CN110604033B - 一种防治蔬菜软腐病基质的制备方法及其应用 - Google Patents

一种防治蔬菜软腐病基质的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种防治蔬菜软腐病基质的制备方法及其应用，属于防治蔬菜软腐病的技术领域。首先粳米和玉米消毒，粉碎，过筛；然后分别与水按照1:(0.1‑0.3)的质量比混合后作为粳米培养基和玉米培养基，按照1g粳米培养基接种105‑108个红曲霉孢子接种，1g玉米培养基接种105‑108个米曲霉孢子接种，25‑40℃发酵6‑15天，得到粳米发酵产物和玉米发酵产物；将玉米发酵产物和粳米发酵产物混合，得到防治蔬菜软腐病基质；具体应用：先在沟槽按照防治蔬菜软腐病基质与种子质量比为(50‑500):1或5g‑30g/穴播撒防治蔬菜软腐病基质，再撒播蔬菜种子或栽植秧苗，对蔬菜软腐病的防效率可达88.5％以上。

Description

一种防治蔬菜软腐病基质的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于防治蔬菜病害的技术领域，涉及防治蔬菜软腐病的技术，具体涉及一种防治蔬菜软腐病基质的制备方法，以及制备得到的防治蔬菜软腐病基质的应用。
背景技术
软腐病由欧氏杆菌属(Erwinia)细菌和根霉属(Rhizopus)真菌引起，可使植物的组织或器官发生腐烂。病菌均为弱寄生菌，主要危害植物的多汁肥厚的器官，如块根、块茎、果实、茎基等；并且病菌主要随同病株和病残体在土壤、堆肥、菜窖或留种株上传染繁殖，还可借助昆虫、灌溉水及风雨冲溅，从植株伤口侵入。咀嚼式口器昆虫密度大、早播株衰、多雨湿热气候、土壤干裂伤根、肥料未腐熟地块连作、植株自然裂口多及黑腐病严重，都是软腐病发生的有利条件。发病不限于田间,运输途中和贮藏期间也有发生，软腐病大面积发生时可导致蔬菜减产或绝收，危害的作物种类甚多，如甘蓝类、白菜类、萝卜、胡萝卜、马铃薯、番茄、辣椒、大葱、洋葱、芹菜、莴苣、菜花等。
粳米是用粳型非糯性稻谷碾制成的米，唐代医药家孙思邈在《千金方·食治》中强调，粳米能养胃气、长肌肉；《食鉴本草》也认为，粳米有补脾胃、养五脏、壮气力的良好功效。粳米中含有丰富蛋白质，还含有脂肪、钙磷、铁及B族维生素等多种营养成分。玉米面含有丰富的营养素。在美国和其他一些发达国家，玉米已被列为谷类食物中的首位保健食品，被称为“黄金作物”。经研究发现玉米中含有大量的卵磷脂、亚油酸、谷物醇、维生素E、纤维素等，具有降血压、降血脂、抗动脉硬化、预防肠癌、美容养颜、延缓衰老等多种保健功效。古人用红曲保存食物，《天工开物》中有利用红曲保存肉色10日不腐的记载。紫红曲霉能产生抗菌活性物质，对金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌有较强的抑制作用，对绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌有抑制作用。米曲霉(Aspergillus oryzae)可产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种酶类，将大分子物质降解为小分子氨基酸，提高原料利用率，广泛用于酿造工业。
现有技术主要在发病前和发病初进行药剂防治，在靠近地面的叶柄基部和茎基部喷施农用链霉素或新植霉素、敌克松原粉、代森铵、氢氧化铜、氯霉素等，但目前的防治效果不理想：防治效果差，并且已用的防止软腐病的抗生素昂贵，还会出现抗药性问题。防止软腐病发生有效措施是发现或生产防治效率高的制剂或基质，基于此，研究防治蔬菜软腐病的基质具有重要的现实意义。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种防治蔬菜软腐病基质的制备方法，以及用其制备方法制备的防治蔬菜软腐病基质的应用，使用该基质对蔬菜软腐病的防效率可达88.5％以上。
本发明为实现其目的采用的技术方案是：一种防治蔬菜软腐病基质的制备方法，以粳米和玉米作为固态基质进行发酵，关键在于，包括如下步骤：
A、对粳米和玉米消毒，粉碎，过筛；
B、粳米发酵产物：粳米与水按照1:(0.1-0.3)的质量比混合后作为粳米培养基，按照1g粳米培养基接种105-108个红曲霉孢子进行接种，25-40℃发酵6-15天，得到粳米发酵产物；
玉米发酵产物：玉米与水按照1:(0.1-0.3)的质量比混合后作为玉米培养基，按照1g玉米培养基接种105-108个米曲霉孢子进行接种，25-40℃发酵6-15天，得到玉米发酵产物；
C、将玉米发酵产物和粳米发酵产物混合，得到防治蔬菜软腐病基质。
进一步地，所述步骤A中对粳米和玉米消毒采用1％质量分数的石灰水浸泡4h或1％质量分数的碳酸氢钠水溶液浸泡3-3.5h，然后用清水冲洗。
进一步地，所述步骤A中过筛包括过15-25目筛。
如上述方法制备的防治蔬菜软腐病基质的应用，其特征在于，包括以下步骤：
I、按上述制备方法制备得到防治蔬菜软腐病基质；
II、先在土壤沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，然后再撒播蔬菜种子或定植秧苗，其中防治蔬菜软腐病基质与种子的质量比为(50-500):1，或按照5g-30g/穴播撒防治蔬菜软腐病基质。
进一步地，所述的蔬菜包括十字花科、茄科、伞形科、百合科。
进一步地，所述的蔬菜包括甘蓝、白菜、萝卜、菜花、马铃薯、番茄、辣椒、胡萝卜、芹菜、大葱、洋葱。
本发明的有益效果是：
本发明所述的防治蔬菜软腐病基质的制备方法简单经济，并且使用本发明所述的防治蔬菜软腐病基质对蔬菜软腐病的防效率可达88.5％以上。
发明人经过研究发现只有以粳米面为原料发酵红曲霉，以玉米面为原料发酵米曲霉，所得发酵产物对软腐病有较强的抑制作用。红曲霉和米曲霉分别作为发酵优势菌，可有效避免有害微生物如黄曲霉的浸染，防止黄曲霉毒素等有害物质的产生。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明。
一、具体实施例
紫红曲霉(Monascuspurpureus)CGMCC 3.15541、米曲霉(Aspergillus oryzae)CGMCC3.7203，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
紫红曲霉扩大培养：
紫红曲霉培养液：按质量百分比计，葡萄糖5％、酵母膏0.1％、MgSO4·7H2O0.05％、KH2PO4 0.1％、FeSO4·7H2O 0.001％，余量为蒸馏水，pH 6.0；500ml三角瓶中装紫红曲霉培养液120ml，接种紫红曲霉孢子，接种量为紫红曲霉培养液体积的10％，30℃恒温摇床上振荡培养6天，转速为180r/min，收集紫红曲霉孢子，调整紫红曲霉孢子浓度为108个/mL。
米曲霉扩大培养：
PDA液体培养基：取新鲜马铃薯，去皮，称取300g，切碎，放入900mL沸腾的蒸馏水中，浸泡并不断搅拌1h，用6层纱布过滤，加入20g葡萄糖，待完全溶解后补足蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min；PDA液体培养基接种米曲霉孢子，接种量为PDA液体培养基体积的5％，在29℃、180r/min摇床中培养3天，收集米曲霉孢子，调整米曲霉孢子浓度为108个/mL。
实施例1
A、称量粳米500g，用1％质量分数的石灰水500ml浸泡4h消毒，清水冲洗，粉碎，过22目筛；
称量玉米500g，用1％质量分数的石灰水500ml浸泡4h消毒，清水冲洗，粉碎，过25目筛；
B、粳米发酵产物：过筛后的粳米加入50ml水混合后作为粳米培养基，按照1g粳米培养基接种106个紫红曲霉孢子进行接种，28℃自然发酵6天，得到粳米发酵产物；
玉米发酵产物：过筛后的玉米加入50ml水混合后作为玉米培养基，按照1g玉米培养基接种108个米曲霉孢子进行接种，30℃自然发酵6天，得到玉米发酵产物；
C、将玉米发酵产物和粳米发酵产物以质量比10：1混合，自然阴干，得到防治蔬菜软腐病基质。
防治效果试验：先在沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，用量为每穴10g，然后定植移栽菜花。移栽后50天进行田间调查。
实施例2
A、称量粳米500g，用1％质量分数的石灰水500ml浸泡4h消毒，清水冲洗，粉碎，过15目筛；
称量玉米500g，用1％质量分数的石灰水500ml浸泡4h消毒，清水冲洗，粉碎，过15目筛；
B、粳米发酵产物：过筛后的粳米加入50ml水混合后作为粳米培养基，按照1g粳米培养基接种105个紫红曲霉孢子进行接种，28℃自然发酵15天，得到粳米发酵产物；
玉米发酵产物：过筛后的玉米加入50ml水混合后作为玉米培养基，按照1g玉米培养基接种105个米曲霉孢子进行接种，30℃自然发酵15天，得到玉米发酵产物；
C、将玉米发酵产物和粳米发酵产物以质量比20：1混合，自然阴干，得到防治蔬菜软腐病基质。
防治效果试验：先在沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，再撒播大白菜种子，基质质量为大白菜种子的500倍，播种后60天进行田间调查。
实施例3
A、称量粳米500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3.5h消毒，清水冲洗，粉碎，过25目筛；
称量玉米500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3.5h消毒，清水冲洗，粉碎，过25目筛；
B、粳米发酵产物：过筛后的粳米加入60ml水混合后作为粳米培养基，按照1g粳米培养基接种106个紫红曲霉孢子进行接种，30℃自然发酵8天，得到粳米发酵产物；
玉米发酵产物：过筛后的玉米加入60ml水混合后作为玉米培养基，按照1g玉米培养基接种106个米曲霉孢子进行接种，25℃自然发酵8天，得到玉米发酵产物；
C、将玉米发酵产物和粳米发酵产物以质量比1：10混合，自然阴干，得到防治蔬菜软腐病基质。
防治效果试验：先在沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，用量为每穴20g，然后定植莴苣，移栽后50天进行田间调查。
实施例4
A、称量粳米500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3h消毒，清水冲洗，粉碎，过20目筛；
称量玉米500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3h消毒，清水冲洗，粉碎，过20目筛；
B、粳米发酵产物：过筛后的粳米加入70ml水混合后作为粳米培养基，按照1g粳米培养基接种108个红曲霉孢子进行接种，32℃自然发酵10天，得到粳米发酵产物；
玉米发酵产物：过筛后的玉米加入70ml水混合后作为玉米培养基，按照1g玉米培养基接种108个米曲霉孢子进行接种，32℃自然发酵10天，得到玉米发酵产物；
C、将玉米发酵产物和粳米发酵产物以质量比3：5混合，自然阴干，得到防治蔬菜软腐病基质。
防治效果试验：先在沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，再撒播甘蓝种子，基质用量为每穴20g，播种后60天进行田间调查。
实施例5
A、称量粳米500g，用1％质量分数的石灰水500ml浸泡4h消毒，清水冲洗，粉碎，过15目筛；
称量玉米500g，用1％质量分数的石灰水500ml浸泡4h消毒，清水冲洗，粉碎，过15目筛；
B、粳米发酵产物：过筛后的粳米加入150ml水混合后作为粳米培养基，按照1g粳米培养基接种105个紫红曲霉孢子进行接种，25℃自然发酵15天，得到粳米发酵产物；
玉米发酵产物：过筛后的玉米加入150ml水混合后作为玉米培养基，按照1g玉米培养基接种105个米曲霉孢子进行接种，40℃自然发酵10天，得到玉米发酵产物；
C、将玉米发酵产物和粳米发酵产物以质量比1：1混合，自然阴干，得到防治蔬菜软腐病基质。
防治效果试验：先在沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，再撒播大白菜种子，基质质量为大白菜种子的50倍，播种后60天进行田间调查。
实施例6
A、称量粳米500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3h消毒，清水冲洗，粉碎，过20目筛；
称量玉米500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3h消毒，清水冲洗，粉碎，过20目筛；
B、粳米发酵产物：过筛后的粳米加入100ml水混合后作为粳米培养基，按照1g粳米培养基接种108个红曲霉孢子进行接种，40℃自然发酵10天，得到粳米发酵产物；
玉米发酵产物：过筛后的玉米加入100ml水混合后作为玉米培养基，按照1g玉米培养基接种108个米曲霉孢子进行接种，25℃自然发酵10天，得到玉米发酵产物；
C、将玉米发酵产物和粳米发酵产物以质量比9：5混合，自然阴干，得到防治蔬菜软腐病基质。
防治效果试验：先在沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，再撒播甘蓝种子，基质用量为每穴5g，播种后60天进行田间调查。
实施例7
A、称量粳米500g，用1％质量分数的石灰水500ml浸泡4h消毒，清水冲洗，粉碎，过22目筛；
称量玉米500g，用1％质量分数的石灰水500ml浸泡4h消毒，清水冲洗，粉碎，过25目筛；
B、粳米发酵产物：过筛后的粳米加入50ml水混合后作为粳米培养基，按照1g粳米培养基接种106个紫红曲霉孢子进行接种，30℃自然发酵15天，得到粳米发酵产物；
玉米发酵产物：过筛后的玉米加入50ml水混合后作为玉米培养基，按照1g玉米培养基接种108个米曲霉孢子进行接种，25℃自然发酵6天，得到玉米发酵产物；
C、将玉米发酵产物和粳米发酵产物以质量比5：1混合，自然阴干，得到防治蔬菜软腐病基质。
防治效果试验：先在沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，用量为每穴30g，然后定植移栽菜花。移栽后50天进行田间调查。
对比例1
A、称量大米500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3h消毒，清水冲洗，粉碎，过20目筛；
称量小麦500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3h消毒，清水冲洗，粉碎，过20目筛；
B、大米发酵产物：过筛后的大米加入70ml水混合后作为大米培养基，按照1g大米培养基接种108个紫红曲霉孢子进行接种，32℃自然发酵10天，得到大米发酵产物；
小麦发酵产物：过筛后的小麦加入70ml水混合后作为小麦培养基，按照1g小麦培养基接种108个米曲霉孢子进行接种，32℃自然发酵10天，得到小麦发酵产物；
C、将大米发酵产物和小麦发酵产物以质量比3：5混合，自然阴干，得到防治蔬菜软腐病基质。
防治效果试验：先在沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，再撒播甘蓝种子，基质用量为每穴20g，播种后60天进行田间调查。
对比例2
A、称量大米500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3h消毒，清水冲洗，粉碎，过20目筛；
称量大豆500g，用1％质量分数的碳酸氢钠水溶液500ml浸泡3h消毒，清水冲洗，粉碎，过20目筛；
B、大米发酵产物：过筛后的大米加入70ml水混合后作为大米培养基，按照1g大米培养基接种108个紫红曲霉孢子进行接种，32℃自然发酵10天，得到大米发酵产物；
大豆发酵产物：过筛后的大豆加入70ml水混合后作为大豆培养基，按照1g大豆培养基接种108个米曲霉孢子进行接种，32℃自然发酵10天，得到大豆发酵产物；
C、将大米发酵产物和大豆发酵产物以质量比3：5混合，自然阴干，得到防治蔬菜软腐病基质。
防治效果试验：先在沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，再撒播甘蓝种子，基质用量为每穴20g，播种后60天进行田间调查。
二、应用试验
1.基质对土壤微生物的影响
2018年以实施例1-7和对比例1-2进行试验，各实施例试验田收获后，每颗蔬菜周围直径10cm、深度20cm取土样，对照组不使用基质，其他条件同实施例1-7和对比例2，每个实施例各取10组土样，结果取平均值。采用稀释平板法来计数土壤中的细菌、放线菌、真菌、好气性纤维素菌、固氮菌数量、嫌气性纤维素菌、固氮菌、厌气性纤维素数量，见表1。
其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基于37℃下培养24h；牛肉膏蛋白胨培养基组成：3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g NaCl，20g琼脂，1000ml水，pH：7.5；
放线菌采用高氏一号培养基于37℃下培养24h，高氏一号培养基组成：2g可溶性淀粉，0.1g KNO3，0.05g K2HPO4，0.05gMgSO4·7H2O，0.05g NaCl，0.001g FeSO4·7H2O，2g琼脂，100ml水，pH 7.2；
真菌采用马丁孟加拉红-抗生素培养基于28℃培养48h；马丁孟加拉红-抗生素培养基组成：5g蛋白胨，10g葡萄糖，1g KH2PO4，0.5g MgSO4·7H2O，20g琼脂，100mL 1/3000浓度的孟加拉红溶液，1000mL蒸馏水，0.1g氯霉素；
好气性纤维素菌采用纤维素分解菌培养基于37℃培养24h；纤维素分解菌培养基组成：1.00g KH2PO4；0.3g MgSO4；0.1g NaCl；2.5g NaNO3；0.1g CaCl2·6H2O；0.01g FeCl3；20g稻草粉；自然pH；
固氮菌采用固氮菌培养基于37℃培养24h；固氮菌培养基组成：0.2g KH2PO4,0.8gK2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.1g CaSO4·2H2O，0.0001g Na2MoO4·2H2O，0.5g酵母膏，20g甘露醇，0.0001gFeCl3，1000ml蒸馏水，15g琼脂；pH 7.2；
嫌气性纤维素菌采用纤维素分解菌培养基于37℃厌氧培养30天；纤维素分解菌培养基组成：1.00gKH2PO4；0.3gMgSO4；0.1gNaCl；2.5gNaNO3；0.1gCaCl2·6H2O；0.01gFeCl3；20g稻草粉；自然pH。
表1基质对土壤三大类微生物数量的影响
Figure BDA0002260192810000111
Figure BDA0002260192810000121
由上表可知，结果：使用实施例1-7基质的土壤放线菌数量明显增加，细菌数量明显降低，真菌数量无明显变化。
2.基质对对蔬菜软腐病的防效
每个实施例设置蔬菜试验区，试验区内划分十个小区，每个小区50株。对照组不使用基质，对照和实施例在生长期内栽培技术及其他农事管理措施按相同的常规方法进行。播种后60天或移栽后50天调查田间病害发生情况，调查方法为随机选择4个小区，进行4次重复试验，记载发病株数、病害的严重度，结果取平均值，以株为单位进行病情分级，并计算发病率和病情指数，调查结果见表2。
病害分级标准(以整株为指标):
0级，无症状；
1级，叶片始见水渍状褐色病斑；
3级，底部第1-2叶片基部有明显病斑；
5级，外部叶片有1/3～1/2腐烂；
7级，外部叶片全部腐烂；
9级，整株腐烂。
发病率＝(发病株数/调查株数)×100％
病情指数＝[∑(各级病株数×相对级数值)/调查总株数×最高级值]×100％防治效果＝[(空白对照区病情指数-处理区病情指数)/空白对照区病情指数]×100％
表2不同实施例对蔬菜软腐病的防效
Figure BDA0002260192810000131

Claims (5)

1.一种防治蔬菜软腐病基质的制备方法，以粳米和玉米作为固态基质进行发酵，其特征在于，包括如下步骤：
A、对粳米和玉米消毒，粉碎，过筛；
B、粳米发酵产物：粳米与水按照1:（0.1-0.3）的质量比混合后作为粳米培养基，按照1g粳米培养基接种105-108个红曲霉孢子进行接种，25-40℃发酵6-15天，得到粳米发酵产物；
玉米发酵产物：玉米与水按照1:（0.1-0.3）的质量比混合后作为玉米培养基，按照1g玉米培养基接种105-108个米曲霉孢子进行接种，25-40℃发酵6-15天，得到玉米发酵产物；
C、将玉米发酵产物和粳米发酵产物混合，得到防治蔬菜软腐病基质；
所述步骤 A 中对粳米和玉米消毒采用 1%质量分数的石灰水浸泡 4h 或1%质量分数的碳酸氢钠水溶液浸泡3-3.5h，然后用清水冲洗。
2.根据权利要求 1 所述的防治蔬菜软腐病基质的制备方法，其特征在于，所述步骤 A中过筛包括过 15-25 目筛。
3.如权利要求 1 所述方法制备的防治蔬菜软腐病基质的应用，其特征在于，包括以下步骤：
I、按权利要求1的制备方法制备得到防治蔬菜软腐病基质；
II、先在土壤沟槽播撒防治蔬菜软腐病基质，然后再撒播蔬菜种子或定植秧苗，其中防治蔬菜软腐病基质与种子的质量比为（50-500）:1，或按照5g-30g/穴播撒防治蔬菜软腐病基质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的蔬菜包括十字花科、茄科、伞形科和百合科。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的蔬菜包括甘蓝、白菜、萝卜、菜花、马铃薯、番茄、辣椒、胡萝卜、芹菜、大葱和洋葱。
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