CN110592032A - 泛素连接酶Smurf1突变体、编码基因及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种致癌相关蛋白Smurf1蛋白的新位点功能的发现与验证，此新位点突变后导致其蛋白功能的完全丧失。其意义在于Smurf1蛋白该69位点发生突变后会降低Smurf1作为E3连接酶活性的功能，进而抑制肿瘤发生。本发明进一步拓展和完善了肿瘤研究，为肿瘤的治疗和靶点药物的开发提供了一个新的靶标位点。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种影响肿瘤形成的Smurf1蛋白新位点功能认识及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
从上个世纪八十年代开始，恶性肿瘤发生率和死亡率呈现逐年上升趋势，已逐步成为人类生命的头号杀手。而且随着世界人口日趋老龄化，恶性肿瘤死亡人数将继续上升。目前，我国恶性肿瘤死亡病例总数占世界的近四分之一。恶性肿瘤对人类健康的危害已经引起我国的重视，针对该疾病的治疗也是医学研究人员和公共***门关注的重要课题。
Smad泛素化调节因子1(Smurf1)是一种E3连接酶，能选择性地结合受体调节蛋白Smad家族的成员，并使其泛素化降解，进而调节信号通路。近几年研究发现，Smurf1在肠癌、胰腺癌和***癌等癌症中高表达，表明其可能是肿瘤的一种原癌基因。
在前期研究中发现，Smurf1在胶质母细胞瘤(GBM)中大量表达，且与GBM预后相关(图1)。它通过PTEN对肿瘤的发生发挥重要作用。研究表明，Smurf1能泛素化PTEN。Smurf1上调会降低PTEN的活性，导致PI3K信号通路的持续激活，而Smurf1的缺失会显著抑制细胞增殖和肿瘤生长。因此，进一步了解Smurf1的激活可能会发现阻止肿瘤发生的潜在靶点。Smurf1磷酸化修饰是促进其底物泛素化的有效途径。然而，其分子机制尚不清楚。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种能抑制肿瘤形成的Smurf1的突变体。
本发明的技术方案为：泛素连接酶Smurf1突变体，该突变体由泛素连接酶Smurf1的第69位氨基酸替换为其他任意氨基酸得到，所述泛素连接酶Smurf1的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
进一步地，所述泛素连接酶Smurf1的第69位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
多核苷酸，编码上述所述的泛素连接酶Smurf1突变体。
进一步地，该多核苷酸的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
一种重组载体，包含上述所述的多核苷酸。
一种重组宿主细胞，含有上述所述的重组载体或表达上述所述的泛素连接酶Smurf1突变体蛋白。
我们验证了Smurf1第69位点突变在不同肿瘤细胞中的抑制功能，如：人胶质母细胞瘤、肺癌、结直肠癌等中的反应。
上述所述的突变体、多核苷酸、重组载或重组宿主细胞体在制备***相关药物上的相关应用。
进一步地，所述肿瘤为人胶质母细胞瘤。
Smurf1第69位点突变后将影响其功能，我们进行FGFR1体外磷酸化实验，在FGFR1酶处理条件下，发现野生型的Smurf1能够被磷酸化，而Y69突变后，Smurf1不能被磷酸化。因为Smurf1是一个E3泛素连接酶，所以我们进行了体外泛素化实验，观察突变是否影响Smurf1的泛素化，结果表明第69位点氨基酸突变后，Smurf1不能再泛素化；并且FGFR1刺激后能够增强野生型Smurf1的泛素化，而不能增加Smurf1-Y69F的泛素化。进一步研究发现Smurf1第69位点氨基酸突变能抑制Smurf1蛋白活性，削弱其泛素化能力，进而抑制癌症进程。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
Smurf1蛋白在多种肿瘤细胞中高表达，对肿瘤的发生发展发挥重要作用。本发明提供的Smurf1蛋白位点突变后，能抑制Smurf1蛋白活性，影响Smurf1泛素化能力，进而抑制癌症发生。本发明为肿瘤的治疗和靶点药物的开发提供了一个新的靶标位点。
附图说明
图1：胶质母细胞瘤患者中Smurf1表达量高的患者生存率较低；
图2：突变质粒测序结果(部分)；
图3：突变型与野生型质粒对比(部分)；
图4：稳转细胞系稳转效果鉴定；
图5：稳转细胞系克隆形成实验结果；
图6：不同肿瘤的Smurf1第69位点不同突变的稳转细胞系克隆形成实验结果；
图7：Smurf1及突变蛋白功能差异鉴定结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：表达载体构建
1.实验方法
Myc-Smurf1质粒、pET-21a质粒、HA-Ub质粒、慢病毒表达载体PCDH-3HA、慢病毒包装质粒PSPAX2和包膜质粒PMD2G购于Addgene。
(1)定点突变(以第69位氨基酸由Y到F突变“Y69F”为例，其他类型突变构建过程类似)
将Myc-Smurf1质粒(也可以使用***有Smurf1的其它质粒)进行定点突变。所述Smurf1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
具体操作如下：
定点突变的引物如下表所示：
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | SEQ ID |
| XQ5 | CACTATGATCTATTTGTTGGGAAA ACG | SEQ ID No:5 |
| XQ6 | CTGGTTCCACTTTGGGTCCAA | SEQ ID No:6 |
PCR体系：模板Myc-Smurf1质粒10ng，正向引物XQ5(10μM)1.25μl，反向引物XQ6(10μM)1.25μl，Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(2X)12.5μl，反应体系总体积为25μl。
点突变PCR反应条件如下：
由此构建Myc-Smurf1-Y69F质粒并通过测序进行鉴定。
(2)构建慢病毒表达载体
使用Myc-Smurf1质粒、Myc-Smurf1-Y69F质粒构建慢病毒表达载体。通过PCR扩增、纯化PCR产物，回收得到目的片段Smurf1和Smurf1-Y69F。也可以用本领域技术人员知悉的其它手段制备目的片段Smurf1和Smurf1-Y69F(例如人工合成)。
双酶切环状质粒PCDH-3HA，回收线性载体PCDH-3HA双酶切体系：PCDH-3HAplasmid 3μg，NEB限制性内切酶EcoRI-HF 1μl，10×NEB cutsmart Buffer 2.5μl，ddH2Oto final volume 25μl。
使用Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit(Code#K0691)纯化回收目的片段Smurf1、Smurf1-Y69F和双酶切后的质粒PCDH-3HA，详细操作步骤参照说明书进行。
利用Vazyme Clone ExpressII Kit将Smurf1、Smurf1-Y69F分别和PCDH-3HA进行连接，经过DH5α菌落PCR和双酶切鉴定(NEB EcoRI-HF/XhoI+NEBSacI-HF)获得阳性克隆后，进行测序鉴定。
(3)构建大肠杆菌表达载体
使用Myc-Smurf1质粒、Myc-Smurf1-Y69F质粒构建大肠杆菌表达载体。通过PCR扩增、纯化PCR产物，回收得到目的片段Smurf1和Smurf1-Y69F。也可以用本领域技术人员知悉的其它手段制备目的片段Smurf1和Smurf1-Y69F(例如人工合成)。通过PCR方法为目的片段加上Flag标签。其引物为：5′-CACCATGGACTACAAGGACGATGACGACAAGGGTTCTGGAGGCTCGAACCCCGGGACA-3′(SEQ ID No:7)和5′-CTCCACAGCAAACCCGCA-3′(SEQ ID No:8)。
双酶切环状质粒pET21-DEST，回收线性载体，pET21-DEST双酶切体系：pET21-DESTplasmid 3μg，NEB限制性内切酶EcoRI-HF 1μl，10×NEB cutsmart Buffer 2.5μl，ddH2Oto final volume 25μl。
使用Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit(Code#K0691)纯化回收目的片段Smurf1、Smurf1-Y9F和双酶切后的质粒pET21-DEST，详细操作步骤参照说明书进行。
利用Vazyme Clone ExpressII Kit将Smurf1、Smurf1-Y69F分别和pET21-DEST进行连接，经过DH5α菌落PCR和双酶切鉴定(NEB EcoRI-HF/XhoI+NEBSacI-HF)获得阳性克隆后，进行测序鉴定。
2.实验结果
(1)质粒测序鉴定
DH5α感受态菌扩增质粒后所提质粒经测序鉴定提示点突变(图2)及各组载体构建成功(图3)。
实施例2：蛋白表达及功能鉴定
1.实验方法
(1)重组慢病毒包装
将空载体、野生型和突变型重组慢病毒表达载体分别使用PSPAX2和PMD2G质粒通过vigo转染293T细胞，转染后4h换液，换液后72h收集病毒液(转染的293T细胞的上清液)，3000rpm离心5min，0.45μm滤膜过滤，分装后-80℃储存。
293T细胞培养于含10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco,GrandIsland,NY,USA)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)(Gibco,Grand Island,NY,USA)中，培养液含100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)。细胞放于37℃5％CO2培养箱中培养。
(2)慢病毒感染细胞(以胶质母细胞瘤LN229-Smurf1-Y69F突变为例，其他类型感染过程类似)
以人胶质母细胞瘤LN229细胞汇合度为40％-60％时，每1cm2底面积铺30μl前面步骤
(2)制备的病毒液，感染LN229细胞。
LN229细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM中，培养液含100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。细胞放于37℃5％CO2培养箱中培养。
(3)Western blot方法检测Smurf1及突变蛋白
感染后第7天收集细胞提取蛋白样品，用Western blot检测Smurf1蛋白和β-actin蛋白表达水平
(4)平板克隆形成试验
取适量稳转细胞悬液接种到加有10％胎牛血清的DMEM的培养皿中(培养液含100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素)。以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。将培养皿置37℃、5％CO2中培养2周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，用PBS液小心浸洗2次，然后用4％多聚甲醛固定15分钟。弃多聚甲醛后用流水缓慢洗去残留的多聚甲醛。用1％结晶紫染液染色30分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。
(5)Smurf1及突变蛋白体外表达及功能差异鉴定
BL21感受态菌扩增质粒pET-21a-Flag-Smurf1与pET-21a-Flag-Smurf1-Y69F后，使用IPTG诱导BL21表达目的蛋白，并进行纯化。使用纯化后的pET-21a-Flag-Smurf1与pET-21a-Flag-Smurf1-Y69F进行体外磷酸化与体外泛素化实验，分别用如图6所示抗体进行免疫印迹。
2.实验结果
(1)Western blot检测Smurf1蛋白表达水平
空载体几乎未见Smurf1，野生型和突变型的Smurf1蛋白表达水平显著高于空载体(图4)。上述结果说明：目的基因突变型Smurf1已成功导入LN229细胞并成功表达，Smurf1突变稳转细胞模型成功建立；
(2)平板克隆形成试验
如图5所示，各组间细胞生长速度差异较大。以空载体组为基准，高表达Smurf1后细胞生长较快，证明高表达Smurf1会加速肿瘤进程；Smurf1突变后，细胞生长速度明显减缓，证明该位点突变后能显著减缓肿瘤进程。
如图6所示，以空载体组为基准，不同类型肿瘤细胞高表达Smurf1后细胞生长皆较快，证明高表达Smurf1会加速多种肿瘤进程；Smurf1第69位点发生不同突变后，细胞生长速度明显减缓，证明该位点无论发生何种突变，能显著减缓肿瘤进程。
(3)Smurf1及突变蛋白功能差异鉴定
如图7所示，为了分析Smurf1第69位点突变后是否影响其功能，我们进行FGFR1体外磷酸化实验，在FGFR1酶处理条件下，发现野生型的Smurf1能够被磷酸化，而Y69突变后，Smurf1不能被磷酸化。因为Smurf1是一个E3泛素连接酶，所以我们进行了体外泛素化实验，观察突变是否影响Smurf1的泛素化，结果表明第69位点突变后，Smurf1不能再泛素化；并且FGFR1刺激后能够增强野生型Smurf1的泛素化，而不能增加Smurf1-Y69F的泛素化。
3.结果分析
本研究首次报道了Smurf1第69位点的新突变，通过慢病毒表达载体体系成功建立了此突变的稳转细胞模型，对其Smurf1蛋白表达水平的检测和细胞集落形成实验提示该突变能抑制癌症进程。经进一步研究发现Smurf1第69位点突变能抑制Smurf1蛋白活性，削弱其泛素化能力，进而抑制癌症进程。
序列表
<110> 北京理工大学
<120> 泛素连接酶Smurf1突变体、编码基因及用途
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 731
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ser Asn Pro Gly Thr Arg Arg Asn Gly Ser Ser Ile Lys Ile Arg
1 5 10 15
Leu Thr Val Leu Cys Ala Lys Asn Leu Ala Lys Lys Asp Phe Phe Arg
20 25 30
Leu Pro Asp Pro Phe Ala Lys Ile Val Val Asp Gly Ser Gly Gln Cys
35 40 45
His Ser Thr Asp Thr Val Lys Asn Thr Leu Asp Pro Lys Trp Asn Gln
50 55 60
His Tyr Asp Leu Tyr Val Gly Lys Thr Asp Ser Ile Thr Ile Ser Val
65 70 75 80
Trp Asn His Lys Lys Ile His Lys Lys Gln Gly Ala Gly Phe Leu Gly
85 90 95
Cys Val Arg Leu Leu Ser Asn Ala Ile Ser Arg Leu Lys Asp Thr Gly
100 105 110
Tyr Gln Arg Leu Asp Leu Cys Lys Leu Asn Pro Ser Asp Thr Asp Ala
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130 135 140
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145 150 155 160
Thr Val Tyr Glu Asp Ser Gly Pro Gly Arg Pro Leu Ser Cys Phe Met
165 170 175
Glu Glu Pro Ala Pro Tyr Thr Asp Ser Thr Gly Ala Ala Ala Gly Gly
180 185 190
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Gln Asn Arg Pro His Gly His Gln Ser Pro Glu Leu Pro Glu Gly Tyr
225 230 235 240
Glu Gln Arg Thr Thr Val Gln Gly Gln Val Tyr Phe Leu His Thr Gln
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260 265 270
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275 280 285
Arg Ser Thr Val Ser Gly Arg Ile Tyr Phe Val Asp His Asn Asn Arg
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Ser Leu Glu Asp Glu Glu Leu Pro Ala Gln Arg Tyr Glu Arg Asp Leu
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Val Gln Lys Leu Lys Val Leu Arg His Glu Leu Ser Leu Gln Gln Pro
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Gln Ala Gly His Cys Arg Ile Glu Val Ser Arg Glu Glu Ile Phe Glu
370 375 380
Glu Ser Tyr Arg Gln Ile Met Lys Met Arg Pro Lys Asp Leu Lys Lys
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Arg Leu Met Val Lys Phe Arg Gly Glu Glu Gly Leu Asp Tyr Gly Gly
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435 440 445
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450 455 460
Phe Val Gly Arg Ile Met Gly Leu Ala Val Phe His Gly His Tyr Ile
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Leu Val Trp Ile Leu Glu Asn Asp Ile Thr Pro Val Leu Asp His Thr
515 520 525
Phe Cys Val Glu His Asn Ala Phe Gly Arg Ile Leu Gln His Glu Leu
530 535 540
Lys Pro Asn Gly Arg Asn Val Pro Val Thr Glu Glu Asn Lys Lys Glu
545 550 555 560
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565 570 575
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645 650 655
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675 680 685
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcgtggatg ggtctgggca gtgccactca accgacactg tgaaaaacac attggaccca 180
aagtggaacc agcactatga tctatttgtt gggaaaacgg attcgataac cattagcgtg 240
tggaaccata agaaaattca caagaaacag ggagctggct tcctgggctg tgtgcggctg 300
ctctccaatg ccatcagcag attaaaagat accggatacc agcgtttgga tctatgcaaa 360
ctaaacccct cagatactga tgcagttcgt ggccagatag tggtcagttt acagacacga 420
gacagaatag gaaccggcgg ctcggtggtg gactgcagag gactgttaga aaatgaagga 480
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ccaagtcaag atcaaagact tcaggcacag cggcttcgaa accctgatgt gcgaggttca 660
ctacagacgc cccagaaccg accacacggc caccagtccc cggaactgcc cgaaggctac 720
gaacaaagaa caacagtcca gggccaagtt tactttttgc atacacagac tggagttagc 780
acgtggcacg accccaggat accaagagac cttaacagtg tgaactgtga tgaacttgga 840
ccactgccgc caggctggga agtcagaagt acagtttctg ggaggatata ttttgtagat 900
cataataacc gaacaaccca gtttacagac ccaaggttac accacatcat gaatcaccag 960
tgccaactca aggagcccag ccagccgctg ccactgccca gtgagggctc tctggaggac 1020
gaggagcttc ctgcccagag atacgaaaga gatctagtcc agaagctgaa agtcctcaga 1080
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tggctttact tgctgtgcca tgaaatgctg aatccttatt acgggctctt ccagtattct 1320
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atcacgcctg tactggacca caccttctgc gtggaacaca acgccttcgg gcggatcctg 1620
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tacgtccggt tgtatgtaaa ctggaggttt atgagaggaa tcgaagccca gttcttagct 1740
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Claims (10)
1.泛素连接酶Smurf1突变体，其特征在于，该突变体由泛素连接酶Smurf1的第69位氨基酸替换为其他任意氨基酸得到，所述泛素连接酶Smurf1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的泛素连接酶Smurf1突变体，其特征在于，所述泛素连接酶Smurf1的第69位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.多核苷酸，编码权利要求1或2所述的泛素连接酶Smurf1突变体。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的碱基序列如SEQ IDNo.3所示。
5.一种重组载体，包含权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种重组载体，包含权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种重组宿主细胞，含有权利要求5或6所述的重组载体或表达权利要求1或2所述的泛素连接酶Smurf1突变体蛋白。
8.根据权利要求7所述的一种重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为人胶质母细胞瘤细胞。
9.权利要求1或2所述的突变体或权利要求3或4所述的多核苷酸或权利要求5或权利要求6所述的重组载或权利要求7或权利要求8所述的重组宿主细胞体在制备***相关药物上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为人胶质母细胞瘤。
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Applications Claiming Priority (1)
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2019
- 2019-10-14 CN CN201910973872.9A patent/CN110592032B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110592032B (zh) | 2021-04-13 |
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