CN105340883A - 一种黑曲霉微丸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用黑曲霉微丸对魔芋白绢病和软腐病进行防治，所述黑曲霉(Aspergillus？niger？xj)：由贵州大学真菌资源研究所分离，现保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO：M206021。所述黑曲霉微丸含有黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂、微晶纤维素(MCC)、乳糖和羟丙基甲基纤维素，其可用于魔芋白绢病和软腐病防治。

Description

一种黑曲霉微丸
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及黑曲霉(Aspergillusnigerxj)微丸及其制备方法。
背景技术
黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。本申请是利用黑曲霉在生长过程中所产生的次生代谢产物来对白绢病菌、软腐病菌进行抑制。白绢病又称菌核性根腐病和菌核性苗枯病，危害苗木和幼树的根茎部。该病可危害多种植物，主要为害油茶、油桐、楸树、柑桔、苹果、梧桐、泡桐、核桃、马尾松等多种树种，还可引起花生，大葱等许多农作物发病。软腐病可使植物的组织或器官发生腐烂。病菌均为弱寄生菌，主要为害植物的多汁肥厚的器官，如块根、块茎、果实、茎基等。发病不限于田间，运输途中和贮藏期间也有发生，且为害更重。为害的作物种类甚多。本发明主要针对魔芋白绢病、软腐病。
黑曲霉发酵液虽然有良好的抗菌活性，但因其液体的性质不宜大量储存与运输，长期储存时如保藏不当更会被杂菌污染，对生防效果及植物生长产生未知的危害，因此我们对黑曲霉发酵液产品进行了进一步的加工和优化。
根据魔芋生长及大田生防的具体情况，将黑曲霉发酵液加工成生防微丸缓释剂。微丸缓释剂，以缓控释理论为基础，应用现代药用新辅料、制备技术和设备制备直径在0.5-1.5mm范围内的球形或类球形制剂，发挥平稳、持久、安全有效的作用。微丸直接施用后既能满足首剂量要求的抑菌浓度，亦能产生维持剂量的抑菌浓度，且抑菌浓度曲线平稳，有重演性，缓释时间长达72h。根据白绢菌、软腐病生长繁殖的特点，在雨后高热高湿的环境中能稳定释放，有效抑制病原菌的增殖，在人力物力有限的情况下能最大限度的防止魔芋白绢病、软腐病的发生。采用30％黑曲霉发酵产物微丸缓释剂在有效剂量1.3g/m3下对白绢病菌、软腐病菌的平均防效分别在77.52％、95.92％，具有较强的抑制作用。本发明人目的在于提供一种易于生产、剂型加工，又利于存活的拮抗菌制剂，将其用于魔芋白绢病，软腐病防治。
所述拮抗菌为黑曲霉(Aspergillusnigerxj)由贵州大学真菌资源研究所分离，已经于2006年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO：M206021
发明内容
本发明所要解决的技术问题是解决稳定性和药效最优化，并且实现黑曲霉的可控制释放。
本发明提供了一种稳定的黑曲霉微丸。
本发明还提供了所述黑曲霉微丸的生产方法。
本发明还提供了所述黑曲霉微丸的使用方法。
本发明还提供了所述黑曲霉微丸可用于防治白绢病，软腐病。
为了实现上述目的，本发明提供了一种拮抗菌，所述拮抗菌为黑曲霉(Aspergillusnigerxj)由贵州大学真菌资源研究所分离，已经于2006年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO：M206021。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：
一种黑曲霉微丸，其包括下述组分：黑曲霉、微晶纤维素、乳糖、羟丙基甲基纤维素。
优选地，黑曲霉为黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂。
优选地，黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂10～40重量份、微晶纤维素10～45重量份、乳糖15～50重量份和羟丙基甲基纤维素1～10重量份。
优选地，黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂30重量份、微晶纤维素32重量份、乳糖35重量份和羟丙基甲基纤维素3重量份。
其中，黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂是通过下述方法制备得到：
A.取灭菌发酵液过滤，在25℃浓缩至相对密度为1.12，喷雾干燥，干燥条件为：进风温度150℃；排气温度95℃；流速20mL/s；
或
B.取灭菌发酵液过滤，在25℃浓缩至相对密度为1.12，置70℃烘箱中，鼓风干燥36h，取出后使用高速粉碎机粉碎，过100目筛既得。
所述的微丸可用于防治魔芋白绢病和软腐病。
当防治防治魔芋白绢病时：将黑曲霉微丸菌剂与基质按1∶80～120混匀，种植时将菌剂灌根，之后每隔30天灌根一次，待魔芋收获后，应在大田大面积喷洒3-5次。
当防治防治魔芋软腐病时：将黑曲霉微丸菌剂与基质按1∶400～600混匀，种植时将菌剂灌根，之后每隔30天灌根一次。
实施例
本发明根据下述实施例做进一步的描述，本领域技术人员可以明了的是，下述实施例对本发明仅仅起到说明的作用。在不背离本发明精神的前提下，对本发明所做的任意改进和替代均在本发明保护的范围之内。
使用的仪器和试药：球型微丸造粒机，华东理工大学机械工业研究院；标准检验筛，浙江省上虞县纱筛厂；CJY-300脆碎度测定仪，上海黄海药检仪器厂)。微晶纤维素(MCC)，常熟药用辅料厂；乳糖，北京奥博星生物技术责任有限公司；羟丙基甲基纤维素(HPMCK4M)，山东泰安瑞泰纤维素有限公司；95％乙醇，沈阳试剂一厂；所述拮抗菌为黑曲霉(Aspergillusnigerxj)由贵州大学真菌资源研究所提供，其发酵液按照现有技术中方法进行制备。
实施例1：缓释微丸的制备
黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂制备：
A.取灭菌发酵液过滤，浓缩至相对密度为1.12(25℃)，喷雾干燥，干燥条件为：进风温度150℃；排气温度95℃；流速20mL/s。
利用喷雾干燥及在进风温度150℃；排气温度95℃；流速20mL/s下对黑曲霉发酵液进行浓缩干燥加工，采用空气经过滤和加热，进入干燥器顶部空气分配器，热空气呈螺旋状均匀地进入干燥室。料液经塔体顶部的高速离心雾化器，(旋转)喷雾成极细微的雾状液珠，与热空气并流接触在极短的时间内可干燥为成品。产品具有良好的均匀度、流动性和溶解性，产品纯度高，质量好。生产过程简化，操作控制方便。对于含湿量40-60％(特殊物料可达90％)的液体能一次干燥成粉粒产品，干燥后不需粉碎和筛选，减少生产工序，提高产品纯度。对产品粒径，松密度，水份，在一定范围内可通过改变操作条件进行调整，控制和管理都很方便。
或
B.取灭菌发酵液过滤，浓缩至相对密度为1.12(25℃)，置70℃烘箱中，鼓风干燥36h，取出后使用高速粉碎机粉碎，过100目筛既得。
发酵液高温鼓风干燥技术：利用鼓风烘箱在烘箱温度70℃，鼓风干燥时间36h，对黑曲霉发酵液进行浓缩干燥加工。高温鼓风干燥箱的采用进口多个大功率风机，双风道式热循环***，将不锈钢高温电加热器通过风循环，快速加热工作室内，使产品迅速干燥，取出后使用高速粉碎机粉碎，过100目筛既得。
微丸制备：
黑曲霉微丸由下列组分按重量百分比组成：
过筛混匀用适量的质量分数为30％的50mL乙醇水溶液作为黏合剂制粒得到湿度适中的湿物料，干燥即得。
实施例2：缓释微丸的制备
按照实施例1相同的方法进行制备，不同之处在于采用下述重量份的组分：
过筛混匀用适量的质量分数为30％的50mL乙醇水溶液作为黏合剂制粒得到湿度适中的湿物料，干燥即得。
实施例3：缓释微丸的制备
按照实施例1相同的方法进行制备，不同之处在于采用下述重量份的组分：
过筛混匀用适量的质量分数为30％的80mL乙醇水溶液作为黏合剂制粒得到湿度适中的湿物料，干燥即得。
实施例4：微丸粉体学性质的质量评价
微丸质量评价参数以粒径和粒径分布、堆密度、表面形态和圆整度、脆碎度为指标，除粒径分布指标外，其它各指标均以20-24目粒径的丸核为对象进行考察。
粒径和粒径分布：采用筛分析法，将最终产品过筛收集一系列筛目下的微丸，计算收率。
堆密度：取适量定量丸核使其缓缓通过一玻璃漏斗，倾倒至一量筒内，测定微丸的松容积，计算微丸的堆密度。
表面形态和圆整度：由目测法观察判定微丸的表面形态。挤出微丸呈棒状打分为1，微丸呈哑铃形打分为2，微丸呈椭球形打分为3，微丸呈球形打分为4，打分越高，表明微丸表面形态越好，圆整度越高。采用测定微丸的平面临界稳定性(one-plane-critical-stability，简称OPCS)反映圆整度，将1g微丸置一平板上，将平板一侧抬起，测量微丸开始滚动前倾斜平面与水平所夹的角(Φ)。Φ越小表明圆整度越好。
休止角的测定：休止角是表示微丸流动性的最常用方法之一。本实验休止角的测量是将定量丸核在指定高度从带有直径1.25cm小孔的漏斗中落到硬平面后，测量丸核的堆积高度(H)和堆积半径(r)，计算tgα＝H/r。α即为休止角。由休止角间接衡量圆整度。休止角越小，说明圆整度越好。
脆碎度：脆碎度是衡量微丸剥落趋势的指标。测定方法是取定量丸核加25粒直径为7～的玻璃珠一起置脆碎仪中旋转10分钟，收集并称定通过80目筛的细粉量，计算丸核失重百分率。
实施例5：工艺因素对微丸制备的影响
以实施例1制备的微丸，进行下列各项因素的考察实验。
挤出机挤出速度的影响：将湿物料置于轴式单螺纹挤出装置的漏斗上，于10、30、40r/m下挤出，然后置滚圆机中滚圆速度1000r/m，滚圆10min后收集微丸，将微丸置烘箱40℃12h至烘干。考察挤出速度对湿物料的表面状态、挤出时间和微丸质量的影响。挤出速度为10r/m时，一定物料需要挤出的时间过长，产生摩擦热量多，使挤出物的热塑性过大结果呈弯曲状，无法进行滚圆操作，当挤出速度在30r/m和40r/m时对微丸的质量没有明显影响。基于节约能源及安全的考虑，选取挤出速度为30r/m。
滚圆速度的影响：在其它制备工艺一致的条件下，考察挤出物在1000、1200、1400r/m的滚圆速度下，对微丸进行质量评价。滚圆速度对粒径分布影响显著，当滚圆速度增大时，微丸的粒径分布变宽且粒径变大。当滚圆速度控制在1200r/m时目标粒径20～24目的微丸产率最高，达到82.45％。当滚圆速度1000r/m时，微丸呈哑铃形，外观较差，且微丸的流动性相对于其它两条件也稍差，目标产率为41.23％。在本实验条件下，微丸的脆碎度均较小，满足包衣对微丸机械强度的要求。
滚圆时间的影响：在挤出机速度为30r/m，滚圆速度1200r/m条件下，分别考察不同滚圆时间5、10、15min对微丸制备结果的影响。滚圆时间对粒径和圆整度有明显影响，在挤出速度为30r/m，滚圆速度为1200r/m，滚圆时间为5min时，挤出物仅形成哑铃形；当时间延长至10min时，微丸的粒径主要分布在20-24目且圆整度变好，目标得率为84.21％；但当滚圆时间为15min时，出现更多的大粒径微丸。随着滚圆时间的延长微丸的脆碎度减小。
润湿剂的影响：分别用水、15％乙醇、30％乙醇、45％乙醇为润湿剂考察对微丸质量的影响。用10％乙醇、20％乙醇作润湿剂时，挤出物粘度过高，经滚圆后，均有大量微丸的粘附在滚圆锅壁上，原因是水粘性太大，使物料间产生了足够的粘性无法从壁上脱落，造成造成滚圆的失败。由此可知，水分量对微丸的制备有明显影响。乙醇含量达到30％时，微丸的粒径主要分布在20-24目且圆整度变好，目标得率为85.84％。当使用40％的乙醇溶液时，滚圆结果呈棒状颗粒，脆碎度大；水量增大时，微丸粒径变大，圆整度提高，脆碎度减小。故选择以30％的乙醇溶液为润湿剂制备微丸。
流化床鼓风流量的控制：本实验采用吹风机为550w，转数2700r/min，鼓风量580L/min，风压为1210Pa。采用在吹风机处加挡板和流化床顶部放有一定孔径的筛网，调节风量在流化筒内的大小，当使30g微丸至置于流化床吹起15-20cm时，挡板位于距全封闭状态1.6cm，顶部筛网的孔径大小为32目。
实施例6：配方因素对微丸制备及抗菌物质释放的影响
配方中成球辅料种类的影响：选择MCC、MCC+HPMC(10∶1，11∶1，12∶1)、交联Na-CMC+MCC(1∶1，1∶2)为辅料，加一定量的主药于辅料中，用30％的乙醇制粒湿度适中，考察辅料的种类和用量对挤出和滚圆后微丸外观以及药物释放的影响。
配方中MCC+HPMC(11∶1)与乳糖用量比例的影响：固定配方中其它成分的量，考察MCC+HPMC与乳糖比例分别为1∶1、1∶1.5、1∶2对微丸外观和药物释放的影响。
配方中水与乳糖相对用量的影响：研究发现，当水溶性的乳糖用量增加时，应相应减少水的用量才能得到适宜大小和圆整度的微丸，否则微丸粒径明显增大，目标微丸收率降低，但圆整度提高。
研究发现，辅料中应含有适宜量的MCC以保证湿物料有一定的弹性和塑性，乳糖的加入降低物料的塑性和弹性，而高分子材料HPMC和交联Na-CMC的加入则使物料的粘性和弹性提高，交联Na-CMC提高的幅度更大。当HPMC和Na-CMC用量增加时不利于成球，增加主药量时，可缓冲混合辅料的粘弹性，可以避免挤出物弯曲，但只有Na-CMC+MCC可以滚圆成球，提示加入Na-CMC可使载药量提高。由释放度结果可知：水溶性的乳糖和水溶胀性的HPMC的加入均比单用惰性的MCC制得的微丸药物释放得快，而交联Na-CMC则使药物释放稍变慢。另外通过溶出过程的可知，用MCC作附形剂时，溶出结束后，微丸仍保持原来的球形，而用MCC/HPMC(11∶1)和交联Na-CMC/MCC(1∶2)作附形剂时，微丸散开且MCC/HPMC溶胀散开得更快。
实验结果发现，随着乳糖用量的增加，物料弹塑性均减小，微丸质量变差，当乳糖量增至1∶1.5时，挤出物不能滚圆成球形，微丸呈棒状颗粒。增加乳糖的量使药物释放加快。比例为1∶1时，微丸圆整度最好，目标产率达84.87％。
实施例7：释放度影响因素考察
溶出桨不同转速下的影响：将用最佳配方和工艺条件下制得的微丸在50、75、100r/m的转速下桨法作释放度考察，测定药物的释放度，比较桨转速对释药的影响。将用最佳处方和工艺条件下制得的微丸在50、75、100r/m的转速下桨法作释放度考察，测定药物的释放度，比较桨转速对释药的影响。实验结果为桨转速增加，释药加快。100r/m时，在26h达到释放峰值91.21％。75r/m时，在35h达到峰值86.32％。50r/m时，在41h达到峰值84.56％。
不同pH值介质的影响：将用最佳配方和工艺条件下制得的微丸在H分别为1.2、2.0、4.5、5.4、6.8的释放介质中作释放度实验，考察pH对释药的影响。pH值对释药影响显著，当pH大于4.5时药物释放明显变慢，其原因是pH值升高，药物溶解度降低的缘故。
不同离子强度介质的影响：将用最佳配方和工艺条件下制得的微丸分别以0.05、0.1、0.5、0.8mol/L的KCI溶液作释放介质，考察离子强度对释药的影响。将用最佳处方和工艺条件下制得的微丸分别以0.05、0.1、0.5、0.8mol/L的KCI溶液作释放介质，考察离子强度对释药的影响。实验表明，离子强度增大，释药变慢，其释药时间分别为27.5h、30.8h、32.6h、38h。
体外释放度测定方法：称取本品一定量(约含发酵液粗提粉剂120mg)按释放度测定法桨法装置，分别以蒸馏水，pH1.2(0.1mol·L-1盐酸)及pH6.8，pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)900mL为溶剂，转速为100r·min-1，依法操作。在不同时间分别取溶液5mL滤过，并即时在操作容器中补充溶剂5mL，取续滤液，照分光光度法，在355nm波长处测定吸收度，分别计算不同时间的累积释放度。
包衣增重的影响：分别用5％、10％、15％HPMC加入NE∶L(10∶1)的包衣液中，对素丸进行8％、10％、15％包衣，考察对药物释放的影响。随着包衣量的增加，药物释放减慢，当包衣增重＞10％时各个条件下均出现时滞现象，包衣增重15％时时滞达2小时。10％HPMC在包衣增重为8％时释药时间同15％HPMC在包衣增重为10％时释药时间差别不大，但后者在第一小时出现时滞。这提示：包衣增重是导致时滞的主要因素，包衣增重大时，高用量致孔剂的加入不能改善时滞现象，所以解决时滞问题的手段是减少包衣量同时适当较小致孔剂的用量。考虑到经济因素，此微丸配方选择包衣液增重为8％。
微丸制备中滚圆速度、滚圆时间和润湿剂的用量是工艺的关键因素；处方中MCC/HPMC与乳糖的用量比例是能否制得质量好的微丸的主要因素，乳糖作为药物释放的调节剂。确定了制备工艺和处方组成。最后得出制作缓释微丸的工艺及配方为：发酵浓缩液粗提物粉剂30重量份、微晶纤维素(MCC)30重量份、乳糖30重量份、羟丙基甲基纤维素(HPMCK4M)10重量份、30％乙醇。发酵液粗提粉剂和辅料按配方量过筛混匀，添加质量分数为30％的乙醇水溶液作为黏合剂、挤出机速度为30r/m，滚圆速度1200r/m、滚圆时间10min、包衣液增重8％条件下，可制备出性状较好、平均粒径为1.5mm左右的缓释微丸。失重法测定结果表明，其缓释性能良好。采用30％黑曲霉发酵产物微丸缓释剂在有效剂量1.3g/m3下对魔芋白绢病菌、软腐病菌的平均防效分别在77.52％、95.92％，具有较强的抑制作用。
根据吸湿率及成型效果考量，缓释微丸选用了MCC、乳糖、羟丙基甲基纤维素(HPMCK4M)作为辅料。
实施例8：防治魔芋白绢病
将实施例2的黑曲霉微丸菌剂与基质按1∶100混匀。种植时将菌剂灌根，之后每隔30天灌根一次。待魔芋收获后。应在大田大面积喷洒3-5次，以杜绝白绢病菌形成的菌核来年的二次萌发。
黑曲霉发酵液与基质(现有技术中常用基质)按1∶100混匀，其它使用条件与微丸相同。
常用的基质配方为：泥炭、珍珠岩、园艺蛭石(按体积)1∶1∶1。或7份泥炭+3份蛭石。
将黑曲霉微丸菌剂进行300亩推广应用。经田间实测，在抗病性方面，对照区发病率30.59％，处理区发病率8.54％。而且平均防效达到了77.52％，有非常明显的防治魔芋白绢病效果，发病率见下表。
播种前分别调查种芋腐烂严重程度。白绢病严重度分级标准
0级：无病害症状
1级：发病面积占种芋面积的(0＜X＜5％)
2级：发病面积占种芋面积的(5％＜X＜15％)
3级：发病面积占种芋面积的(15％＜X＜30％)
4级：发病面积占种芋面积的(30％＜X＜50％)
5级：发病面积占种芋面积的(X＞50％)
实施例9：防治魔芋软腐病
将实施例1的黑曲霉微丸菌剂与基质按1∶500混匀。种植时将菌剂灌根，之后每隔30天灌根一次。
黑曲霉发酵液与基质按1∶500混匀，其它使用条件与微丸相同。
常用的基质配方为：泥炭、珍珠岩、园艺蛭石(按体积)1∶1∶1。或7份泥炭+3份蛭石。
将黑曲霉微丸菌剂进行300亩推广应用。经田间实测，在抗病性方面，对照区病株率10.49％，处理区发病率0.33％。而且平均防效达到了95.93％，有特别明显的防治魔芋软腐病效果，发病率见下表。
播种前分别调查种芋腐烂严重程度。软腐病严重度分级标准
0级：无病害症状
1级：球茎湿腐面积占球茎面积的(0＜X＜1/3)
2级：球茎湿腐面积占球茎面积的(1/3＜X＜1/2)
3级：球茎湿腐面积占球茎面积的(1/2＜X)
。

Claims (8)

1.一种黑曲霉微丸，其特征在于包括下述组分：黑曲霉、微晶纤维素、乳糖、羟丙基甲基纤维素。
2.根据权利要求1所述的微丸，其特征在于所述黑曲霉为黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂。
3.根据权利要求2所述的微丸，其特征在于含有：黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂10～40重量份、微晶纤维素10～45重量份、乳糖15～50重量份和羟丙基甲基纤维素1～10重量份。
4.根据权利要求3所述的微丸，其特征在于含有：黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂30重量份、微晶纤维素32重量份、乳糖35重量份和羟丙基甲基纤维素3重量份。
5.根据权利要求2所述的微丸，其特征在于所述黑曲霉发酵浓缩液粗提物粉剂是通过下述方法制备得到：
A.取灭菌发酵液过滤，在25℃浓缩至相对密度为1.12，喷雾干燥，干燥条件为：进风温度150℃；排气温度95℃；流速20mL/s；
或
B.取灭菌发酵液过滤，在25℃浓缩至相对密度为1.12，置70℃烘箱中，鼓风干燥36h，取出后使用高速粉碎机粉碎，过100目筛既得。
6.权利要求1-5任一所述微丸在防治魔芋白绢病和软腐病的应用。
7.权利要求1-5任一所述微丸的使用方法，其特征在于当防治防治魔芋白绢病时：将黑曲霉微丸菌剂与基质按1∶80～120混匀，种植时将菌剂灌根，之后每隔30天灌根一次，待魔芋收获后，应在大田大面积喷洒3-5次。
8.权利要求1-5任一所述微丸的使用方法，其特征在于当防治防治魔芋软腐病时：将黑曲霉微丸菌剂与基质按1∶400～600混匀，种植时将菌剂灌根，之后每隔30天灌根一次。
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