CN109295089B - 一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄及其培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄及其培育方法，该番茄包括番茄的生长素响应因子基因SlARF10A或SlARF10B被融合抑制表达，所述SlARF10A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SlARF10B的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。利用嵌合抑制基因沉默技术（CRES‑T），将番茄生长素响应因子基因SlARF10A或SlARF10B与SRDX抑制区融合后导入番茄基因组中，获得的转基因番茄具有规则裂纹、色泽鲜艳且少籽（含1‑5粒）或无籽形态占84%以上（无籽形态平均占37.8%），大小与野生型一致，性状稳定遗传，不依赖于无性繁殖。通过嵌合抑制基因沉默技术（CRES‑T）调控番茄基因SlARF10A或SlARF10B表达，获得了有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄，为今后分子育种提供新的思路，为研究番茄果实的形态建成、品种培育等提供理论依据和材料。

Description

一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄及其培育方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄及其培育方法。

背景技术

番茄果实含有丰富的维生素和矿物质元素，对心血管具有保护作用；果实里的番茄红素具有独特的抗氧化能力，可以抗衰老；番茄所含的苹果酸或柠檬酸，有助于胃液对脂肪及蛋白质的消化等。因此，在番茄生长发育过程中，研究番茄果实的调控具有重要意义。

近年来，生长素在基因表达和调控方面的作用越来越引起人们的重视。在拟南芥和其他植物物种中，己经鉴定了大量可能受生长素调控并且可能在生长和发育过程中起作用的基因。在这些基因中，植物生长素应答因子（ARF）家族成员在调节生长素应答基因表达中发挥着关键作用，迄今为止，在番茄中鉴定了21个基因。研究发现不同ARF控制不同的发育过程，比如，SlARF4表达下调提高了果实硬度及叶绿素含量和叶绿体数量，导致在果实发育早期阶段的深绿色果实的产生(Jones etal.，2002)。这发现表明了生长素可以通过调控的表达来调节果实发育过程中糖的积累；SlARF7在番茄坐果中起负调控作用，作为一个调控子调控番茄坐果和果实发育(de Jong et al.，2009)。SlARF8通过异常表达能够促进番茄和拟南芥形成单性结实(Goetz et al.，2006)；SlARF9调控早期番茄果实发育中的细胞***(de Jong et al.，2015)。人们还发现SlARF10A-OE或SlARF10A-RNAi抑制表达的转基因果实，形态与野生型无差别，主要表现在叶绿素和糖分含量有差异（梅丽华.生长素响应因子基因SlARF10在番茄果实发育过程中的功能研究）。但是这些转录调控因子在控制果实单性结实和整体果实质量的中的作用在很大程度上还是未知的。

目前常采用基因敲除、反义技术、RNA干涉技术等对这些基因的生物学功能进行鉴定分析时，但基因家族的转录因子成员之间编码序列同源性很高，单个基因的功能缺失经常会因为同源基因的功能补偿作用而失败（基因功能冗余现象）。嵌合抑制子基因沉默技术CREST (Chimeric Repressor Silencing Technology ) 将SRDX序列与转录因子融合表达会抑制该转录因子以及与该转录因子的编码蛋白具有相同结合结构域的相应基因的表达，虽然该转录因子的原始激活区域依然存在，但是SRDX序列会将其转变成转录抑制子，因此可克服基因家族内的基因冗余现象起到显性抑制作用。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供了一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄及其培育方法，为番茄的单性结实、性状和果皮的遗传改造提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄，包括番茄的生长素响应因子基因SlARF10A或SlARF10B被融合抑制表达，所述基因SlARF10A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因SlARF10B的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

进一步，所述基因SlARF10A编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因SlARF10B编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述融合抑制表达是通过采用嵌合抑制子基因沉默技术（CRES-T）实现的。

上述有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄的培育方法，包括以下步骤：

1）将所述番茄基因SlARF10A或SlARF10B与抑制子SRDX融合后连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；

2）将步骤1）制备的重组表达载体转入番茄中。

一种重组表达载体，其特征在于，包括上述的SlARF10A或SlARF10B的核苷酸序列经嵌合抑制子SRDX形成的融合片段SlARF10A-SRDX或SlARF10B-SRDX。

一种包含上述重组表达载体的转化子。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明利用嵌合抑制子基因沉默技术（CRES-T），将番茄生长素响应因子基因SlARF10A或SlARF10B与SRDX抑制区融合后导入番茄基因组中，使其成为高效的负调控子，能够克服由于功能冗余基因的存在而造成的抑制效果不显著问题；获得的转基因番茄具有规则裂纹、色泽鲜艳且少籽（含1-5粒）或无籽形态占84%以上（无籽形态平均占37.8%），与野生型植株相比，转基因植株生长更旺盛，有利于果实的坐果和形态建成。可见，SlARF10A- SRDX或SlARF10B-SRDX转基因植株明显提高了番茄的品质。

2、本发明制备得到的SlARF10A/B-SRDX转基因番茄，不影响植物的生长发育，并且SlARF10A/B-SRDX转基因番茄果实可以利用少量种子传代下去，且该性状在后代中可以稳定遗传，保证持续获得有规则裂纹形态的无籽或少籽的番茄果实，减少了利用无性繁殖方法，如组培技术进行扩繁保存种质资源的麻烦和经济负担。

3、本发明通过农杆菌介导的遗传转化，成本低廉、后代遗传简单，不依赖于无性繁殖，通过嵌合抑制子基因沉默技术（CRES-T）调控番茄基因SlARF10A和SlARF10B表达，为今后分子育种提供新的思路，为研究番茄果实的形态建成、品种培育等提供理论依据和材料，用于商业化能源植物产品的定向分子设计。

附图说明

图1为重组表达载体pSlARF10A-GUS-NOS构建示意图；

图2为启动子pSlARF10A驱动GUS在番茄果实发育不同时期的表达示意图；

图3为重组载体表达载体P35S-SlARF10A-SRDX-NOS构建示意图；

图4为SlARF10A-SRDX融合基因在转基因番茄不同株系中的表达分析图；

图5为野生型番茄果实与SlARF10A-SRDX转基因番茄果实的表型差异图；

图A和B分别是野生型番茄果实在绿熟期和成熟期的表型；C和D分别是SlARF10A- SRDX转基因番茄果实在绿熟期和成熟期的表型；

图6为野生型番茄果实和SlARF10A-SRDX转基因番茄果实在成熟期的横切面图；

图A从左到右依次是野生型和少籽的SlARF10A-SRDX转基因番茄果实，B从左到右依次是野生型和无籽的SlARF10A-SRDX转基因番茄果实；

图7为野生型番茄果实与SlARF10B-SRDX转基因番茄果实的表型差异图；

A和B分别是野生型番茄果实在绿熟期和成熟期的表型；C和D分别是SlARF10B- SRDX转基因番茄果实在绿熟期和成熟期的表型；

图8为野生型番茄果实和SlARF10B-SRDX转基因番茄果实在成熟期的横切面图；

A从左到右依次是野生型和少籽的SlARF10B-SRDX转基因番茄果实，B从左到右依次是野生型和无籽的SlARF10B-SRDX转基因番茄果实。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1 番茄基因SlARF10A的启动子的克隆及GUS组织化学染色分析

（1）SlARF10A基因启动子的克隆

采用CTAB法（RTG2405-01，中科泰瑞）提取番茄基因组DNA，根据SEQ ID NO.3所示的pSlARF10A的核苷酸序列，设计引物pSlARF10A-F和pSlARF10A-R以提取的基因组DNA为模板，以pSlARF10A-F（正向引物）和pSlARF10A-R（反向引物）为引物进行基因SlARF10A的扩增。

所述引物序列如下：

pSlARF10A -F：5’- CAATTTACATATACAACACATGCCTCA-3’

pSlARF10A-R：5’- GCTAATCCAATAGTTTTTCCCCTTC-3’

PCR扩增体系：高保真扩增酶Prime STAR HS (R010A, TaKaRa) 0.25 μL，5×PrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus) 5 μL，正向引物(10μM) 0.5μL，反向引物(10μM) 0.5μL，模板（DNA）1μL，dNTP (2.5mM) 2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

反应程序：预变性95℃，5min；95℃，30s；60℃，40s；72℃，2min30s，38个循环；72℃,7min。

将得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳分析，按照胶回收试剂盒（9672，Takara）纯化目的基因片段pSlARF10A。

（2）利用TA克隆技术构建重组表达载体

用Xcm I单酶切处理表达载体pCXGUS-P，酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收表达载体pCXGUS-P大片段。再将纯化的SlARF10A片段末端加A，然后利用TA克隆技术与表达载体pCXGUS-P大片段连接，最后将连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有卡纳霉素（100mg/L）的筛选LB培养板上挑取阳性克隆并进行PCR检测及测序验证，即得到重组表达载体pSlARF10A-GUS-NOS（图1）。

其中，单酶切体系为：pCXGUS-P vector 5μL；XcmI 1μL；Buffer 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL。37℃反应3h。

加A反应体系：回收的SlARF10A片段 100ng；dATP 0.25μL；A-overhang enzyme0.25μL；10×Buffer 1μL；无菌ddH₂O补足至10μL；65℃反应40min。

连接反应体系：加A反应的产物3μL;Linearized vector (pCXGUS-P回收大片段)1-2μL；Solution I 5μL；无菌ddH₂O补足至10μL。16℃连接反应2h。

（3）重组表达载体的遗传转化和GUS染色分析

通过常规冻融法将构建的重组表达载体pSlARF10A-GUS-NOS转入农杆菌EHA105中，再通过农杆菌介导方法将pSlARF10A-GUS-NOS转入野生型番茄（Micro Tom），具体步骤如下：

1）转化材料的培养

将番茄组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为10000-12000lux的条件下培养30-40天后，选取长势良好的组培苗的叶片用于遗传转化。

2）转化

将含有pSlARF10A-GUS-NOS表达载体的农杆菌，接种于含有卡纳霉素（100mg/L）的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.8～1.0之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用KCMS液体培养基稀释到OD600约为0.05-0.1之间；再放入待转化番茄组培苗的叶片，其中叶片切出伤口，农杆菌侵染大约20-30min；用灭菌滤纸吸干菌液，将叶片在KCMS固体培养基中暗培养2-3天。

3）初筛培养

将番茄叶片转移到含有12.5mg/L潮霉素和相应激素的初筛培养基ZR中，使侵染后的外植体（叶片）伤口处诱导出愈伤组织，随后诱导分化不定芽。2周更换一次新培养基。

4）生根培养

将外植体细胞分化出的不定芽切下，***含有12.5mg/L潮霉素和相应激素的生根培养基ENR，再将其放入光照培养箱培养直至生根；当不定芽生根后，将其移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因番茄植株，观察其表型变化。

5）转基因株系GUS组织化学染色鉴定

对转化有pSlARF10A-GUS-NOS的转基因番茄进行组织化学染色分析。在转基因番茄果实发育的不同时期，包括授粉后4天、授粉后8天、幼果期、绿熟期和果实破色期，收集不同大小的转基因番茄果实，用无菌水清洗干净，将其纵向剖开，浸泡在含有0.2mM X-Gluc的GUS染色液中，37℃处理1h以上；然后取出，室温条件下，依次在30%、50％和75%的酒精中分别浸泡5-6h进行脱色处理；然后直接在显微镜下进行GUS组织水平观察。GUS染色缓冲液含有50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)、0.2％Triton X-100、2mM亚铁***和2mM铁***。

通过将番茄基因SlARF10A导入pCXGUS-P载体中，SlARF10A与GUS标记基因融合，驱动GUS表达，通过对转基因植物染色，可以观察GUS的表达情况，进而清楚的观察番茄SlARF10A基因的时空表达特异性。

染色结果如图2所示，pSlARF10A-GUS-NOS在番茄果实发育的各个时期均有表达。在授粉后5天，发现其主要集中在胎盘（plancenta）上表达；到第8天，由胎盘扩散到中柱基部（columella）大量表达以及果皮（pericarp）中间处（内表皮和外表皮交际位置）有少量表达；在幼果期和绿熟期，发现其主要在果皮（pericarp）中间处、胎盘维管组织以及种皮中表达；到了破色期，在果皮（pericarp）中间处和胎盘维管组织中显著表达。以上结果暗示，SlARF10A基因参与调控果实的形成和发育；同时可能参与调控种皮的发育进而影响到种子发育。

实施例2 番茄SlARF10A-SRDX融合基因克隆及农杆菌介导的遗传转化

（1）SlARF10A-SRDX融合片段的克隆

取Micro Tom番茄混合样本（叶、花和果实）为材料，TRIzol™ Plus RNAPurification Kit （12183555，Invitrogen™），按说明书步骤提取番茄总RNA，利用DNaseI（18047019，Invitrogen™）去除残余的微量DNA，并用分光光度计测定RNA的浓度，备用。

取约2.0μg番茄总RNA，采用PrimeScript II first-strand cDNA synthesis kit(6210A, Takara)，并按照说明书步骤合成cDNA第一链。

根据SEQ ID NO.1所示番茄SlARF10A基因序列，设计特异性引物SlARF10A-F、SlARF10A- 3’SRDX-R（不含终止密码）和SRDX-R。以cDNA为模板，以SlARF10A-F（正向引物）和SlARF10A-3’SRDX-R（反向引物）为引物进行第一轮PCR产物扩增；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并按照胶回收试剂盒（9672，Takara）说明书步骤进行回收纯化；并以第一轮回收产物为模板，以SlARF10A-F（正向引物）和SRDX-R（反向引物）为引物进行第二轮PCR产物扩增；然后将PCR产物（SlARF10A-SRDX融合片段）纯化回收备用。所述引物序列如下：

SlARF10A-F：5’- ATGAAGGAGGTTTTGGAGAAGTGTG -3’；

SlARF10A-3’SRDX-R：5’-CTAGATCCAGATCAAGTGCAAAGATGCTAAGAGGTCCTGCC-3’（加粗部分为SRDX部分序列）；

SRDX-R：TTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCAAG（加粗部分为引物重叠部分）

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS (R010A, TaKaRa) 0.5μL，5xPrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus) 10μL，正向引物(10μM) 1μL，反向引物(10μM) 1μL，模板1μL，dNTP (2.5mM) 4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，2min，35个循环；72℃，10min。

（2）构建重组表达载体P35S-SlARF10A-SRDX-NOS

用Xcm I单酶切处理pCXSN表达载体，酶切后根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pCXSN载体大片段。再利用平末端加A试剂（6019，Takara）将纯化的SlARF10A-SRDX融合片段末端加A，通过TA连接将其与pCXSN大片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有卡纳霉素（100mg/L）的LB培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证。

酶切体系为：pCXSN vector 5μL；Xcm I 1μL；Buffer 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL。37℃反应3h。

加A反应体系：回收SlARF10-SRDX融合片段 100ng；dATP 0.25μL；A-overhangenzyme 0.25μL；10×Buffer 1μL；无菌ddH₂O补足至10μL；65℃反应40min。

连接反应体系：加A反应产物 2-3μL; Linearized vector（pCXSN大片段）2μL；Solution I 5μL；无菌ddH₂O补足至10μL。16℃连接反应6h。

重组表达载体pCX-SlARF10-SRDX-NOS的构建示意图如图3所示，目的基因SlARF10A与SRDX（含EAR抑制区LDLDLELRLGFA）相融合，位于组成型强启动子P35S下游，它能使SlARF10A-SRDX在植物体内高效表达；其3’端组装有NOS终止子，可以有效终止目的基因的转录。在重组表达载体上组装有HPT基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因HPT整合至植物受体染色体上。

（3）农杆菌介导的番茄遗传转化

通过常规冻融法将构建的重组表达载体P35S-SlARF10A-SRDX-NOS转入农杆菌EHA105中，再通过农杆菌介导方法将它们转入野生型番茄（Micro Tom），具体步骤如下：

1）转化材料的培养

将番茄组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为10000-12000lux的条件下培养30-40天后，选取长势良好的组培苗的叶片用于遗传转化。

2）转化

将含有重组表达载体P35S-SlARF10A-SRDX-NOS的农杆菌，接种于含有卡纳霉素（100mg/L）的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.8～1.0之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用KCMS液体培养基稀释到OD600约为0.05-0.1之间；再放入待转化番茄组培苗的叶片，其中叶片切出伤口，农杆菌侵染大约20-30min；用灭菌滤纸吸干菌液，将叶片在在KCMS固体培养基中暗培养2-3天。

3）初筛培养

将番茄叶片转移到含有12.5mg/L潮霉素和相应激素的初筛培养基ZR中，使侵染后的外植体（叶片）伤口处诱导出愈伤组织，随后诱导分化不定芽。2周更换一次新培养基。

4）生根培养

将外植体细胞分化出的不定芽切下，***含有12.5mg/L潮霉素和相应激素的生根培养基ENR，再将其放入光照培养箱培养直至生根；当不定芽生根后，将其移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因番茄植株，观察其表型变化。

（4）转基因番茄阳性株系的鉴定及表型分析

1）鉴定转基因SlARF10A-SRDX番茄株系

从获得的T0代转基因番茄植株中收集到少量种子，进行播种，获得T1转基因番茄植株，收集种子继续播种，一直到T3代比较稳定的转基因株系。

采用Trizol试剂（Invitrogen™），按说明书步骤提取T3代番茄总RNA，利用DNaseI（Invitrogen™）去除残余DNA，采用cDNA反转录试剂（Takara）并按照说明书步骤合成cDNA第一链。以Sl-Actin基因为内参，通过半定量RT-PCR方法分析T3代转基因株系与野生型中目的基因SlARF10A-SRDX的表达水平。

检测Sl-Actin基因引物为：

Sl-Actin-F: 5'-TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC-3'

Sl-Actin-R: 5'-CAGTTAAATCACGACCAGCAAGAT-3'

检测SlARF10A-SRDX融合基因引物为：

SlARF10A-3'-F: 5'-cacctcggttcttactcttcggtcag-3'

NOS-SRDX-R: 5'-CTCGTCGACTTAAGCGAAAC-3'（加粗部分为SRDX部分序列）

结果如图4所示，含有重组表达载体P35S-SlARF10A-SRDX-NOS的6个转基因株系（10A-L1、10A-L2、10A-L3、10A-L4、10A-L5、10A-L6）中目的基因SlARF10A-SRDX为显著上调表达，特别是10A-L1、10A-L2和10A-L3转基因株系，而在野生型植株（WT）中检测不到SlARF10A-SRDX表达，表明成功获得了转SlARF10A-SRDX基因番茄阳性株系。

2）转基因番茄植株的表型分析

与WT植株相比，SlARF10A-SRDX 转基因植株均正常生长，且转基因植株生长更旺盛，有利于果实的坐果和形态建成。然而，与WT果实相比（图5A，B），SlARF10A-SRDX 转基因番茄果实在绿熟期和成熟期均表现出更优的品质，包括有规则裂纹形态和色泽更加鲜艳（图5C，D）。

进一步分析果实中种子含量发现，WT果实含有大量种子，而SlARF10A-SRDX转基因番茄含有少量种子或无籽形态（图6）。选择正常发育的WT和SlARF10A-SRDX转基因番茄3个株系，每个株系随机挑选60个果实进行统计分析，结果如表1所示。

表1

植株	番茄的平均种子数（粒）	超过10粒种子的番茄（%）	1~5粒种子的番茄（%）	无籽的番茄（%）
					野生型（WT）	23±2	100	0	0
10A-L1	3±1	7.2	42.8	50
					10A-L2	5±1	18.5	55.6	25.9
10A-L3	7±2	21.9	40.6	37.5

由表1可以得出，每个WT果实均含有10个以上种子，平均含有23个种子；而SlARF10A-SRDX转基因番茄株系10A-L1中含10个以上种子占7.2%；少籽（1-5个）或无籽形态的果实占92.8%（无籽形态占50%），株系10A-L2中含10个以上种子占18.5%；少籽（1-5个）或无籽形态的果实占到81.5%（无籽形态占25.9%），株系10A-L3中含10个以上种子占21.9%；少籽（1-5个）或无籽形态的果实占78.1%（无籽形态占37.5%），因此，SlARF10A-SRDX 转基因番茄含少籽（1-5个）或无籽形态的果实平均为84.1%（无籽形态占 37.8%）。

实施例3 番茄SlARF10B-SRDX融合基因的克隆及农杆菌介导的遗传转化

（1）SlARF10B-SRDX融合片段的克隆

取Micro Tom番茄混合样本（叶、花和果实）为材料，TRIzol™ Plus RNAPurification Kit （12183555，Invitrogen™），按说明书步骤提取番茄总RNA，利用DNaseI（18047019，Invitrogen™）去除残余的微量DNA，并用分光光度计测定RNA的浓度，备用。

取约2.0μg番茄总RNA，采用PrimeScript II first-strand cDNA synthesis kit(6210A, Takara)，并按照说明书步骤合成cDNA第一链。

根据SEQ ID NO.3所示番茄SlARF10B基因序列，设计特异性引物SlARF10B-F、SlARF10B- 3’SRDX-R（不含终止密码）和SRDX-R。以cDNA为模板，以SlARF10B-F（正向引物）和SlARF10B-3’SRDX-R（反向引物）为引物进行第一轮PCR产物扩增；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并按照胶回收试剂盒（9672，Takara）说明书步骤进行回收纯化；并以第一轮回收产物为模板，以SlARF10B-F（正向引物）和SRDX-R（反向引物）为引物进行第二轮PCR产物扩增；然后将PCR产物（SlARF10B-SRDX融合片段）纯化回收备用。所述引物序列如下：

SlARF10B-F：5’- ATGGAGGTGGTGGAAGAGAAG -3’；

SlARF10B-3’SRDX-R：5’- CTAGATCCAGATCAAGGACAACATTGAGGATCGGCAG -3’（加粗部分为SRDX部分序列）；

SRDX-R：5’-TTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCAAG -3’（加粗部分为引物重叠部分）

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS (R010A, TaKaRa) 0.5μL，5xPrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus) 10μL，正向引物(10μM) 1μL，反向引物(10μM) 1μL，模板1μL，dNTP (2.5mM) 4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，2min，35个循环；72℃，10min。

（2）构建重组表达载体P35S-SlARF10B-SRDX-NOS

用Xcm I单酶切处理pCXSN表达载体，酶切后根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pCXSN载体大片段。再利用平末端加A试剂（6019，Takara）将纯化的SlARF10B-SRDX融合片段末端加A，通过TA连接将其与pCXSN大片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有卡纳霉素（100mg/L）的LB培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证。

酶切体系为：pCXSN vector 5μL；Xcm I 1μL；Buffer 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL。37℃反应3h。

加A反应体系：回收SlARF10-SRDX融合片段 100ng；dATP 0.25μL；A-overhangenzyme 0.25μL；10×Buffer 1μL；无菌ddH₂O补足至10μL；65℃反应40min。

连接反应体系：加A反应产物 2-3μL; Linearized vector（pCXSN大片段）2μL；Solution I 5μL；无菌ddH₂O补足至10μL。16℃连接反应6h。

重组表达载体pCX-SlARF10-SRDX-NOS中，目的基因SlARF10B与SRDX（含EAR抑制区LDLDLELRLGFA）相融合，位于组成型强启动子P35S下游，它能使SlARF10B-SRDX在植物体内高效表达；其3’端组装有NOS终止子，可以有效终止目的基因的转录。在重组表达载体上组装有HPT基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因HPT整合至植物受体染色体上。

（3）农杆菌介导的番茄遗传转化

通过常规冻融法将构建的重组表达载体P35S-SlARF10B-SRDX-NOS转入农杆菌EHA105中，再通过农杆菌介导方法将它们转入野生型番茄（Micro Tom），具体步骤如下：

1）转化材料的培养

将番茄组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为10000-12000lux的条件下培养30-40天后，选取长势良好的组培苗的叶片用于遗传转化。

2）转化

将含有重组表达载体P35S-SlARF10B-SRDX-NOS的农杆菌，接种于含有卡纳霉素（100mg/L）的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.8～1.0之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用KCMS液体培养基稀释到OD600约为0.05-0.1之间；再放入待转化番茄组培苗的叶片，其中叶片切出伤口，农杆菌侵染大约20-30min；用灭菌滤纸吸干菌液，将叶片在在KCMS固体培养基中暗培养2-3天。

3）初筛培养

将番茄叶片转移到含有12.5mg/L潮霉素和相应激素的初筛培养基ZR中，使侵染后的外植体（叶片）伤口处诱导出愈伤组织，随后诱导分化不定芽。2周更换一次新培养基。

4）生根培养

将外植体细胞分化出的不定芽切下，***含有12.5mg/L潮霉素和相应激素的生根培养基ENR，再将其放入光照培养箱培养直至生根；当不定芽生根后，将其移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因番茄植株，观察其表型变化。

（4）转基因番茄阳性株系的鉴定及表型分析

1）鉴定转基因SlARF10B-SRDX番茄株系

从获得的T0代转基因番茄植株中收集到少量种子，进行播种，获得T1转基因番茄植株，收集种子继续播种，一直到T3代比较稳定的转基因株系。

采用Trizol试剂（Invitrogen™），按说明书步骤提取T3代番茄总RNA，利用DNaseI（Invitrogen™）去除残余DNA，采用cDNA反转录试剂（Takara）并按照说明书步骤合成cDNA第一链。以Sl-Actin基因为内参，通过半定量RT-PCR方法分析T3代转基因株系与野生型中目的基因SlARF10B-SRDX的表达水平。

检测Sl-Actin基因引物为：

Sl-Actin-F: 5'-TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC-3'

Sl-Actin-R: 5'-CAGTTAAATCACGACCAGCAAGAT-3'

检测SlARF10B-SRDX融合基因引物为：

SlARF10B-3'-F: 5'- CAGCAAATGTCAAGTGTCCTCTCTAC -3'

NOS-SRDX-R: 5'- CTCGTCGACTTAAGCGAAAC -3'（加粗部分为SRDX部分序列）

2）转基因番茄植株的表型分析

与WT果实相比（图7A，B），获得的SlARF10B-SRDX转基因番茄的果实表现为有规则的裂纹形态，大小与野生型一致且色泽更加鲜艳（图7C，D），具有更强的商品性。

与WT果实种子数量相比，SlARF10B-SRDX转基因番茄只含有少量种子或无籽形态（图8）。

综上，通过嵌合抑制子基因沉默技术（CRES-T）在番茄中抑制表达SlARF10A或SlARF10B基因时，可以明显提高番茄的品质，同时不影响植物的生长发育。并且SlARF10A/B-SRDX转基因番茄果实可以利用少量种子传代下去，保证持续获得有规则裂纹形态的无籽或少籽的番茄果实，减少了利用无性繁殖方法，如组培技术进行扩繁保存种质资源的麻烦和经济负担。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 一种有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄及其培育方法

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2100

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 1

atgaaggagg ttttggagaa gtgtgtggat tcacagctat ggcacgcctg tgcaggagga 60

atggtgcaaa tccctccggt taactccaaa gtctactatt ttccacaagg gcatgctgag 120

catactctta tgaatgtgga tttctcagct ctaccaagaa gtcctgctct gattctatgc 180

agagtagctg ctgtgaagtt cttagcggac cctgaaacag atgaggttta tgctaagatt 240

agggttgtcc cagttgggaa caaggggaat gactttgatg atgatgatga cattttgggt 300

agtaatgagt caggaacagc tgaaaaaccc aattcatttg ccaagacatt gactcaatca 360

gatgcaaata atggtggtgg attctctgtg cctagatact gtgcagagac aatatttcct 420

aggttggatt acacggctga cccgcctgtg cagaccgtga cagccaaaga tgttcatggt 480

gaaagttgga agtttaggca catttataga ggtactccca ggaggcattt gttaacgact 540

ggttggagta gttttgtgaa tcagaagaaa cttgttgctg gagattccat tgtgtttttg 600

agggcagaaa atggtgaact ttgtgttgga attcgtaggg cgaaaagagg tggtattggt 660

gggcctgaag ccccatctgg atggaactct ggtgctggaa attatggtgg attttctgcg 720

tttttgaggg aagagatgag caaaaatgga aatttgactt ctcctactag gagcttaagg 780

ggaaagggaa gggtgaggcc tgaatcagtt gttgaagctg catatcttgc ttctagtggg 840

cagccttttg aagttgttta ttatccccgt gcaaacacac cagaattttg tgttagggca 900

tcttcagtga atgctgcaat gaggattcaa tggtgctcag gaatgaggtt caaaatggct 960

tttgaaactg aggattcttc tcgaatcagt tggttcatgg gaactatatc ctccattcaa 1020

cttgctgatc ccatccgctg gcccaattcg ccatggaggc ttcttcaggt ggcatgggat 1080

gaacctgatt tattgcaaaa cgtaaaacat gtcagcccat ggcttgtcga attggtctca 1140

aatatgccag tcattcacct ctcgcccttc tcaccgccaa gaaaaaagct gcgtctacca 1200

ccagatttct cacttgacag ccagtttcag ttaccatctt tttcaggcaa ccccctcagg 1260

tccagcagtc ctttctgttg tttatctgac aacatcactg caggcataca gggagccagg 1320

catgctcaat ttggagtacc tttattggat cttcacctta gcaacaaatt accgtcagga 1380

ctgttaccac caagtttcca gcgcgttgca gccaactcac aacttcctaa tgtcatcaat 1440

aagtgccaaa atgacagaaa tgataacatc tcttgtttgc ttacaatggg tacttcaagt 1500

aagacattgg acaaaaatga tagtgtgaat acacctcggt tcttactctt cggtcagcca 1560

attctgactg agcaacaaat ctctaatgga tgttctgtca gtgctccaca agtagtccaa 1620

acagggaaag acttaggaag gatacaaccg atcaacgaaa aacatccttc tgagcagaaa 1680

ggcagcattc aagacaatct atcaagtgca acatttttct ggaatcgagg ttatcatgca 1740

gctgaacttg gtgtactcaa tactggtcac tgcaaagtat tcctcgagtc agaagatgtt 1800

ggccgtacac ttgatctgtc agttatggga tcatatgaag aactgtacaa aagacttgca 1860

aacatgtttg gacttgaaag accagatatg ctgacccgtg tgctctatca tgatgcaaca 1920

ggtgctgtta aacacaccgg agatgaacca ttcagtgact ttgttaagag tgcaaaaaga 1980

ttgacaattc tgatgaactc aagcagcaat attaaaagga aatggttaac tggtctcgca 2040

actgctgaac gtggtctaga ttcatcaaac caggcaggac ctcttagcat ctttgcatag 2100

<210> 2

<211> 699

<212> PRT

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 2

MKEVLEKCVD SQLWHACAGG MVQIPPVNSK VYYFPQGHAE HTLMNVDFSA LPRSPALILC 60

RVAAVKFLAD PETDEVYAKI RVVPVGNKGN DFDDDDDILG SNESGTAEKP NSFAKTLTQS 120

DANNGGGFSV PRYCAETIFP RLDYTADPPV QTVTAKDVHG ESWKFRHIYR GTPRRHLLTT 180

GWSSFVNQKK LVAGDSIVFL RAENGELCVG IRRAKRGGIG GPEAPSGWNS GAGNYGGFSA 240

FLREEMSKNG NLTSPTRSLR GKGRVRPESV VEAAHLASSG QPFEVVYYPR ANTPEFCVRA 300

SSVNAAMRIQ WCSGMRFKMA FETEDSSRIS WFMGTISSIQ LADPIRWPNS PWRLLQVAWD 360

EPDLLQNVKH VSPWLVELVS NMPVIHLSPF SPPRKKLRLP PDFSLDSQFQ LPSFSGNPLR 420

SSSPFCCLSD NITAGIQGAR HAQFGVPLLD LHPSNKLPSG LLPPSFQRVA ANSQLPNVIN 480

KCQNDRNDNI SCLLTMGTSS KTLDKNDSVN TPRFLLFGQP ILTEQQISNG CSVSAPQVVQ 540

TGKDLGRIQP INEKHPSEQK GSIQDNLSSA TFFWNRGYHA AELGVLNTGH CKVFLESEDV 600

GRTLDLSVMG SYEELYKRLA NMFGLERPDM LTRVLYHDAT GAVKHTGDEP FSDFVKSAKR 660

LTILMNSSSN IKRKWLTGLA TAERGLDSSN QAGPLSIFA 699

<210> 3

<211> 2016

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 3

atggaggtgg tggaagagaa gtgtgtggac tctctgtttt ggcatgtctg tacaggaagc 60

atggtacaaa ttcctccggt gaactctaag gtgttctatt tcccacaagg ttatgctgag 120

catacattta caaatgttga tttcactgta ctggcgagaa ttccggcgat gattctatgc 180

agagttgatg ctgtgaagtt tttagctgac actgaaactg atgaagttta tgcgaaaatt 240

aggcttattc cggttgaaga ctttgaagat gacagtgtgg ttgaagaaac tgagaagcct 300

gctttttttg ctaagacatt gactcaatca gatgcgaata atgggggtgg tttttcagtt 360

ccgaggtatt gtgcagagac aattttcccc aaattggatt tcacagctga tccgcctgtc 420

caagtagtga aggcaaagga tgttcatggt gtaacctgga attttaggca catttatagg 480

ggaacgccaa ggaggcattt attgactagt ggttggagtg catttgtcaa taagaagaag 540

ctggttgcag ggggctctgt tgtgtttgtc aaggctgaaa atgatgagct ttgtgttgga 600

attcgcaggg taaagcgggg tggtattggt ggaccggaaa cacaatcagg gtggaaatca 660

actgcttgta gttatggtgg atttgtgacg gaagacgaga acagtagtac taatggaaat 720

ctgatttctt atggtgagag atttagagat aagggaaaag tgagccctga tgaagttgtt 780

agagtctcat gtctcgctgc taatggccag ccttttgaaa ttgtttacta ccctggtgca 840

agcactccag aatattgtgt taaagcctct tctgtgcgtg ctgcaatgag tgttcaatgg 900

tgctcaggga tgaggttcaa aatggccttt gaaaccgagg atttttctca gatcagctgg 960

ttcatgggaa gtatatcttc agttcaggtt gttgatccca tccgttggcc tcattcactg 1020

tggcggcttc ttcaggtgac atgggatgaa ccagatttgt tgcagaatgt aaaatctgta 1080

aacccatggc ttgtcgaatt ggtctctaat atgcccgaca ttaacttgtc acacaactca 1140

ccaccaagga aaaggttgtg tttgccacaa gagtttccat ttgacggtca atttccatta 1200

ccttcatttt caggcaaccc cctcacgtct agcagttatt ctcgttatcc gcctgacagc 1260

attactgcag gcatacaggg agccaggcat gttcgatttg gagtaccttt attagatctc 1320

caccgtagcg aaaagttgca gttaggtgtg ctacaaccac ccgtttccca acaagctgat 1380

gctgattctg aaattcctat tggcacaagt aaggtccaaa aagagagcaa tgaaaatata 1440

tcttgcttgc ttaccatggg tacctctagt cagatggaga aagctgataa tgtgaagaca 1500

cctcggtttt tactctttgg ccaaccaatt ctcaccgaac agcaaatgtc aagtgtcctc 1560

tctactcatg ctcctccaca agtccaaaca gaaagaaact ccgattgggc acaattgaaa 1620

actgaaagaa ttactccaga ctggaaatgc ctttcagaaa gtctatcaag cacatttctt 1680

tggaataaag gttatcacgc agctgaactt ggcgcgagta ctgatcactg caaagtattc 1740

ctagattcag aggacgtagg acgtactctt gatctctcag ttctaggatc atacgcggag 1800

ctgtataaaa gacttgcaga catgtttgag atggaaagat tagatatggt gacccgtgtg 1860

ctctatctag atgcaacagg tgcgtctaaa caaattggag atgaaccatt cagtgacttc 1920

atcaagactg caaaaagact gacaattttg aagaaatctg gcaacagtgc tacaaggaaa 1980

tggctcactg atctgccgat cctcaatgtt gtctag 2016

<210> 4

<211> 671

<212> PRT

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 4

MEVVEEKCVD SLFWHVCTGS MVQIPPVNSK VFYFPQGYAE HTFTNVDFTV LARIPAMILC 60

RVDAVKFLAD TETDEVYAKI RLIPVEDFED DSVVEETEKP AFFAKTLTQS DANNGGGFSV 120

PRYCAETIFP KLDFTADPPV QVVKAKDVHG VTWNFRHIYR GTPRRHLLTS GWSAFVNKKK 180

LVAGGSVVFV KAENDELCVG IRRVKRGGIG GPETQSGWKS TACSYGGFVT EDENSSTNGN 240

LISYGERFRD KGKVSPDEVV RVSCLAANGQ PFEIVYYPGA STPEYCVKAS SVRAAMSVQW 300

CSGMRFKMAF ETEDFSQISW FMGSISSVQV VDPIRWPHSL WRLLQVTWDE PDLLQNVKSV 360

NPWLVELVSN MPDINLSHNS PPRKRLCLPQ EFPFDGQFPL PSFSGNPLTS SSYSRYPPDS 420

ITAGIQGARH VRFGVPLLDL HRSEKLQLGV LQPPVSQQAD ADSEIPIGTS KVQKESNENI 480

SCLLTMGTSS QMEKADNVKT PRFLLFGQPI LTEQQMSSVL STHAPPQVQT ERNSDWAQLK 540

TERITPDWKC LSESLSSTFL WNKGYHAAEL GASTDHCKVF LDSEDVGRTL DLSVLGSYAE 600

LYKRLADMFE MERLDMVTRV LYLDATGASK QIGDEPFSDF IKTAKRLTIL KKSGNSATRK 660

WLTDLPILNV V 671

<210> 5

<211> 2486

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 5

caatttacat atacaacaca tgcctcattt atagagttaa agaaaaaact caaactaatt 60

cacgtctaat ttaaaattta ttattttttt ctcaattaaa caaatattcc gtattaggaa 120

aaaaaagtat gatatacaat aaaacctcta taaattaata aaggnnggan cangaaattt 180

tattatttta tananatatt ntttaattga taatttagta tttattaatt aaaaaataat 240

ttgaaattta gtgaaggtta gttttagata tatcaaaatc attatatctt attaatttat 300

gtatcatatt tattgatttc acattttttt aaaagtgtac ataaagtaca acgaatacat 360

caaaatcatt gtatcttact aactccaacc tcgtgatgtt gggataataa gaactttcaa 420

gatgtattat cgaacatatt ttatttagga tattagaaga ttatgaagtg ggagaaacta 480

atcctagaaa gattattggt ttggttgcta ttgattttgc aatccctgtt tgtataacaa 540

atatatctaa agacgatagg aagttatttt cgatattata taattcattt gggatgtaat 600

ctcaaagaat ttaaatgaat ctacttgtga aaatgttatt catgaacttg aggttattga 660

cgaataatat cgaatactaa aataaaatgg atgtcaatta tccgggtgaa agtgatacat 720

gttcagaggt ccagagctta aaagaaattg cgaatatcat cggaaaaatc aatgttaatg 780

atgaagttgg agatgatact atatcttggg anccaattac gcataaggaa acacttatcg 840

catttagggc tcttcacgtt ttatggtgca attnggaaag acaacactac agctcttgga 900

tgcaataaaa acagttagag atgagcttca actacattta aattttaaga gaaaacagaa 960

cactataana tcgcatttca ctaaattatc ttaaatatag tttgtacttt taaagaatta 1020

ttaatttatc atattagcaa gaccatatat ttatataagg gtcttctgaa aatanannna 1080

cntattatct tatcaaaatt gaatgatttt ttccattgat caaagtcgga attggaagaa 1140

aatattatnn nnnaaanann attantttat cgaatattaa tttacaaaag ttttactata 1200

atctgattat tttaaatttt acgatccaaa tttataatct atatatcaca cgaagataaa 1260

gacattaata tatatatgta tcgaaaattg gttatgccga aaaccatgtc gtttcttctg 1320

atgtctcatc ttaaaattaa cttgctatac ttggcagtat aataagtact acgtcttcta 1380

gtagtgaagt tcacattttt tttattttgt cgccaagcaa aacggcaccg gcgacggaga 1440

cggcgacggt aacggtgact gatgagttaa aggagtgaga ttgtactgcc ggattgtgag 1500

aactaactag tgtatattcc gtcaactaat aacgccggcc gaccggcgat tcatttactg 1560

atctcgtact tgtagaggat gttgctaacg tcattaactt gcaacgatcc aagtttccgg 1620

tgttgttttg tgtgaatcat ctcgttttgg cttcgatcgg agaagaaact gtacggatat 1680

tgacattcac tttaatgcat ttatgttaaa tatatatagg tagtactcgc tctgtaaatg 1740

tgnttttttg aagctgaaaa gcctgtaatc ggaagttttt ctttcgactt ttttcttttt 1800

gcggatattg attgattgat ataagtagaa agaaggaagt cagaagctac tgctttccgt 1860

tttaggattt gattgaagag gagagtattg atgattagtt tttttttttc aatttttgag 1920

gtttaatatc agttttcata atcggaaatt ttcagtttca ttttgaaaat cggtactaat 1980

cttcatcaga tccatatttt gcttgcctgt aaatgtgttt cactattagt ttttctgttc 2040

tctgaaccta ttaataggat ttttttggtt gaaatttcta gtttctgtgc tttttatcct 2100

catttctgga ccttttgatt gaacttgttg agcgtagttt tctccattgt tgttcagctt 2160

caaaaatagt gtatatttgg tgaatcggtc aacgatttcg gagagtctga gcaagatgga 2220

tttgctctgc tgcttgtaat tgttgttgaa atttactggt ttttgacttt ttgtagttat 2280

tttctaattt tttttgtacc ttctacttgt atatcttgtc taaatttatt ggtttctgca 2340

cgtgttttct cattattgga tctttttact ttgaatttat tactgaaatt tgtttcattt 2400

gtggtacaca gcttttaagc ttttctggaa ttgctgttct gtaattgttt tcaactaagg 2460

agaaggggaa aaactattgg attagc 2486

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caatttacat atacaacaca tgcctca 27

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctaatccaa tagtttttcc ccttc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgaaggagg ttttggagaa gtgtg 25

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctagatccag atcaagtgca aagatgctaa gaggtcctgc c 41

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttaagcgaaa cccaaacgga gttctagatc cagatcaag 39

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtccctatt tacgagggtt atgc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cagttaaatc acgaccagca agat 24

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cacctcggtt cttactcttc ggtcag 26

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctcgtcgact taagcgaaac 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atggaggtgg tggaagagaa g 21

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctagatccag atcaaggaca acattgagga tcggcag 37

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagcaaatgt caagtgtcct ctctac 26

Claims (4)

1.一种培育有规则裂纹且色泽鲜艳的无籽番茄的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将所述番茄基因SlARF10A或SlARF10B与抑制子SRDX融合后连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；

2）将步骤1）制备的重组表达载体转入番茄中；

所述基因SlARF10A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因SlARF10B的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述基因SlARF10A编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因SlARF10B编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的SlARF10A或SlARF10B的核苷酸序列经嵌合抑制子SRDX形成的融合片段SlARF10A-SRDX或SlARF10B-SRDX。

3.一种包含权利要求2所述重组表达载体的转化子。

4.如权利要求3所述的转化子，其特征在于，宿主菌为农杆菌。

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