，发现石蒜碱最大激发波长为248nm，最大发射波长为410nm，
(2)对石蒜碱进行不同离子荧光响应的检测：将所确定的激发波长248nm设置为固定值，扫描范围为258nm-478nm开始扫描，所得的曲线为石蒜碱原溶液的荧光曲线，然后在含有1.176μM石蒜碱的溶液中依次加入20μL浓度为10mM的氯化钙、氯化钾、硫酸镁、次氯酸钠、过氧化氢、硫酸亚铁溶液，并进行扫描，得出不同离子对石蒜碱溶液的荧光响应图，保存数据，
(3)不同浓度过氧化氢对石蒜碱的荧光响应检测：在四面光比色皿中加入3400μL浓度为1.176μM石蒜碱的溶液，设置激发波长为248nm，扫描范围为258nm-478nm进行扫描，得到石蒜碱原溶液曲线，之后在比色皿中依次加入20μL的10μM、200μM、500μM、50mM、80mM、100mM、500mM的过氧化氢溶液，并进行扫描，得到不同浓度对石蒜碱溶液的荧光响应图，将扫描得到的数据保存，
(4)不同浓度的羟自由基对石蒜碱的荧光响应检测：羟自由基由3％过氧化氢与硫酸亚铁反应产生，先对石蒜碱原溶液进行扫描，在四面光比色皿中加入3400μL浓度为1.176μM石蒜碱的溶液，设置激发波长为248nm，扫描范围为258nm-478nm，得到石蒜碱原溶液荧光曲线，先加入20μL10mM的过氧化氢，开始扫描，扫描结束后等待2-5分钟再次扫描，直至荧光曲线稳定不再变化，删除加入的过氧化氢曲线；然后加入20μL2.5mM硫酸亚铁溶液，开始扫描，此时得到的曲线是5s后0.1162mM羟基自由基对石蒜碱溶液的荧光响应图，等待5分钟后再次扫描，记录保存所出现的曲线图；继续加入20μL10mM的过氧化氢进行扫描，观察曲线直至不再变化再删除；再加入20μL10mM硫酸亚铁溶液，进行扫描得到5s和5min的0.1449mM羟基自由基对石蒜碱溶液的荧光响应图，直至加入的羟基自由基的浓度为0.3954mM时不再继续加，记录保存所得5s和5min的曲线图以及数据以便后期进行数据分析。
2.根据权利要求1所述的石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，其特征在于：在步骤(2)中，为了验证不同的离子对石蒜碱的荧光响应，将20μL浓度为5.8μM的KCl、MgSO4，5.7μM的CaCl2、NaClO、H2O2依次加入到含有1.176μM石蒜碱的溶液中，以248nm为最大激发波长，最大发射波长为414nm，由荧光光谱变化图得出在最大发射波长414nm处的荧光强度没有变化，当加入20μM浓度为5.6μM的FeSO4后荧光强度有所下降，继续加入20μL浓度为5.7μM的过氧化氢时荧光强度没有变化，当再加入20μL浓度为5.6μM的FeSO4时荧光强度又开始下降，是因为石蒜碱对过氧化氢与硫酸亚铁产生的羟自由基有荧光响应。
3.根据权利要求1所述的石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，其特征在于：在步骤(3)中，为了验证石蒜碱对过氧化氢的荧光响应，将20μL不同浓度的过氧化氢依次加入到含有1.176μM石蒜碱的溶液中，以248nm为最大激发波长，最大发射波长为414nm，观察到随着加入过氧化氢浓度的不同，石蒜碱的荧光强度与没有加过氧化氢的荧光强度相比有所下降，但是变化很微小。
4.根据权利要求1所述的石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，由5分钟后荧光光谱变化图得出，在浓度为1.176μM石蒜碱的溶液中，以248nm为最大激发波长，最大发射波长为414nm，在没有加入羟自由基前，最大发射峰出现在414nm处，而当加入的羟自由基浓度为0.1162mM时，在最大发射波长为364nm开始出现了新峰，新的发射峰荧光强度为100a.u.，随着加入的羟自由基浓度不断增加，石蒜碱的荧光强度也在不断地增强，当加入的羟自由基量达到0.3954mM时，在364nm最大发射峰的荧光强度增强了8倍，石蒜碱荧光强度的增强与所加入的羟自由基浓度密切相关，且在浓度0.1449mM-0.3683mM之间有二次函数关系。
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