CN116555340A - 针对hla-i类分子的高效基因编辑方法及其试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其是涉及针对HLA‑I类分子的高效基因编辑方法及其试剂。本发明使用了一种基于CRISPR/Cas9技术的RNP方法针对HLA‑I类分子进行基因编辑，改变了以往传统的通过质粒DNA进行瞬时表达的方法，具有如下优势：①该方法可以有效缩短潜在的脱靶窗口期；②该方法省去了重组质粒构建的繁琐过程，大大节约了样品制备的时间，因此具有简单快速的优点；③该方法有助于HLA通用型细胞的制备，可以将该方法用于难转染的干细胞***，总之，该方法为细胞治疗以及再生医学领域提供了全新的策略。

Description

针对HLA-I类分子的高效基因编辑方法及其试剂
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，尤其是涉及针对HLA-I类分子的高效基因编辑方法及其试剂。
背景技术
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-I类分子分布在所有有核细胞表面，作为重要的免疫应答调节分子在异基因造血干细胞移植过程中起着重要的作用。HLA-I类分子具有高度的遗传多态性，作为移植抗原可导致同种器官移植排斥反应或同种间细胞输注无效，如何克服HLA-I类抗原屏障一直是器官移植领域研究的热点。利用基因编辑方法将移植物的HLA-I类分子进行沉默表达，制备HLA通用型细胞无疑是提高移植物在异基因环境下存活率的一种方式。
早期的基因编辑技术包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录活化因子核酸酶(TALEN)技术、shRNA沉默技术等，由于存在操作繁琐、脱靶率高等问题已经逐步被淘汰。CRISPR(clustered,regularly inter-spaced,short palindromic repeats常间回文重复序列丛集)/Cas9技术是基因组靶向修饰技术，该技术通过向导RNA(gRNA)将Cas9核酸酶导向指定的基因组靶标序列。然后，Cas9产生一个双链断裂(DSB)，通过内源性细胞修复***促进特定修饰的引入。另外，该技术也可以将外源供体模板引入，通过同源定向修复(HDR)修复DSB达到对供体模板的精确序列修饰。与TALEN技术相比，具有高效、操作简单及成本低、细胞毒性小的特点。现在该技术已经成功用于多种细胞株以及动物模型的建立，可有效导致特定基因的不表达。
CRISPR/Cas9进行瞬时表达包括两种方法，一种是传统的通过质粒DNA(pDNA)进行转染；另一种方法则是通过CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)，它是使用纯化的Cas9蛋白与转录的sgRNA在体外预先形成复合物然后在进行细胞转染。尽管pDNA使用方便，但是由于通过pDNA递送的CRISPR/Cas9核酸酶活性可以持续长达72h，而通过RNP递送的核酸酶活性在24h后停滞，因此与RNP方法相比，pDNA方法增加了潜在的脱靶窗口期。此外，也有研究报道，对于一些难转染的干细胞而言，RNP方法转染后细胞总体存活率更佳。因此，使用RNP方法可以降低脱靶率和细胞毒性，尤其适用于一些难转染的细胞系。
经典的HLA-I类分子是由重链(α链)和轻链(β链)经非共价键连接成的异二聚体。α链分别由HLA-A、HLA-B、HLA-C基因编码，β链即β2微球蛋白，其主要作用是稳定HLA-I类分子并使其能有效地表达于细胞表面。理论上通过对β2微球蛋白进行基因编辑可以实现对HLA-I类分子的沉默表达。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，以HLA-I类分子的β2微球蛋白编码序列区作为靶标，选取能够作为靶点的基因片段，开发能够高效、准确实现HLA-I类分子沉默表达的基因标记方法，并提供相应的基因编辑试剂或试剂盒，以期能够用于造血移植物的开发。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供选自HLA-I类分子的β2微球蛋白编码序列区的基因片段作为靶点在(a)～(c)中任一项的应用：
(a)制备HLA通用型细胞；
(b)制备HLA-I类分子沉默表达的移植物；
(c)制备HLA-I类分子沉默表达的基因编辑试剂或基因编辑试剂盒。
在可选的实施方式中，所述细胞包括造血干细胞。
在可选的实施方式中，所述基因片段位于HLA-I类分子的β2微球蛋白的第2外显子编码区。
优选地，所述基因片段的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'。
在可选的实施方式中，所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒包括靶向所述基因片段的sgRNA和Cas 9蛋白组成的RNP复合物。
第二方面，本发明提供生物材料，包括(a)～(c)中任一项：
(a)靶向前述实施方式所述基因片段的sgRNA。
优选地，所述基因片段的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'，所述sgRNA的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGG TGCTTTT-3'。
优选地，所述sgRNA的5'的碱基GAA含有甲基化修饰，和/或，所述sgRNA的3'的最末位三个碱基TTT含有甲基化修饰。
(b)RNP复合物，包括(a)所述的sgRNA和Cas 9蛋白。
优选地，所述Cas 9蛋白带有细胞核定位信号。
优选地，所述Cas 9蛋白选自NLS-Cas9-NLS、NLS-Cas9-EGFP或Cas9-N-NLS。
优选地，所述sgRNA和Cas 9蛋白的摩尔比为1:1～4。
(c)通过将(b)所述RNP复合物转染进原始细胞系得到的转染细胞系。
优选地，所述原始细胞系包括HEK-293细胞系。
第三方面，本发明提供HLA-I类分子沉默表达的基因编辑试剂或基因编辑试剂盒，所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒包括靶向所述基因片段的sgRNA和Cas 9蛋白组成的RNP复合物。
优选地，所述基因片段的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'，所述sgRNA的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGG TGCTTTT-3'。
优选地，所述sgRNA的5'的碱基GAA含有甲基化修饰，和/或，所述sgRNA的3'的最末位三个碱基TTT含有甲基化修饰。
优选地，所述Cas 9蛋白带有细胞核定位信号。
优选地，所述Cas 9蛋白选自NLS-Cas9-NLS、NLS-Cas9-EGFP或Cas9-N-NLS。
优选地，所述sgRNA和Cas 9蛋白的摩尔比为1:1～4。
第四方面，本发明提供前述实施方式所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒的制备方法，所述制备方法包括，所述sgRNA和Cas 9蛋白孵育得到RNP复合物。
优选地，所述孵育的温度为25～37℃，孵育的时间为15～30min，可选地，为37℃下孵育15min。
优选地，所述sgRNA和Cas 9蛋白在缓冲液中孵育。
优选地，所述制备方法还包括，将得到的RNP复合物与培养基混合得到基因编辑试剂，可选地，所述培养基选自DMEM培养基、RPMI 1640培养基或StemSpan SFEM无血清培养基。
优选地，所述基因编辑试剂中Cas 9蛋白的含量为10pmol/μl～25pmol/μl，可选地为12.5pmol/μl。
第五方面，本发明提供采用前述实施方式所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒进行基因编辑的方法，所述方法包括，将前述实施方式所述RNP复合物通过电击转化进细胞内，培养得到HLA-I类分子沉默表达的细胞系。
优选地，所述细胞包括HEK-293细胞或诱导多能干细胞。
优选地，将前述实施方式所述RNP复合物加入到细胞悬液中，通过电击转化进细胞内，所述细胞悬液中的细胞浓度为1×107～5×107个/ml，可选地为1.25×107个/ml。
优选地，所述培养使用的培养基为含有5％～15％胎牛血清的DMEM培养基，进一步优选地，所述胎牛血清的浓度为10％。
第六方面，本发明提供了采用前述实施方式所述基因编辑的方法制备得到的HLA-I类分子沉默表达的细胞系。
第七方面，本发明提供了前述实施方式所述细胞系在(a)～(c)任一项中的应用：
(a)制备HLA通用型细胞；
(b)制备HLA-I类分子沉默表达的移植物；
(c)制备HLA-I类分子的沉默表达细胞标准品。
本发明提供一种针对HLA-I类分子进行高效基因编辑的RNP方法及其试剂，该方法可以有效地将细胞表面的HLA-I类分子进行沉默表达，对于制备HLA通用型细胞提供一种全新的方法，有助于解决HLA-I类抗原屏障问题，对异基因造血干细胞移植具有重要意义。
本发明使用了一种基于CRISPR/Cas9技术的RNP方法针对HLA-I类分子进行基因编辑，改变了以往传统的通过质粒DNA进行瞬时表达的方法，具有如下优势：①该方法可以有效缩短潜在的脱靶窗口期；②该方法省去了重组质粒构建的繁琐过程，大大节约了样品制备的时间，因此具有简单快速的优点；③该方法有助于HLA通用型细胞的制备，可以将该方法用于难转染的干细胞***，总之，该方法为细胞治疗以及再生医学领域提供了全新的策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中流式细胞术检测转染72小时后不同转染组HEK-293细胞表面HLA-I类分子的表达情况；
图2为实施例2中通过T7E1酶切鉴定经2％琼脂糖凝胶电泳结果；
图3为实施例2中基因测序鉴定图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
第一方面，本发明提供选自HLA-I类分子的β2微球蛋白编码序列区的基因片段作为靶点在(a)～(c)中任一项的应用：
(a)制备HLA通用型细胞；
(b)制备HLA-I类分子沉默表达的移植物；
(c)制备HLA-I类分子沉默表达的基因编辑试剂或基因编辑试剂盒。
在可选的实施方式中，所述细胞包括造血干细胞。
在可选的实施方式中，所述基因片段位于HLA-I类分子的β2微球蛋白的第2外显子编码区。
优选地，所述基因片段的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'(SEQ IDNo:1)。
在可选的实施方式中，所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒包括靶向所述基因片段的sgRNA和Cas 9蛋白组成的RNP复合物。
第二方面，本发明提供生物材料，包括(a)～(c)中任一项：
(a)靶向前述实施方式所述基因片段的sgRNA。
优选地，所述基因片段的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'，所述sgRNA的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGG TGCTTTT-3'(SEQ ID No:2)。
优选地，所述sgRNA的5'的碱基GAA含有甲基化修饰，和/或，所述sgRNA的3'的最末位三个碱基TTT含有甲基化修饰。
(b)RNP复合物，包括(a)所述的sgRNA和Cas 9蛋白。
优选地，所述Cas 9蛋白带有细胞核定位信号。
优选地，所述Cas 9蛋白选自NLS-Cas9-NLS、NLS-Cas9-EGFP或Cas9-N-NLS。
优选地，所述sgRNA和Cas 9蛋白的摩尔比为1:1～4。
(c)通过将(b)所述RNP复合物转染进原始细胞系得到的转染细胞系。
优选地，所述原始细胞系包括HEK-293细胞系。
第三方面，本发明提供HLA-I类分子沉默表达的基因编辑试剂或基因编辑试剂盒，所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒包括靶向所述基因片段的sgRNA和Cas 9蛋白组成的RNP复合物。
优选地，所述基因片段的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'，所述sgRNA的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGG TGCTTTT-3'。
优选地，所述sgRNA的5'的碱基GAA含有甲基化修饰，和/或，所述sgRNA的3'的最末位三个碱基TTT含有甲基化修饰。
优选地，所述Cas 9蛋白带有细胞核定位信号。
优选地，所述Cas 9蛋白选自NLS-Cas9-NLS、NLS-Cas9-EGFP或Cas9-N-NLS。
优选地，所述sgRNA和Cas 9蛋白的摩尔比为1:1～4。
第四方面，本发明提供前述实施方式所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒的制备方法，所述制备方法包括，所述sgRNA和Cas 9蛋白孵育得到RNP复合物。
优选地，所述孵育的温度为25～37℃，孵育的时间为15～30min，可选地为37℃下孵育15min。
优选地，所述sgRNA和Cas 9蛋白在缓冲液中孵育，可选地，所述缓冲液选自商用的电转染缓冲液。
优选地，所述制备方法还包括，将得到的RNP复合物与培养基混合得到基因编辑试剂，可选地，所述培养基选自DMEM培养基、RPMI 1640培养基或StemSpan SFEM无血清培养基。
优选地，所述基因编辑试剂中Cas 9蛋白的含量为10pmol/μl～25pmol/μl，可选地为12.5pmol/μl。
第五方面，本发明提供采用前述实施方式所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒进行基因编辑的方法，所述方法包括，将前述实施方式所述RNP复合物通过电击转化进细胞内，培养得到HLA-I类分子沉默表达的细胞系。
优选地，所述细胞包括HEK-293细胞或诱导多能干细胞。
优选地，将前述实施方式所述RNP复合物加入到细胞悬液中，通过电击转化进细胞内，所述细胞悬液中的细胞浓度为1×107～5×107个/ml，可选地为1.25×107个/ml。
优选地，所述培养使用的培养基为含有5％～15％胎牛血清的DMEM培养基，进一步优选地，所述胎牛血清的浓度为10％。
第六方面，本发明提供了采用前述实施方式所述基因编辑的方法制备得到的HLA-I类分子沉默表达的细胞系。
第七方面，本发明提供了前述实施方式所述细胞系在(a)～(c)任一项中的应用：
(a)制备HLA通用型细胞；
(b)制备HLA-I类分子沉默表达的移植物；
(c)制备HLA-I类分子的沉默表达细胞标准品。
在某次具体实施方式中，本发明在于提供一种针对HLA-I类分子的高效基因编辑方法，主要包括如下步骤：
(1)设计针对β2微球蛋白基因的gRNA序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成Easyedit sgRNA；
(2)将NLS-Cas9-NLS核酸酶与Easyedit sgRNA按照不同的摩尔比(1:1～1:4)形成不同浓度的RNP复合物；
(3)将不同浓度的RNP复合物通过核转染的方式转染培养的HEK-293细胞系，设置不加RNP复合物为对照组，其余为1:1转染组，1:2转染组，1:3转染组，1:4转染组；
(4)通过流式细胞术检测转染72h后不同转染组HEK-293细胞表面HLA-I类分子的表达水平；
(5)通过T7E1酶切的方法鉴定不同转染组HLA-I类分子的编辑作用；
(6)通过基因测序的方法验证不同转染组HLA-I类分子的编辑效率。
所述步骤(1)中β2微球蛋白基因的靶序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'；合成的Easyedit sgRNA序列如下：5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGG TGCTTTT-3'；所述sgRNA的5'的碱基GAA含有甲基化修饰，且，所述sgRNA的3'的最末位三个碱基TTT含有甲基化修饰。
所述步骤(2)中NLS-Cas9-NLS核酸酶使用量为50pmol，Easyedit sgRNA使用量为50pmol、100pmol、150pmol、200pmol或250pmol。
所述步骤(3)核转染使用的仪器是Lonza-4D***，选择的程序为CM130。
所述步骤(4)中流式细胞术检测转染72h后不同转染组HEK-293细胞表面检测到不同比例的HLA-I类分子阴性表达细胞群。
所述步骤(5)中通过T7E1酶切的方法发现不同转染组均有不同程度的切割。
所述步骤(6)中通过基因测序不同转染组均检测到套峰信号的出现。
在另一具体实施方式中，本发明提供一种针对HLA-I类分子的高效基因编辑的试剂，主要包括：
所述步骤(1)中Easyedit sgRNA是体外转录合成的针对β2微球蛋白基因sgRNA，其浓度为100pmol/μl。
所述步骤(2)中NLS-Cas9-NLS核酸酶其两端均带有细胞核定位信号,储存浓度为62.5pmol/μl。
所述步骤(3)中HEK-293细胞为正常培养生长状态良好的细胞株。
所述步骤(4)中用于流式检测的抗体是PE标记的鼠抗人HLA-ABC。
所述步骤(5)中用于T7E1酶切的方法鉴定的试剂是Biolabs公司的EnGenMutation Detection kit。
所述步骤(5)中用于扩增β2微球蛋白基因片段的扩增引物序列如下，正向引物：5'-ACACTTGGTGCCTGATATAG-3'(SEQ ID No:3)，反向引物：5'-ACCTGAAGCTGCCACAAAAG-3'(SEQ ID No:4)。
所述步骤(6)中用于基因测序的引物序列同步骤(5)中的正向引物序列SEQ IDNo:3。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1基因编辑试剂的制备
1.1针对β2微球蛋白(β2M)的第2外显子中的靶点序列(5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3')，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成Easyedit sgRNA1.5nmol，具体序列如下：5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGG TGCTTTT-3'。其中，sgRNA的5'的碱基GAA含有甲基化修饰，且，所述sgRNA的3'的最末位三个碱基TTT含有甲基化修饰。
1.2将装有Easyedit sgRNA干粉的离心管，4℃、12000rpm离心2min，确保所有的sgRNA位于管底。
1.3小心打开盖子，加入15μl TE缓冲液进行溶解，振荡15s后，12000rpm离心1min，此时sgRNA浓度为100pmol/μl。为避免反复冻融，分装成3μl/管，-20℃冰箱储存。
1.4将NLS-Cas9-NLS核酸酶与Easyedit sgRNA按照不同的摩尔比(1:1～1:4)，37℃孵育15min形成不同浓度的RNP复合物，其中NLS-Cas9-NLS核酸酶初始浓度为62.5pmol/μl，Easyedit sgRNA初始浓度为100pmol/μl，具体按照表1配制反应体系。
表1
实施例2转染培养的HEK-293细胞系
2.1将不同浓度的RNP复合物通过核转染的方式转染培养的HEK-293细胞系，具体操作如下：
(1)预热培养基：12孔板上每孔加入1ml新鲜配制的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃进行预热。
(2)准备细胞：将正常培养的HEK-293细胞系通过胰酶进行消化，用DMEM重悬细胞制备成1ml细胞悬液，调整细胞浓度为1.25×107个/ml。
(3)核转染：取16μl细胞悬液(细胞数为2×105)加入上述不同浓度的RNP复合物中，吹打混匀注意不要产生气泡，然后转移至X-Strip电转杯中。Lonza-4D***选择CM130程序进行电击，电击结束后，小心将细胞转移至12孔板内，吹打混匀，37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
2.2通过流式细胞术检测转染72h后不同转染组HEK-293细胞表面HLA-I类分子的表达水平，具体操作如下：
(1)将转染72h不同转染组的HEK-293细胞通过胰酶进行消化，制备细胞悬液；
(2)取2×105个细胞，用100μl PBS进行重悬，加入5μl PE标记的鼠抗人HLA-ABC抗体(BD Pharmingen,克隆号：G46-2.6，Cat#555553)，室温染色30min，用PBS洗涤细胞一次去除未结合的抗体，最后用500μlPBS重悬，BD FASCverse细胞仪检测，结果如图1所示，其中P2门为HLA-I类分子阴性表达的细胞群。A～E分别为对照组，1:1转染组，1:2转染组，1:3转染组，1:4转染组。可以看出，当NLS-Cas9-NLS核酸酶与Easyedit sgRNA摩尔比为1:4时，HLA-I类分子阴性表达细胞群比例最高。
2.3通过T7E1酶切的方法鉴定不同转染组HLA-I类分子的编辑作用，具体操作如下：
(1)提取DNA：收集不同转染组和对照组的细胞进行DNA提取，确保DNA质量良好。
(2)扩增β2微球蛋白基因片段：设计针对β2微球蛋白基因的扩增引物，正向引物序列为：5'-ACACTTGGTGCCTGATATAG-3'，反向引物序列为：5'-ACCTGAAGCTGCCACAAAAG-3'，扩增特异性的β2微球蛋白基因产物，按照表2配制PCR反应体系，PCR仪上设置扩增程序为：95℃预变性5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，30个循环，72℃延长10min，冷却到10℃。
表2
试剂 体积(μl)
2×Master mix 12.5
10μM正向引物 1.25
10μM反向引物 1.25
DNA 3.0
双蒸水 7.0
总体积 25.0
(3)退火形成异源双链：将250ng的PCR产物通过变性退火过程形成异源双链，按照表3配制PCR反应体系，PCR仪上设置扩增程序为：98℃预变性5min，95℃～85℃，-2℃/s，85℃～25℃，-0.1℃/s，冷却到4℃。
表3
试剂 体积(μl)
PCR产物 5.0
10×NEB Buffer 2 2.0
双蒸水 12.0
总体积 19.0
(4)异源双链酶切：将1μl T7E1酶加入上述反应体系，混匀后37℃孵育1h；然后加入1μl蛋白酶K，混匀后37℃孵育15min，灭活T7E1酶活性。
(5)2％琼脂糖凝胶电泳鉴定：取上述反应产物5μl进行电泳，140V30min，拍照观察确定编辑效率，如图2所示，除对照组外，均检测到不同的切割片段。其中泳道1～5分别为对照组，1:1转染组，1:2转染组，1:3转染组，1:4转染组，泳道M为DL 2000marker。
2.4通过基因测序的方法验证不同转染组HLA-I类分子的编辑效率，具体操作如下：
(1)扩增β2微球蛋白基因基因片段：同步骤2.3。
(2)PCR产物酶切纯化：扩增后PCR产物采用1μl虾碱性磷酸酶(SAP，1U/μl，Lot：M820A，Promega)和2μl核酸外切酶Ⅰ(Exo-Ⅰ，5U/μl，Lot：CK11011B，TaKaRa)37℃条件下进行酶切反应40min，然后80℃作用15min进行灭活。
(3)测序反应以及序列比对：将酶切纯化后的PCR产物加入50μl纯水稀释，1条寡核苷酸测序引物用纯水稀释至浓度为3.2μM，测序引物序列同扩增的正向引物，以BigDyeterminator v3.1 sequencing kit(美国ABI公司)进行测序反应，采用乙醇-醋酸钠的方法进行纯化后，在ABI 3730测序仪上进行毛细管高通量电泳测序，测序结果利用SeqScapeV2.5软件进行序列比对，结果如图3所示，可以看出，不同转染组均检测到套峰信号的出现。其中A～-E分别为对照组，1:1转染组，1:2转染组，1:3转染组，1:4转染组。红色框标记的是套峰出现情况。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.选自HLA-I类分子的β2微球蛋白编码序列区的基因片段作为靶点在(a)～(c)中任一项的应用：
(a)制备HLA通用型细胞；
(b)制备HLA-I类分子沉默表达的移植物；
(c)制备HLA-I类分子沉默表达的基因编辑试剂或基因编辑试剂盒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞包括造血干细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因片段位于HLA-I类分子的β2微球蛋白的第2外显子编码区；
优选地，所述基因片段的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒包括靶向所述基因片段的sgRNA和Cas 9蛋白组成的RNP复合物。
5.生物材料，包括(a)～(c)中任一项：
(a)靶向权利要求1所述基因片段的sgRNA；
优选地，所述基因片段的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'，所述sgRNA的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGG TGCTTTT-3'；
优选地，所述sgRNA的5'的碱基GAA含有甲基化修饰，和/或，所述sgRNA的3'的最末位三个碱基TTT含有甲基化修饰；
(b)RNP复合物，包括(a)所述的sgRNA和Cas 9蛋白；
优选地，所述Cas 9蛋白带有细胞核定位信号；
优选地，所述Cas 9蛋白选自NLS-Cas9-NLS、NLS-Cas9-EGFP或Cas9-N-NLS；
优选地，所述sgRNA和Cas 9蛋白的摩尔比为1:1～4；
(c)通过将(b)所述RNP复合物转染进原始细胞系得到的转染细胞系；
优选地，所述原始细胞系包括HEK-293细胞系。
6.HLA-I类分子沉默表达的基因编辑试剂或基因编辑试剂盒，其特征在于，所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒包括靶向所述基因片段的sgRNA和Cas 9组成的RNP复合物；
优选地，所述基因片段的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAA-3'，所述sgRNA的核苷酸序列为5'-GAAGTTGACTTACTGAAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA AAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGG TGCTTTT-3'；
优选地，所述sgRNA的5'的碱基GAA含有甲基化修饰，和/或，所述sgRNA的3'的最末位三个碱基TTT含有甲基化修饰；
优选地，所述Cas 9蛋白带有细胞核定位信号；
优选地，所述Cas 9蛋白选自NLS-Cas9-NLS、NLS-Cas9-EGFP或Cas9-N-NLS；
优选地，所述sgRNA和Cas 9蛋白的摩尔比为1:1～4。
7.权利要求6所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，所述sgRNA和Cas 9蛋白孵育得到RNP复合物；
优选地，所述孵育的温度为25～37℃，孵育的时间为15～30min，可选地，为37℃下孵育15min；
优选地，所述sgRNA和Cas 9蛋白在缓冲液中孵育；
优选地，所述制备方法还包括，将得到的RNP复合物与培养基混合得到基因编辑试剂，可选地，所述培养基选自DMEM培养基、RPMI 1640培养基或StemSpan SFEM无血清培养基；
优选地，所述基因编辑试剂中Cas 9蛋白的含量为10pmol/μl～25pmol/μl，可选地为12.5pmol/μl。
8.采用权利要求6所述基因编辑试剂或基因编辑试剂盒进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括，将权利要求6所述RNP复合物通过电击转化进细胞内，培养得到HLA-I类分子沉默表达的细胞系；
优选地，所述细胞包括HEK-293细胞或诱导多能干细胞；
优选地，将权利要求6所述RNP复合物加入到细胞悬液中，通过电击转化进细胞内，所述细胞悬液中的细胞浓度为1×107～5×107个/ml，可选地为1.25×107个/ml；
优选地，所述培养使用的培养基为含有5％～15％胎牛血清的DMEM培养基，进一步优选地，所述胎牛血清的浓度为10％。
9.采用权利要求8所述基因编辑的方法制备得到的HLA-I类分子沉默表达的细胞系。
10.权利要求9所述细胞系在(a)～(c)任一项中的应用：
(a)制备HLA通用型细胞；
(b)制备HLA-I类分子沉默表达的移植物；
(c)制备HLA-I类分子的沉默表达细胞标准品。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110616233A (zh) * 2018-06-20 2019-12-27 西安桑尼赛尔生物医药有限公司 CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用
CN114807126A (zh) * 2021-01-22 2022-07-29 清华大学深圳国际研究生院 一种沉默长非编码rna表达的方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110616233A (zh) * 2018-06-20 2019-12-27 西安桑尼赛尔生物医药有限公司 CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用
CN114807126A (zh) * 2021-01-22 2022-07-29 清华大学深圳国际研究生院 一种沉默长非编码rna表达的方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WALEED M. ET AL.: ""Simple, fast and efficient iTOP-mediated delivery of CRISPR/Cas9 RNP in difficult-to-transduce human cells including primary T cells"", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》, vol. 338, pages 72 *
YI-LI MIN ET AL.: ""CRISPR-Cas9 corrects Duchenne muscular dystrophy exon 44 deletion mutations in mice and human cells"", 《SCIENCE ADVANCES》, vol. 5, pages 8 *
李戊玲 等: ""利用CRISPR/Cas9技术制备B2M–细胞模型"", 《中国细胞生物学学报》, vol. 40, no. 8, pages 1326 *

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