CN104710515A - 人***瘤病毒l1蛋白突变体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种人***瘤病毒 L1蛋白突变体，同时还提供了其制备方法，以及包含至少一种所述突变体的药物组合物，特别是包含至少一种所述突变体的疫苗，属于生物制药技术领域。

Description

人***瘤病毒L1蛋白突变体及其制备方法

技术领域

本发明公开一种人***瘤病毒 L1蛋白突变体，同时还提供了其制备方法，以及包含至少一种所述突变体的药物组合物，特别是包含至少一种所述突变体的疫苗，属于生物制药技术领域。

背景技术

大量分子流行病学和分子生物学研究已经证明, HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45等高危型人***瘤病毒（human papillomavirus，简写为：HPV）在人体内持续感染是引起***发生的主要病因。不同人群中一系列研究已证实生殖道的HPV16、HPV18型感染与***的发生高度相关，较其它危险因素更密切。HPV是乳多空瘤病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒，它是***瘤病毒（PV）属中的一个成员，根据宿主范围，可分成人、牛、兔、狗、马、羊、猪、鼠等***瘤病毒亚家族成员。其基因组含有8个开放阅读框（ORF）和一个上游调节区（URR）, 其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达, 称为早期蛋白；2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达, 称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2, 与病毒的增殖有关。（de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. Virology. 2004; 324(1): 17~ 27.）无论是原核，还是真核表达***表达的L1蛋白在近生理环境中均可自发地形成稳定的五聚体，并且72个五聚体进一步自组装后形成T=7的二十面体结构的类病毒颗粒（VLPs）。主要衣壳蛋白L1约有504个残基，分子量约为58 kDa。L1的三级结构有两个突出的结构域（Chen XS, Garcea RL, Goldberg I, Casini G, Harrison SC. Structure of small virus-like particles assembled from the L1 protein of human papillomavirus 16. Mol Cell. 2000;5(3):557-567.）（图 1）: 一个典型的“果冻卷”β折叠桶，包含L1多肽链的残基20-382；h1-h5为5个α-螺旋，包含残基383-475。5个等同的 L1 亚基形成一个五聚体（图 2）在五聚体壳粒里，每个L1亚基的α-螺旋4（h4，残基414-429）形成突出的亚结构域后，离开它们所属的五聚体向外延伸，并侵入邻近五聚体的L1的α-螺旋2 和3（h2和h3）里。α-螺旋5（h5）与短的βJ股段一起锁定邻近亚基羧基端的侧面突出部分，加强了五聚体内的联系。从T=7晶体结构可知，α-螺旋h2、h3和h5的缺失，影响五聚体形成；h4的缺失，影响VLPs的形成，但不影响五聚体的形成。

目前，已知的HPV有100多种亚型，由于HPV具有种属特异性, 且不能在体外细胞培养, 要获得该病毒的特异性抗原, 只能用重组DNA 技术的方法制备基因工程疫苗。重组Ll或L1/L2在体内可自组装形成病毒样颗粒VLPs，该颗粒直径约55nm，无病毒DNA，安全性好，具有和天然病毒颗粒相似的抗原表位，刺激机体后可产生中和抗体IgG和IgA，因此HPV VLPs可作为预防性疫苗，从而避免因感染HPV导致产生相关肿瘤的可能性。

目前, HPV疫苗制备技术已逐渐趋于成熟, 但是还存在许多问题。主要有以下几个方面: (1)由于80%的***发生在发展中国家和较贫困地区, 因此改善疫苗制备工艺，降低生产成本显得尤为重要。(2)据WHO统计, 每年全球大约有47万例新发***病例, 到目前为止尚无逆转已经发生的感染和已经存在的病灶得以消除的有效办法。尽快研制出治疗和兼有预防治疗双重作用HPV疫苗时不以待。(3)致病的HPV 种类很多, 目前已分离出HPV型别中有三十多种致癌。（Dell G, Gaston K, Human papillomaviruses and their role in cervcal caner. Cell Mol Life Sci. 2001; 58(12-13): 1923-1942.）因为HPV的种属特异性, 因此，目前已有的无论是二价还是四价疫苗都不能抵挡所有型别的HPV感染。有研究表明L2可以诱导交叉性中和抗体的产生，这或许能够为研究具有交叉保护作用的高效疫苗提供思路。

选择适宜的载体表达***是研制HPV疫苗的重要环节，也是影响表达水平及蛋白活性的关键步骤。理想的载体应具有稳定的无毒表型，不与宿主染色体发生整合，能有效表达具有免疫原性的外源基因序列，接种后不会在宿主体内长期留存的特点。HPV 疫苗研究中应用较多的是酵母菌、昆虫细胞以及哺乳动物细胞表达***，但其稳定性差、造价高，不利于其在发展中国家的推广使用。而最初的HPV L1和L2衣壳蛋白是在原核细胞——大肠杆菌中表达成功的，原核生物容易培养，表达量高，成本低，但容易形成包涵体，需要经过复杂的变性和复性处理才能恢复蛋白质的高级结构，VLPs 产率很低。因此，在大肠杆菌体系中，提高VLPs 产率可以有效地降低HPV疫苗的生产成本。

发明内容

本发明目的是提供一种人***瘤病毒L1 蛋白的突变体。

本发明另一个目的是提供所述突变体的制备方法，以及包含至少一种所述突变体的药物组合物，特别是包含至少一种所述突变体的疫苗。

本发明提供一种人***瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：人***瘤病毒 L1蛋白C末端α-螺旋5 FPLGRKFL*LQAG中的亮氨酸L*突变成丙氨酸A或丝氨酸S，优选突变为丙氨酸A。

本发明所述的人***瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：所述人***瘤病毒 L1蛋白是指6、11、16、18、31、33、34、35、39、45，5l、52、53、56、58、59、66、67、68、70、72、73或82、85、97型HPV中一种和/或几种的组合。

本发明还提供编码该蛋白突变体的多核苷酸基因片段（如SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO. 5）、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该蛋白突变体形成的HPV L1蛋白五聚体。

本发明另一个目的是包含至少一种所述突变体的药物组合物，具体的说，药物组合物的有效成份为由该蛋白突变体形成的HPV L1蛋白五聚体。

本发明第三方面是涉及包含至少一种所述突变体的疫苗，具体地说疫苗由抗原和药物佐剂制成，该抗原主要包括由上述突变体蛋白形成的HPV L1五聚体。

本发明所述的人***瘤病毒L1蛋白突变体的五聚体的制备方法，包括以下步骤：

1、以N端去掉4个氨基酸、C端去掉29个氨基酸的截短野生型人***瘤病毒HPV 16L1（简称：16WT）和HPV 18L1（简称：18WT）基因序列为模板，设计带有突变位点的寡聚脱氧核糖核酸（引物），利用聚合酶链式反应（PCR）技术，对含有突变位点的核苷酸片段进行扩增；

2、以pGEX-6p-1为载体片段，将突变体核苷酸片段连接于载体的多克隆位点上（BamH Ι和Not Ι），并将重组载体转化入宿主细胞（E. coli，DH5α）中进行重组子的筛选；

3、获得重组载体后，以XA90（E. coli）为表达宿主细胞进行突变体蛋白的表达；

4、利用亲和层析以及体积排阻色谱纯化L1蛋白突变体的五聚体，用SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳和蛋白免疫印迹法确定得到的蛋白是L1蛋白突变体的五聚体。

本发明与对应的16WT，18WT相比，所述突变体HPV 16L1 L469A（简称：L469A）、HPV 16L1 L469S（简称：L469S）和突变体HPV 18L1 L470A（简称：L470A）得到的可溶性五聚体（正确折叠的L1蛋白）在可溶性蛋白总量中的比例均显著增加，并且突变体L1蛋白五聚体可以进一步组装成类病毒颗粒VLPs，大小53nm左右，与野生型HPV病毒颗粒相似。其中，突变体L469A和L470A的蛋白表达产量和可溶性五聚体的蛋白产量均有所提高，其可溶性五聚体的产量大约是野生型的2倍（即突变体VLPs产量是野生型的2倍）。

在本发明中，把HPV L1蛋白C末端α-螺旋5 “FPLGRKFL*LQAG”中的亮氨酸L*突变成更亲水性的丙氨酸（Ala，A）或丝氨酸（Ser, S）后，明显提高了L1蛋白可溶性五聚体的产率和由其组装成的类病毒颗粒VLPs的产率，从而有效地降低HPV疫苗的生产成本。比较HPV 6、11、16、18、31、33、34、35、39、45，5l、52、53、56、58、59、66、67、68、70、72、73或82、85、97型L1蛋白的h5序列（图3），在h5中的亮氨酸L*这一点是高度保守的，说明在h5中的这一点在L1蛋白结构和功能上具有重要的作用，并且这一点突变具有普适性，因而可以推广到所有HPV型别中，这些突变为第二代廉价、广谱HPV疫苗的研发提供方案和可行性。

本发明的积极效果在于：

在原核细胞大肠杆菌中，把HPV L1蛋白C末端α-螺旋5 FPLGRKFL*LQAG 中的亮氨酸L*突变成更亲水性的丙氨酸（Ala，A）或丝氨酸（Ser, S）后，明显提高了L1蛋白可溶性五聚体的产率和由其组装成的类病毒颗粒VLPs的产率，从而有效地降低HPV疫苗的生产成本。

附图说明：

图1是HPV 16的亚基L1结构。

图2是HPV 16的L1五聚体结构示意图。

图3是25个不同HPV型别的L1蛋白α-螺旋5（h5）序列对比图。

图4是HPV 16L1、18L1突变体核苷酸片段的扩增。

图5是HPV 16L1、18L1突变体质粒及BamH Ι/Not Ι双酶切鉴定重组DNA片段。

图6是截短野生型16WT及其突变体L469A、L469S的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳图。

图7是截短野生型16WT及其突变体L469A、L469S的蛋白免疫印迹法（Western-blot）鉴定图。

图8是截短野生型16WT及其突变体L469A、L469S的体积排阻色谱图。

图9是截短野生型18WT及其突变体 L470A的体积排阻色谱图。

图10是截短野生型16WT及其突变体L469A的CD光谱图。

图11是通过动态光散射(DLS)分析组装后类病毒颗粒VLPs粒径大小及分布，粒径大小是53nm左右。

图12是HPV 16L1 L469A突变体组装成类病毒蛋白颗粒VLPs的TEM图。

图13是免疫后的小鼠血清中中和抗体滴度图。

具体实施方式：

以下实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围。

实施例1. 突变体基因片段的构建

分别以含有截短野生型16WT、18WT 基因片段的载体pGEX-6p-1-HPV 16L1（简称：p-16WT），pGEX-6p-1-HPV 18L1（简称：p-18WT）为模版，包含突变点的寡聚核苷酸链为引物，进行突变体DNA片段的合成。16L1突变片段的突变位点位于469位的亮氨酸，18L1则是位于470位的亮氨酸。

根据已构建的截短野生型16WT、18WT核苷酸序列（由于截短野生型L1核苷酸序列为密码子优化后的核苷酸序列与NCBI基因库中野生型核苷酸序列存在差异；命名为SEQ NO.1以及SEQ NO.4），利用Primer Premier5引物设计软件设计突变体引物。对应引物序列如下：

1、合成HPV 16L1 L469A突变体DNA片段引物：

上游引物（A1）：

5￠ TATATAGGATCCATGCCGTCTGAAGC 3￠

下游引物（A2）：

5￠TATATAGCGGCCGCTTAAGCTTTCAGACCAGCCTGCAGCGCGAATTTACGACCCAGCGGGAACTG 3￠

2、合成HPV 16L1 L469S突变体DNA片段引物：

上游引物（B1）：

5￠ TATATAGGATCCATGCCGTCTGAAGC 3￠

下游引物（B2）：

5￠TATATAGCGGCCGCTTAAGCTTTCAGACCAGCCTGCAGAGAGAATTTACGACCCAGCGGGAACTG 3￠

3、合成HPV 18L1 L470A突变体DNA片段引物：

上游引物（C1）：

5￠ATAATAGGATCCATGCCGTCTGATAACACC 3￠

下游引物（C2）：

5￠TATATAGCGGCCGCTTAACGACGCAGACCAGCCTGAACCGCGAATTTACGACCCAGCGGGTACTG 3￠

利用下游引物的核苷酸CGC、AGA和CGC代替CTG，对应在16WT的氨基酸序列上产生L469A和L469S突变，在18WT的氨基酸序列上产生L470A的突变。

聚合酶链式反应（PCR）条件：分别以p-16WT，p-18WT为模版，A1A2、B1B2、C1C2为引物，扩增突变体HPV 16L1 L469A（SEQ NO.2）、L469S（SEQ NO.3）以及HPV 18L1 R470A（SEQ NO.4）的核苷酸片段。

反应体系100 μl：

2×EasyTaq mixture  50 μl

上游引物           2 μl

下游引物           2 μl

模版               0.5 μl

ddH2O             45.5 μl

PCR扩增程序：

反应条件：预变性 94 ℃ 45 sec；变性95 ℃ 1 min；退火 55 ℃ 1 min 30 sec；延伸72 ℃ 1 min 30 sec；30个循环；再延伸72 ℃ 10 min；4 ℃保存（参见图4，泳道M：DNA Marker；泳道1：HPV 16L1 L469A；泳道2：HPV 16L1 L469S；泳道3：HPV 18L1 L470A）。

实施例2. 突变重组载体的构建及鉴定：

将含有BamHⅠ和NotⅠ酶切位点的突变体基因以及载体pGEX-6P-1进行BamH/NotⅠ双酶切处理，之后利用T4 DNA连接酶将回收的突变体基因与含有对应粘性末端的pGEX-6P-1进行连接反应，16 ℃ 12 h。连接反应后转化连接产物到宿主菌DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取，之后进行BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定（参见图5，泳道M：DNA Marker；泳道1：pGEX-6p-1-16L1 L469A质粒；泳道2：pGEX-6p-1-16L1 L469A质粒双酶切；泳道3：pGEX-6p-1-16L1 L469S质粒；泳道4：pGEX-6p-1-16L1 L469S质粒双酶切；泳道5：pGEX-6p-1-18L1 L470A质粒；泳道5：pGEX-6p-1-18L1 L470A质粒双酶切片段）。连接有基因片段的载体由上海生工生物公司进行测序。

实施例3. 突变体蛋白的表达与纯化：

将测序结果正确的重组载体转入氯化钙方法制备的XA90（E. coli），并作为表达宿主进行截断野生型和突变体蛋白的表达。宿主培养基为LB培养基（10 g/L胰化蛋白胨；5 g/L酵母粉；10 g/L NaCl）。挑取含重组质粒的菌体单斑于10ml LB培养基（含100μg/ml氨苄青霉素）中，230转/分钟（rpm），37℃振荡培养过夜。  按1：100的比例稀释过夜菌，一般转接5 ml过夜菌于500 ml（含100 μg/ml 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至重组工程菌生长至OD600nm≈0.8时，加入终浓度为0.2 mM的IPTG，在28 ℃的条件下进行16 h重组蛋白的诱导表达。

对菌液进行离心（4000 rpm，30 min，4℃），弃上清，收获菌体沉淀，称重；使用buffer L（pH 8.0，50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，1mM EDTA，2mM DTT，10 mM PMSF）洗涤沉淀，然后将其重悬于buffer L中并在冰水混合浴中进行超声波破碎，随后通过高速离心机对破菌液进行离心（16000 rpm，30 min，4℃），收集上清用于随后的GST层析柱分离。使用GST亲和层析柱，通过以下步骤进行纯化：清洗：0.5M NaOH清洗2个柱体积；再生平衡：缓冲液buffer L清洗10个柱体积平衡层析柱；上样：将上清缓慢加入层析柱中；淋洗：缓冲液buffer L淋洗10个柱体积，至全部非特异性蛋白被洗掉；酶切去除GST标签：在GST柱中加入含有PreScission Protease（PPase）蛋白酶的酶切缓冲液（含有20 mM DTT的buffer L），封闭层析柱，4℃酶切过夜；收集：收集流出液获得L1蛋白。酶切后得到的截断野生型16WT和突变体L469A、L469S蛋白可溶性表达含量用SDS- PAGE蛋白质凝胶电泳检测（参见图6，泳道1：HPV 16L1； 泳道2：HPV 16L1；泳道3：HPV 16L1 L469S），说明得到了53kDa 的HPV L1蛋白。

为进一步纯化L1蛋白，利用体积排阻色谱柱（SEC）——Superdex-200（16/60）预装柱，通过以下步骤对样品进行分离纯化：清洗：0.5M NaOH清洗2个柱体积；再生平衡：缓冲液buffer W（pH 8.0，50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl）清洗2个柱体积平衡层析柱；上样：酶切后得到的L1蛋白以1ml/min的速度上样；洗脱：流动相为buffer W，流速为1 ml/min，检测波长为280 nm，收集分离后各对应峰位的流穿液。将纯化得到的截断野生型16WT和突变体L1用蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测：转印后硝酸纤维素膜用3%的PBS脱脂奶粉室温封闭1 h，之后用PBST（含有0.2% Tween-20的PBS缓冲液）漂洗3~5min，重复3次；加入HPV 16L1多克隆抗体（1:5000稀释）室温孵育1 h，之后再用PBST漂洗3~5 min，重复3次；加入碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗兔抗体（1:2000稀释）室温孵育1 h，之后用PBST漂洗3~5 min，重复3次；避光显色5~10 min。结果显示：纯化后获得的蛋白为HPV 16L1蛋白（参见图7，泳道1：HPV 16L1； 泳道2：HPV 16L1 L469S；泳道3：HPV 16L1 L469A；泳道4：蛋白Marker。）。

实施例4. 突变体蛋白五聚体结构的表征：

（1）体积排阻色谱（SEC）：利用SEC分析GST亲和层析柱初步纯化出的目标蛋白L1，以检测突变体蛋白与野生型蛋白在天然条件下的结构、存在状态及含量。

结果表明：在50 mM Tris-HCl缓冲液条件（pH8.0）下，截断野生型16WT、18WT和突变体 L469A、L469S、L470A 的L1蛋白均以五聚体和单体两种形式存在（图8和9）。折叠构象正确的L1蛋白单体会自组装成稳定的五聚体，五聚体是主要产物，并在适宜的条件下会进一步自组装成VLPs，而不能正确折叠的单体只能以单体形式存在，不能再组装成五聚体。从图8，9和表1可知，16WT和18WT蛋白五聚体和单体的比例大约是1.6~2.0；L469A、L469S、L470A蛋白五聚体和单体的比例大约是3.0~5.0。与对应的16WT和18WT相比，L469A、L469S、L470A五聚体和单体的比例均显著增加。其中，突变体L469A表达得到的可溶性五聚体的产量最高，大约是野生型16WT蛋白的2倍。

表1. 体积排阻色谱分析纯化后16WT和L469A、L469S L1蛋白产率

（2）圆二色光谱（CD）：通过圆二色光谱分析突变体蛋白L469A与截断野生型16WT蛋白二级结构的差异，从而判断突变体蛋白是否正确折叠。扫描波长从190~260 nm，蛋白质浓度为2 mg/ml，比色皿厚度0.1 mm。根据CD光谱的结果（图10），表明野生型蛋白与突变体蛋白的五聚体在结构上没有明显差异，说明突变体蛋白折叠正确。

实施例5. HPV 16L1 L469A突变体蛋白类病毒颗粒制备及表征

将实施例4得到的突变体L469A蛋白五聚体放入10ml透析管中，在4℃条件下，500ml组装缓冲液（pH 5.0，20 mM磷酸缓冲液，1 M NaCl）中透析24个小时，每隔6个小时换一次透析液。

（1）动态光散射（DLS）：通过DLS检测组装后，突变体L469A颗粒的粒径分布及变化。以组装缓冲液为透析液、通过透析组装的方式进行由五聚体到VLPs的调控，组装时间为24 h。可以看出（图11）：突变体L469A L1蛋白组装后会形成粒径在~53 nm左右的颗粒；与野生型HPV病毒颗粒相似。

（2）透射电子显微镜（TEM）：进一步通过TEM检测组装后，突变体L469A颗粒的粒径及形貌。从图12可知，组装后，突变体L469A L1蛋白样品呈50nm 形貌均匀的病毒颗粒。

综合以上结果，与对应的截短野生型16WT、18WT相比，上述突变体L469S和L469A、L470A L1蛋白的可溶性五聚体产率均显著提高，并且可以进一步组装类病毒颗粒VLPs。由于h5中该位氨基酸位于蛋白的界面位置，暴露于水溶液中，增加该位氨基酸的亲水性能促进h5正确折叠，进而有利于L1蛋白的正确折叠，促进了五聚体的形成，显著提高了可溶性五聚体和类病毒颗粒VLPs的产率，有效地降低了疫苗的生产成本。

实施例6. HPV L1蛋白α-螺旋5“FPLGRKFL*LQAG”中亮氨酸L*突变的普遍性

把HPV L1蛋白C末端α-螺旋5“FPLGRKFL*LQAG”中的亮氨酸L*突变成更亲水性的丙氨酸（Ala，A）或丝氨酸（Ser, S）后，明显提高了L1蛋白可溶性五聚体的产率和由其组装成的类病毒颗粒VLPs的产率，从而有效地降低HPV疫苗的生产成本。通过实验比较HPV 6、11、16、18、31、33、34、35、39、45，5l、52、53、56、58、59、66、67、68、70、72、73或82、85、97型L1蛋白的h5序列（参见图3），在h5中的亮氨酸L*这一点是高度保守的，证明在h5中的这一点在L1蛋白结构和功能上具有重要的作用，并且这一点突变具有普适性，因而可以推广到上述HPV型别中。

实施例7. 人***瘤病毒疫苗制备及动物实验

分别测量纯化后的人***瘤病毒L1蛋白五聚体突变体HPV 16L1 L469A、HPV 16L1 L469S和HPV 18L1 L470A浓度为40μg/ml，各取500μL样品，加入250μL灭菌过的生理盐水，再加入稀释过的2μg/ml的磷酸铝佐剂250佐剂（Adju-Phos，购于Brenntag），室温旋转搅拌1小时，即获得20μg/ml的HPV  L1五聚体蛋白疫苗，4℃保存。

以每只100μL腹腔注射BALB/C小鼠，每个处理组10只。每3周免疫一次，共免疫2次。第2次免疫后四周后小鼠眼球取血，采用假病毒细胞中和实验法测定免疫后的小鼠血清中中和抗体滴度，结果如附图13所示。

　　<110> 北京康乐卫士生物技术股份有限公司

　　<120>

　　<140>

　　<160> A1

　　<210> A1

　　<211> 26

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> A1

tatataggat ccatgccgtc tgaagc                                             26

　　<120>

　　<140>

　　<160> A2

　　<210> A2

　　<211> 65

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> A2

tatatagcgg ccgcttaagc tttcagacca gcctgcagcg cgaatttacg acccagcggg        60

aactg                                                                    65

　　<120>

　　<140>

　　<160> B1

　　<210> B1

　　<211> 26

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> B1

tatataggat ccatgccgtc tgaagc                                             26

　　<120>

　　<140>

　　<160> B2

　　<210> B2

　　<211> 65

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> B2

tatatagcgg ccgcttaagc tttcagacca gcctgcagag agaatttacg acccagcggg        60

aactg                                                                    65

　　<120>

　　<140>

　　<160> C1

　　<210> C1

　　<211> 30

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> C1  

ataataggat ccatgccgtc tgataacacc                                         30

　　<120>

　　<140>

　　<160> C2

　　<210> C2

　　<211> 65

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> C2

tatatagcgg ccgcttaacg acgcagacca gcctgaaccg cgaatttacg acccagcggg        60

tactg                                                                    65                           

            

　　<120>

　　<140>

　　<160> 1

　　<210> 1

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人***瘤病毒 16亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 16）

　　<400> 1

atgccgtctg aagcgaccgt gtatctgccg ccggtgccgg tgtctaaagt ggtgtctacc        60

gatgaatatg tggcgcgtac caacatctac taccacgctg gtacctctcg tctgctggct       120

gttggtcacc cgtacttccc gatcaaaaaa ccgaacaaca acaaaatcct ggttccgaaa       180

gtttctggtc tgcagtaccg tgttttccgt atccacctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ttcccggaca cctctttcta caacccggac acccagcgtc tggtttgggc ttgcgttggt       300

gttgaagttg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtatct ctggtcaccc gctgctgaac       360

aaactggacg acaccgaaaa cgcttctgct tacgctgcta acgctggtgt tgacaaccgt       420

gaatgcatct ctatggacta caaacagacc cagctgtgcc tgatcggttg caaaccgccg       480

atcggtgaac actggggtaa aggttctccg tgcaccaacg ttgctgttaa cccgggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgat caacaccgtt atccaggacg gtgacatggt tgacaccggt       600

ttcggtgcta tggacttcac caccctgcag gctaacaaat ctgaagttcc gctggacatc       660

tgcacctcta tctgcaaata cccggactac atcaaaatgg tttctgaacc gtacggtgac       720

tctctgttct tctacctgcg tcgtgaacag atgttcgttc gtcacctgtt caaccgtgct       780

ggtgctgttg gtgaaaacgt tccggacgac ctgtacatca aaggttctgg ttctaccgct       840

aacctggctt cttctaacta cttcccgacc ccgtctggtt ctatggttac ctctgacgct       900

cagatcttca acaaaccgta ctggctgcag cgtgctcagg gtcacaacaa cggtatctgc       960

tggggtaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa catgtctctg      1020

tgcgctgcta tctctacctc tgaaaccacc tacaaaaaca ccaacttcaa agaatacctg      1080

cgtcacggtg aagaatacga cctgcagttc atcttccagc tgtgcaaaat caccctgacc      1140

gctgacgtta tgacctacat ccactctatg aactctacca tcctcgagga ctggaacttc      1200

ggtctgcagc cgccgccggg tggtaccctg gaagacacct accgtttcgt tacctctcag      1260

gctatcgctt gccagaaaca caccccgccg gctccgaaag aagacccgct gaaaaaatac      1320

accttctggg aagttaacct gaaagaaaaa ttctctgctg acctggacca gttcccgctg      1380

ggtcgtaaat tcctgctgca ggctggtctg aaagcttaa                             1419

　　<120>

　　<140>

　　<160> 2

　　<210> 2

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人***瘤病毒 16亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 16）

　　<400> 2

atgccgtctg aagcgaccgt gtatctgccg ccggtgccgg tgtctaaagt ggtgtctacc        60

gatgaatatg tggcgcgtac caacatctac taccacgctg gtacctctcg tctgctggct       120

gttggtcacc cgtacttccc gatcaaaaaa ccgaacaaca acaaaatcct ggttccgaaa       180

gtttctggtc tgcagtaccg tgttttccgt atccacctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ttcccggaca cctctttcta caacccggac acccagcgtc tggtttgggc ttgcgttggt       300

gttgaagttg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtatct ctggtcaccc gctgctgaac       360

aaactggacg acaccgaaaa cgcttctgct tacgctgcta acgctggtgt tgacaaccgt       420

gaatgcatct ctatggacta caaacagacc cagctgtgcc tgatcggttg caaaccgccg       480

atcggtgaac actggggtaa aggttctccg tgcaccaacg ttgctgttaa cccgggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgat caacaccgtt atccaggacg gtgacatggt tgacaccggt       600

ttcggtgcta tggacttcac caccctgcag gctaacaaat ctgaagttcc gctggacatc       660

tgcacctcta tctgcaaata cccggactac atcaaaatgg tttctgaacc gtacggtgac       720

tctctgttct tctacctgcg tcgtgaacag atgttcgttc gtcacctgtt caaccgtgct       780

ggtgctgttg gtgaaaacgt tccggacgac ctgtacatca aaggttctgg ttctaccgct       840

aacctggctt cttctaacta cttcccgacc ccgtctggtt ctatggttac ctctgacgct       900

cagatcttca acaaaccgta ctggctgcag cgtgctcagg gtcacaacaa cggtatctgc       960

tggggtaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa catgtctctg      1020

tgcgctgcta tctctacctc tgaaaccacc tacaaaaaca ccaacttcaa agaatacctg      1080

cgtcacggtg aagaatacga cctgcagttc atcttccagc tgtgcaaaat caccctgacc      1140

gctgacgtta tgacctacat ccactctatg aactctacca tcctcgagga ctggaacttc      1200

ggtctgcagc cgccgccggg tggtaccctg gaagacacct accgtttcgt tacctctcag      1260

gctatcgctt gccagaaaca caccccgccg gctccgaaag aagacccgct gaaaaaatac      1320

accttctggg aagttaacct gaaagaaaaa ttctctgctg acctggacca gttcccgctg      1380

ggtcgtaaat tcgcgctgca ggctggtctg aaagcttaa                             1419

　　<120>

　　<140>

　　<160> 3

　　<210> 3

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人***瘤病毒 16亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 16）

　　<400> 3　

atgccgtctg aagcgaccgt gtatctgccg ccggtgccgg tgtctaaagt ggtgtctacc        60

gatgaatatg tggcgcgtac caacatctac taccacgctg gtacctctcg tctgctggct       120

gttggtcacc cgtacttccc gatcaaaaaa ccgaacaaca acaaaatcct ggttccgaaa       180

gtttctggtc tgcagtaccg tgttttccgt atccacctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ttcccggaca cctctttcta caacccggac acccagcgtc tggtttgggc ttgcgttggt       300

gttgaagttg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtatct ctggtcaccc gctgctgaac       360

aaactggacg acaccgaaaa cgcttctgct tacgctgcta acgctggtgt tgacaaccgt       420

gaatgcatct ctatggacta caaacagacc cagctgtgcc tgatcggttg caaaccgccg       480

atcggtgaac actggggtaa aggttctccg tgcaccaacg ttgctgttaa cccgggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgat caacaccgtt atccaggacg gtgacatggt tgacaccggt       600

ttcggtgcta tggacttcac caccctgcag gctaacaaat ctgaagttcc gctggacatc       660

tgcacctcta tctgcaaata cccggactac atcaaaatgg tttctgaacc gtacggtgac       720

tctctgttct tctacctgcg tcgtgaacag atgttcgttc gtcacctgtt caaccgtgct       780

ggtgctgttg gtgaaaacgt tccggacgac ctgtacatca aaggttctgg ttctaccgct       840

aacctggctt cttctaacta cttcccgacc ccgtctggtt ctatggttac ctctgacgct       900

cagatcttca acaaaccgta ctggctgcag cgtgctcagg gtcacaacaa cggtatctgc       960

tggggtaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa catgtctctg      1020

tgcgctgcta tctctacctc tgaaaccacc tacaaaaaca ccaacttcaa agaatacctg      1080

cgtcacggtg aagaatacga cctgcagttc atcttccagc tgtgcaaaat caccctgacc      1140

gctgacgtta tgacctacat ccactctatg aactctacca tcctcgagga ctggaacttc      1200

ggtctgcagc cgccgccggg tggtaccctg gaagacacct accgtttcgt tacctctcag      1260

gctatcgctt gccagaaaca caccccgccg gctccgaaag aagacccgct gaaaaaatac      1320

accttctggg aagttaacct gaaagaaaaa ttctctgctg acctggacca gttcccgctg      1380

ggtcgtaaat tctctctgca ggctggtctg aaagcttaa                             1419　

    <120>

　　<140>

　　<160> 4

　　<210> 4

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人***瘤病毒 18亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 18）

　　<400> 4

atgccgtctg ataacaccgt gtatctgccg ccgccgtctg tggcgcgtgt ggtgaacacc        60

gatgattatg tgacccgtac ctctatcttc taccacgctg gttcttctcg tctgctgacc       120

gttggtaacc cgtacttccg tgttccggct ggtggtggta acaaacagga catcccgaaa       180

gtttctgctt accagtaccg tgttttccgt gttcagctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ctgccggaca cctctatcta caacccggaa acccagcgtc tggtttgggc ttgcgctggt       300

gttgaaatcg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtctgt ctggtcaccc gttctacaac       360

aaactggacg acaccgaatc ttctcacgct gctacctcta acgtttctga agacgttcgt       420

gacaacgttt ctgttgacta caaacagacc cagctgtgca tcctgggttg cgctccggct       480

atcggtgaac actgggctaa aggtaccgct tgcaaatctc gtccgctgtc tcagggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgaa aaacaccgtt ctggaagacg gtgacatggt tgacaccggt       600

tacggtgcta tggacttctc taccctgcag gacaccaaat gcgaagttcc gctggacatc       660

tgccagtcta tctgcaaata cccggactac ctgcagatgt ctgctgaccc gtacggtgac       720

tctatgttct tctgcctgcg tcgtgaacag ctgttcgctc gtcacttctg gaaccgtgct       780

ggtaccatgg gtgacaccgt tccgcagtct ctgtacatca aaggtaccgg tatgcgtgct       840

tctccgggtt cttgcgttta ctctccgtct ccgtctggtt ctatcgttac ctctgactct       900

cagctgttca acaaaccgta ctggctgcac aaagctcagg gtcacaacaa cggtgtttgc       960

tggcacaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa cctgaccatc      1020

tgcgcttcta cccagtctcc ggttccgggt cagtacgacg ctaccaaatt caaacagtac      1080

tctcgtcacg ttgaagaata cgacctgcag ttcatcttcc agctgtgcac catcaccctg      1140

accgctgacg ttatgtctta catccactct atgaactctt ctatcctcga ggactggaac      1200

ttcggtgttc cgccgccgcc gaccacctct ctggttgaca cctaccgttt cgttcagtct      1260

gttgctatca cctgccagaa agacgctgct ccggctgaaa acaaagaccc gtacgacaaa      1320

ctgaaattct ggaacgttga cctgaaagaa aaattctctc tggacctgga ccagtacccg      1380

ctgggtcgta aattcctggt tcaggctggt ctgcgtcgtt aa                         1422

    <120>

　　<140>

　　<160> 5

　　<210> 5

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人***瘤病毒 18亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 18）

　　<400> 5

atgccgtctg ataacaccgt gtatctgccg ccgccgtctg tggcgcgtgt ggtgaacacc        60

gatgattatg tgacccgtac ctctatcttc taccacgctg gttcttctcg tctgctgacc       120

gttggtaacc cgtacttccg tgttccggct ggtggtggta acaaacagga catcccgaaa       180

gtttctgctt accagtaccg tgttttccgt gttcagctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ctgccggaca cctctatcta caacccggaa acccagcgtc tggtttgggc ttgcgctggt       300

gttgaaatcg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtctgt ctggtcaccc gttctacaac       360

aaactggacg acaccgaatc ttctcacgct gctacctcta acgtttctga agacgttcgt       420

gacaacgttt ctgttgacta caaacagacc cagctgtgca tcctgggttg cgctccggct       480

atcggtgaac actgggctaa aggtaccgct tgcaaatctc gtccgctgtc tcagggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgaa aaacaccgtt ctggaagacg gtgacatggt tgacaccggt       600

tacggtgcta tggacttctc taccctgcag gacaccaaat gcgaagttcc gctggacatc       660

tgccagtcta tctgcaaata cccggactac ctgcagatgt ctgctgaccc gtacggtgac       720

tctatgttct tctgcctgcg tcgtgaacag ctgttcgctc gtcacttctg gaaccgtgct       780

ggtaccatgg gtgacaccgt tccgcagtct ctgtacatca aaggtaccgg tatgcgtgct       840

tctccgggtt cttgcgttta ctctccgtct ccgtctggtt ctatcgttac ctctgactct       900

cagctgttca acaaaccgta ctggctgcac aaagctcagg gtcacaacaa cggtgtttgc       960

tggcacaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa cctgaccatc      1020

tgcgcttcta cccagtctcc ggttccgggt cagtacgacg ctaccaaatt caaacagtac      1080

tctcgtcacg ttgaagaata cgacctgcag ttcatcttcc agctgtgcac catcaccctg      1140

accgctgacg ttatgtctta catccactct atgaactctt ctatcctcga ggactggaac      1200

ttcggtgttc cgccgccgcc gaccacctct ctggttgaca cctaccgttt cgttcagtct      1260

gttgctatca cctgccagaa agacgctgct ccggctgaaa acaaagaccc gtacgacaaa      1320

ctgaaattct ggaacgttga cctgaaagaa aaattctctc tggacctgga ccagtacccg      1380

ctgggtcgta aattcgcggt tcaggctggt ctgcgtcgtt aa                         1422

Claims (9)

1.一种人***瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：

人***瘤病毒L1蛋白C末端α-螺旋5 FPLGRKFL*LQAG中的亮氨酸L*突变成丙氨酸A或丝氨酸S。

2.根据权利要求1所述的人***瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：

所述人***瘤病毒L1蛋白是指6、11、16、18、31、33、34、35、39、45，5l、52、53、56、58、59、66、67、68、70、72、73或82、85、97型人***瘤病毒中一种和/或几种的组合。

3.权利要求1所述的人***瘤病毒 L1 蛋白突变体的多核苷酸为：SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO. 5。

4.包括权利要求3的多核苷酸的表达载体。

5.包含权利要求4的表达载体的细胞。

6.一种人***瘤病毒L1蛋白突变体的五聚体，其特征在于由权利要求1或2所述的蛋白形成。

7.根据权利要求6所述的人***瘤病毒 L1蛋白突变体的五聚体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以N端去掉4个氨基酸、C端去掉29个氨基酸的截短野生型人***瘤病毒16L1和18L1基因序列为模板，设计带有突变位点的寡聚脱氧核糖核酸引物，利用聚合酶链式反应技术，对含有突变位点的核苷酸片段进行扩增；

2）以pGEX-6p-1为载体片段，将突变体核苷酸片段连接于载体的多克隆位点上：BamH Ι和Not Ι，并将重组载体转化入宿主细胞DH5α中进行重组子的筛选；

3）获得重组载体后，以XA90为表达宿主细胞进行突变体蛋白的表达；

4）利用亲和层析以及体积排阻色谱纯化人***瘤病毒L1蛋白突变体的五聚体。

8.一种人***瘤病毒疫苗，其特征在于该疫苗包括权利要求6所述的人***瘤病毒L1蛋白突变体的五聚体和药用佐剂。

9.根据权利要求6所述的人***瘤病毒L1蛋白突变体的五聚体在制备预防治疗人***瘤病毒感染及导致疾病的药物中的应用。