CN105001858B - 一种检测碱性环境中过氧化氢的荧光探针及其制备方法与生物应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型检测碱性环境中过氧化氢的荧光探针及其制备方法，属于分子探针技术领域。该探针结构式如下：；本发明的过氧化氢荧光探针制备方法简单。该探针以荧光增强、颜色发生明显改变的方式检测过氧化氢，在水体系、有机溶剂体系或生物体中能够高选择性识别过氧化氢，该探针本身的荧光比较微弱、加入到水或有机溶剂后所得溶液为紫色，当与过氧化氢作用后，溶液的荧光显著增强、颜色变成绿色，对过氧化氢检测的选择性高，检测灵敏高，而且现象明显，便于识别。

Description

一种检测碱性环境中过氧化氢的荧光探针及其制备方法与生 物应用

技术领域

本发明涉及一种新型检测碱性环境中过氧化氢的荧光探针及其制备方法与生物应用，该荧光探针能够在碱性环境中高效识别过氧化氢，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

过氧化氢化学式H₂O₂，相对分子质量34.01，是一种弱酸性无色透明液体。它是一种强氧化剂，具有氧化性、漂白性。过氧化氢作为一种重要的无机化工原料和精细化工产品，在工业、食品及医疗卫生领域有重要应用价值。首先，过氧化氢作为重要的氧化剂，可以在催化剂等条件的作用下产生羟基自由基等物质，从而迅速彻底的降解废水中的有机质，因此在废水处理方面有重要应用。其次，过氧化氢具有很强漂白功能，常用作漂白剂应用于在造纸工业、纺织工业中。过氧化氢水溶液俗称双氧水，为无色透明液体。其水溶液具有杀菌消毒功能，能够用于医用伤口消毒及环境消毒和食品消毒等。

过氧化氢也在生物体中广泛存在并发挥重要生理功能。过氧化氢能够通过氧气的代谢及酶的催化作用产生，是生物体新陈代谢的主要产物之一。过氧化氢是神经信号转导分子，在生物体中发挥重要功能，在调控基因表达、免疫应激反应、神经信号转导过程中发挥重大作用。生理环境中过氧化氢的浓度异常可能会导致一系列重大疾病，如心血管疾病、糖尿病、风湿性关节炎、肿瘤、神经***疾病等。因此，在生物环境中对过氧化氢检测具有重要意义。

目前过氧化氢的检测方法主要有电化学方法（Electrochemical Method）、元素分析（EA）及等离子体-质谱（ICP-MS）等方法，然而这些检测方法的样品制备过程比较复杂，检测过程对样品损伤较大，而且无法实现对生物体的在线分析，因此，上述检测方法的应用领域受到限制。荧光分析方法是一类新兴的检测方法，具有检测方法快速方便、检测信号灵敏、检测限低、能够实现对生物体的在线分析等优点，在对环境及生物体中过氧化氢的检测方面具有重要应用前景。

目前的过氧化氢荧光探针仍存在探针的种类较少、检测信号不够灵敏等缺点，目前开发的荧光探针主要是在中性环境中检测过氧化氢的荧光探针，缺乏能够在碱性环境中检测过氧化氢的近红外发光的荧光探针，无法实现利用荧光的酸碱性调节对生物体如线粒体、胆汁、胰液中的碱性环境中的过氧化氢进行检测。基于上述问题，开发新型过氧化氢荧光探针，在水体系及生物环境中检测过氧化氢具有重要的研究价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种新型检测碱性环境中过氧化氢的荧光探针。该探针本身的荧光比较微弱、加入到水或有机溶剂后所得溶液为紫色，当与过氧化氢作用后，溶液的荧光显著增强、颜色变成绿色。

本发明还提供了上述荧光探针的制备方法，该合成方法简单，制备的产品产率高。

本发明还提供了上述荧光探针在水体系、有机溶剂体系或生物体中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种新型检测碱性环境中过氧化氢的荧光探针，其特征在于，探针分子式为C₃₁H₃₁BO₅N⁺，具有式（I）所示的结构：

（I）。

式（I）所示的化合物名称为（E）-4-（4-二羟硼基苄基）-9-（2-羧基苯基）-6-（二甲基氨基）-1,2,3,4-四氢呫吨鎓，简称CS-BOH。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）将间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐溶解于苯中，于50-70℃反应20-30h，得白色固体；

（2）将步骤（1）所得白色固体加入到环己酮和98wt%浓硫酸的混合溶液中，于45-55℃反应2-12h，将固体用乙醇重结晶得到化合物1，其结构式如下：

；

（3）将化合物1与对硼酸酯苯甲醛在酸性环境中，于40-70℃反应2-20 h后分离提纯得到式（I）所示化合物。

本发明探针合成路线如下：

所述步骤（1）中间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1:1-1.5。

所述步骤（1）中苯的用量为每毫摩尔间N-二乙胺基氨基苯酚10-70 mL。

所述步骤（2）中环己酮和98wt%浓硫酸的混合溶液中，环己酮和98wt%浓硫酸的体积比为6：20-200。

所述步骤（3）中化合物1与对硼酸酯苯甲醛的摩尔比为1：1-3。

所述步骤（3）中酸性环境所用的酸为醋酸、醋酸酐、甲磺酸，每毫摩尔化合物1所用酸的体积为10-20 ml。

所述步骤（3）中分离提纯的具体方法为：将反应完成后的溶液，旋转蒸馏除去溶剂，将固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到式（I）所示化合物。

上述新型检测碱性环境中过氧化氢的荧光探针应用于水体系、有机溶剂体系或生物体中过氧化氢的检测。以荧光增强、颜色发生明显改变的方式检测过氧化氢。该荧光探针在水体系、有机溶剂体系或生物体中能够高选择性识别过氧化氢，该探针本身的荧光比较微弱、加入到水或有机溶剂后所得溶液为紫色，当与过氧化氢作用后，溶液的荧光显著增强、颜色变成绿色。

本发明的有益效果如下：

1、本发明的过氧化氢荧光探针对过氧化氢检测的选择性高，检测灵敏高，而且现象明显，便于识别。

2、本发明过氧化氢荧光探针的制备方法简单。

附图说明

图1 为本发明实施例5中pH = 10时不同浓度过氧化氢条件下过氧化氢荧光探针的吸收光谱；其中最下面的曲线为不加入过氧化氢条件下的吸收曲线，曲线从下往上过氧化氢的浓度依次增加，最上面的曲线为浓度是2.8当量（eq）时过氧化氢的吸收曲线。

图2为本发明实施例5中pH = 10时不同浓度过氧化氢条件下过氧化氢荧光探针的荧光光谱；其中最上面的曲线为不加入过氧化氢条件下的荧光曲线，曲线从上往下过氧化氢的浓度依次增加，最下面的曲线为浓度是2.8当量（eq）时过氧化氢的荧光曲线。

图3 为本发明实施例6中pH = 8时不同浓度过氧化氢条件下过氧化氢荧光探针的吸收光谱；其中最下面的曲线为不加入过氧化氢条件下的吸收曲线，曲线从下往上过氧化氢的浓度依次增加，最上面的曲线为浓度是2.8当量（eq）时过氧化氢的吸收曲线。

图4为本发明实施例6中pH = 8时不同浓度过氧化氢条件下过氧化氢荧光探针的荧光光谱；其中最上面的曲线为不加入过氧化氢条件下的荧光曲线，曲线从上往下过氧化氢的浓度依次增加，最下面的曲线为浓度是2.8当量（eq）时过氧化氢的荧光曲线。

图5 为本发明实施例7中加入不同生物小分子之后的荧光强度变化的对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例中所用原料，如无特殊说明均为常规市购产品。

实施例1

化合物1的制备

将间N-二乙胺基苯酚（0.50 g, 3.03 mmol）与邻苯二甲酸酐(0.49 g, 3.33mmol) 在180 mL苯中60℃反应24小时得到白色固体，再将白色固体加入到20 mL含有6 ml环己酮的98wt%浓硫酸中，50℃反应3小时，固体用乙醇重结晶得到化合物1 (0.22 g, 0.45mmol)。

合成路线如下：

实施例2

新型检测碱性环境中过氧化氢的荧光探针的制备

反应路线如下：

制备过程，包括步骤如下：

将化合物1（0.377 g, 1.0 mmol）与对硼酸酯苯甲醛（0.157 g, 1.2 mmol）在20ml醋酸中，于50 ℃反应12 h，得到深色溶液，旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇混合溶剂过柱层析分离，得到目标化合物CS-BOH；收率：50%。¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 8.16 (m, 2H), 8.06 (s, 1H), 7.86 (t, J = 7.2, 2H), 7.72 (d, J = 8.4, 1H), 7.51 (s, 2H), 7.35 (d, J = 7.6, 1H), 6.8 (m, 2H), 3.58 (q, J = 6.4, 4H ), 2.8 (m, 2H), 2.07 (m, 1H), 1.67 (m, 3H), 1.23 (t, J = 6.8, 6H ).¹³C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.94, 152.38, 152.09, 149.39, 146.29, 142.08,134.56, 133.47, 131.95, 129.98, 129.38, 128.59, 127.52, 125.04, 123.45,119.00, 110.20, 109.77, 108.93, 104.61, 97.18, 44.44, 29.70, 27.25, 22.99,22.32, 12.55.

实施例3

如实施例2所述的过氧化氢荧光探针的制备方法，不同的是：

其中的对硼酸酯苯甲醛用量为3 mmol，将醋酸替换为醋酸酐，酸的用量为20 mL，反应温度为60 ℃，反应时间为12 h。

实施例4

如实施例2所述的过氧化氢荧光探针的制备方法，不同的是：

其中的对硼酸酯苯甲醛用量为1 mmol，将醋酸替换为甲磺酸，酸的用量为10mL，反应温度为50 ℃，反应时间为10 h。

实施例5

pH = 10荧光探针与过氧化氢的滴定实验

在pH = 10的PBS缓冲液中，加入初始浓度为1 mM的荧光探针，使得溶液中荧光探针的浓度为10 μM。然后，依次加入不同量的初始浓度为1.85 mM的过氧化氢，使得溶液中过氧化氢的浓度分别为0.044 μM、0.088 μM、0.132 μM、 0.176 μM、0.264 μM、0.352 μM、0.44μM、0.528 μM、0.704 μM、0.88 μM、1.056 μM、1.232 μM、1.408 μM、1.584 μM、1.76 μM、2.2μM、2.64 μM，不加入过氧化氢作为对照，静置0.5小时使过氧化氢与荧光探针充分反应。

分别用吸收光谱仪和荧光光谱仪测试不同过氧化氢条件下的吸收和荧光光谱，荧光光谱的激发波长为600 nm，发射波长为660 nm，检测波长为660 nm，结果分别如图1、图2所示。由图2可知，随着过氧化氢的浓度增加，在663 nm波长下的荧光强度逐渐降低，说明荧光探针能够对过氧化氢进行响应。

实施例6

pH =8荧光探针与过氧化氢的滴定实验

在pH = 8的PBS缓冲液中，加入初始浓度为1 mM的荧光探针，使得溶液中荧光探针的浓度为10 μM。然后，依次加入不同量的初始浓度为1.85 mM的过氧化氢，使得溶液中过氧化氢的浓度分别为0.044 μM、0.088 μM、0.132 μM、 0.176 μM、0.264 μM、0.352 μM、0.44 μM、0.528 μM、0.704 μM、0.88 μM、1.056 μM、1.232 μM、1.408 μM、1.584 μM、1.76 μM、2.2 μM、2.64 μM，不加入过氧化氢作为对照，静置0.5小时使过氧化氢与荧光探针充分反应。

分别用吸收光谱仪和荧光光谱仪测试不同过氧化氢条件下的吸收和荧光光谱，荧光光谱的激发波长为660 nm，发射波长为720 nm，检测波长为720 nm，结果分别如图3、图4所示。由图4可知，随着过氧化氢的浓度增加，在720 nm波长下的荧光强度逐渐增强，说明荧光探针能够对过氧化氢进行响应。

实施例7

荧光探针检测过氧化氢的选择性测试

如实施例5所述，在同样测试条件下，向溶液中加入过量的其它生物活性小分子，测试加入不同生物活性小分子之后的荧光光谱，激发波长为660 nm，发射波长为720 nm，检测波长为720 nm，结果如图5所示。由图5可知，常见的生物活性小分子如次氯酸、羟基自由基、叔丁基过氧化氢自由基、叔丁基过氧化氢、过氧乙酸、硫化氢、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、一氧化氮、亚硝酸根、硝酸根、亚硫酸根、硫酸根等，荧光强度只有过氧化氢变化明显，其他生物活性小分子不对检测结果产生干扰，可以证明该荧光探针对过氧化氢具有较高的选择性。

Claims (8)

1.一种检测碱性环境中过氧化氢的荧光探针，其特征在于，探针分子式为C₃₁H₃₁BO₅N⁺，具有式(I)所示的结构：

所述的荧光探针的制备方法包括以下步骤：

(1)将间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐溶解于苯中，于50-70℃反应20-30h，得白色固体；

(2)将步骤(1)所得白色固体加入到环己酮和98wt％浓硫酸的混合溶液中，于45-55℃反应2-12h，将固体用乙醇重结晶得到化合物1，其结构式如下：

(3)将化合物1与对硼酸酯苯甲醛在酸性环境中，于40-70℃反应2-20h后分离提纯得到式(I)所示化合物。

2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(1)中间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1:1-1.5。

3.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(1)中苯的用量为每毫摩尔间N-二乙胺基氨基苯酚10-70mL。

4.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(2)中环己酮和98wt％浓硫酸的混合溶液中，环己酮和98wt％浓硫酸的体积比为6：20-200。

5.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(3)中化合物1与对硼酸酯苯甲醛的摩尔比为1：1-3。

6.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(3)中酸性环境所用的酸为醋酸、醋酸酐、甲磺酸，每毫摩尔化合物1所用酸的体积为10-20ml。

7.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(3)中分离提纯的具体方法为：将反应完成后的溶液，旋转蒸馏除去溶剂，将固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到式(I)所示化合物。

8.一种权利要求1所述的荧光探针在水体系、有机溶剂体系或生物体中的应用，其特征在于，所述应用是将荧光探针用于在碱性环境下的水体系、有机溶剂体系或生物体中识别和检测过氧化氢分子。