CN110573523A - 基于aav载体的流感疫苗 - Google Patents

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Abstract

提供了一种非复制型重组腺相关相关病毒(rAAV)，其具有AAV衣壳，所述AAV衣壳具有包装在其中的载体基因组，所述载体基因组包含AAV反向末端重复序列和编码四个不同免疫球蛋白区域(a)、(b)、(c)和(d)的至少一个核酸序列。所述rAAV表达的免疫球蛋白用于提供针对甲型流感和乙型流感的被动免疫。本文还描述了含有所述rAAV的组合物。提供了对患者进行针对流感的疫苗接种的方法。

Description

基于AAV载体的流感疫苗
发明背景
流感感染是美国第七大死亡原因，相当于每年约49,000人死亡，占全球近500,000人死亡的很大一部分。疫苗并不是总能有效保护人免受流感的侵袭。此外，新的流感大流行的出现仍然是一个威胁，其可能会导致重大生命损失和全球经济破坏。水禽中巨大的甲型流感病毒库代表着持续的大流行威胁，例如人群中1997年的高致病性禽流感H5N1和2013年的H7N9的出现(J.Liu等人，Highly pathogenic H5N1 influenza virus infection inmigratory birds.Science 309，1206(2005)；H.Chen等人，Avian flu：H5N1 virusoutbreak in migratory waterfowl.Nature 436，191-192(2005)；以及R.Gao等人，Humaninfection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus.N.Engl.J.Med.368，1888-1897(2013))。每年流感大流行的经济负担估计为约870亿美元。这笔费用的一半以上用于将近100万患者所需的医院护理，其中70％是老年患者(＞65岁)。
腺相关病毒(AAV)是直径为20-26nm的非包膜二十面体单链DNA病毒。自从1980年代初期首次对作为基因递送载体的野生型AAV进行基因工程改造以来，重组AAV已成为慢性疾病基因治疗中有效且安全的临床应用的有前途的基因递送媒介物。AAV血清型2(AAV2)是第一个被作为载体用于基因转移应用的AAV。AAV2载体的一些局限性已经出现，包括低转导效率，人中和抗体(NAb)的高血清阳性率以及对衣壳的潜在破坏性T细胞应答。
用于递送抗流感抗体的理想的AAV衣壳应在人中具有低的血清阳性率，能够赋予高且稳定的转基因表达，对于中枢神经***或性腺具有最小的生物分布，并具有有利的免疫学特征。所选衣壳应易于以高产率制造，并且具有临床安全性历史。考虑选择的AAV衣壳包括已在基因疗法临床试验中测试过的那些AAV衣壳：AAV1、2、6、8、9和rh10。先前的工作表明，AAV9有效地靶向气道，并且可以在预先存在的AAV9特异性NAb的环境中有效地重新施用(Limberis和Wilson，2006，Proc Natl Acad Sci USA，103，35，12993-12998(2006))。最近，我们证明了表达FI6抗体的AAV9载体保护小鼠和雪貂二者对抗H1N1和H5N1流感毒株的多种临床分离株的致命空气传播攻击(Limberis等人，Sci Transl Med.2013年5月29日；5(187)：187ra72)。
仍然需要具有增强的性能特征的合适的替代流感疫苗。
附图说明
图1A提供了显示以下的vp1衣壳蛋白的氨基酸序列的比对：AAVhu68(SEQ ID NO：16，在比对中标记为hu.68.VP1)与AAV9(SEQ ID NO：17)、AAVhu31(SEQ ID NO：34，在比对中标记为hu.31)和AAVhu32(SEQ ID NO：35，在比对中标记为hu.32)。与AAV9、AAVhu31和AAVhu32相比，发现两个突变(A67E和A157V)在AAVhu68中是关键的，并在图1A中圈出。
图1B-1D提供了编码以下的vp1衣壳的核酸序列的比对：AAVhu68(SEQ ID NO：18，在比对中标记为hu.68.VP1)与AAV9(SEQ ID NO：36)、AAVhu31(SEQ ID NO：37，在比对中标记为hu.31)和AAVhu32(SEQ ID NO：38，在比对中标记为hu.32)。
图2A-2B显示了评估表达hJAb的AAV1、AAV9和AAVhu68载体对小鼠适应性甲型流感(PR8)致死性攻击的保护效力的评估结果。在图2A中，对6周龄的雌性BALB/c小鼠鼻内给予109基因组拷贝(GC)的在CB7启动子(即AAV.CB7.hJAb等)的转录控制下表达hJAb的AAV1、AAV9或AAVhu68载体(AAV1.hJAb，正方形；AAV9.hJAb，圆形；AAVhu68.hJAB，直立三角形；和未处理倒三角形)。将小鼠在7天后(此时记作第0天)用5LD50的PR8进行攻击，并每天称重。基于攻击当天的小鼠体重计算体重减轻百分比。在图2B中，当小鼠出现痛苦或如Kaplan-Meier图所示体重减轻＞30％时，对其实施安乐死。
图3A-3B显示了评估表达hJAb的AAV1、AAV9和AAVhu68载体对小鼠适应性乙型流感病毒(B/Lee/40)致死性攻击的保护效力的评估结果。图3A显示了向6周龄的雌性BALB/c小鼠鼻内给予109GC的表达hJAb的AAV载体(AAV1.hJAb，正方形；AAV9.hJAb，圆形；AAVhu68.hJAb，直立三角形；和未处理，倒三角形)并且在7天后(此时记作第0天)用5LD50的B/Lee/40进行攻击并每天称重的结果。基于攻击当天的小鼠体重计算体重减轻百分比。图3B示出了当小鼠出现痛苦或如Kaplan-Meier图所示体重减轻＞30％时对其实施安乐死的结果。
图4提供了在支气管肺泡灌洗液(BALF)中AAVhu68介导的hJAb表达谱。向六周龄的雌性BALB/c小鼠鼻内(IN)给予剂量范围为109GC至1011GC的表达hJAb的AAVhu68载体。7天后处死小鼠，收获BALF以通过蛋白A ELISA确定hJAb浓度。
图5A和5B显示了AAVhu68.CB7.JAb210a用于有效预防甲型流感(PR8)的MED的确定。向六周龄的雌性BALB/c小鼠IN给予剂量范围为3x108GC至1010GC的AAVhu68.CB7.JAb210a载体并且在7天后(此时记作第0天)用5LD50的PR8进行攻击并每天称重。基于攻击当天的小鼠体重计算体重减轻百分比，并在图5A中作图。图5B绘制了存活百分比。不论载体剂量如何，所有小鼠均在攻击中存活。
图6A和6B显示了AAVhu68.CB7.JAb210a用于有效预防乙型流感(B/Lee/40)的MED的确定。向六周龄的雌性BALB/c小鼠IN给予剂量范围为3x108GC至1010GC的AAVhu68.CB7.JAb210a载体并且在7天后(此时记作第0天)用5LD50的B/Lee/40进行攻击并每天称重。基于攻击当天的小鼠体重计算体重减轻百分比，并在图6A中作图。图6B绘制了存活百分比。不论载体剂量如何，所有小鼠均在攻击中存活。
图7A-7C显示了AAVhu68.CB7.CI.JAb210a介导的针对甲型流感(PR8)的预防的快速起效。图7A提供了时间轴，其显示6周龄的雌性BALB/c小鼠接受了1010GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a，并且在一天、两天、三天或七天后用5LD50的PR8对载体处理的小鼠组进行攻击。图7B是显示在载体施用后的多个时间点进行攻击的动物的体重百分比变化(％)的线图。将被攻击的动物每天称重，如x轴上的数据点所示。基于攻击当天小鼠的体重计算体重减轻百分比。图7C图示了PR8攻击后的存活百分比。这些数据表明，不论载体给药和5LD50的PR8的攻击之间的时间间隔如何，所有接受AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体的小鼠均在攻击中存活。
图8A-8D显示了AAVhu68.CB7.CI.JAb210a介导的针对乙型流感(B/Lee/40)的预防的快速起效。图8A是时间轴，其显示6周龄的雌性BALB/c小鼠接受了109或1010GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a，并且在一天、两天、三天或七天后用5LD50的B/Lee/40对小鼠组进行攻击。图8B显示了给予109GC AAVhu68.CB7.CI.JAb210a的小鼠，基于攻击当天的小鼠体重计算的体重减轻百分比。图8C显示，不论载体给药和B/Lee/40攻击之间的时间间隔如何，所有小鼠均在攻击中存活。图8D显示了给予1010GC AAVhu68.CB7.CI.JAb210a的小鼠，基于攻击当天的小鼠体重计算的体重减轻百分比。不论载体给药和B/Lee/40攻击之间的时间间隔如何，所有小鼠均在攻击中存活。
图9A-9F显示了血清循环AAVhu68中和抗体(NAb)对AAVhu68.CB7.CI.JAb210a介导的针对PR8致死性攻击的预防效力的影响。在初始暴露于AAVhu68.CB.LacZ载体(给予以诱导针对AAVhu68的NAb)之后约30天，向具有不同水平的预先存在的血清循环AAVhu68特异性NAb的6周龄雌性BALB/c小鼠组IN给予109GC(图9A)、3x 109GC(图9B)和1010GC(图9C-9F)的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体。将小鼠在7天后(此时记作第0天)用5LD50的PR8进行攻击并每天称重。基于感染当天的体重计算体重百分比。
图10A-10C显示了血清循环AAVhu68中和抗体(NAb)对AAVhu68.CB7.CI.JAb210a介导的针对PR8致死性攻击(第90天)的预防效力的影响。在初始暴露于AAVhu68.CB.LacZ载体(给予以诱导针对AAVhu68的NAb)之后90天，向具有不同水平的预先存在的血清循环AAVhu68特异性NAb的雌性BALB/c小鼠组IN给予109GC(图10A)、3x 109GC(图10B)和1010GC(图10C)的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体。将小鼠在7天后用5LD50的PR8进行攻击(此时记作第0天)并每天称重。基于感染当天的体重计算体重百分比。
图11描绘了在小鼠中表达hJAb的AAVhu68载体的生物分布谱。向六周龄的雌性BALB/c小鼠IN给予剂量范围为1011GC(高)至109GC(低)的AAVhu68.CB7.hJAb载体并且在7天后进行尸检。收集组织(肺、肝、脾、心脏和脑)以进行生物分布分析。虚线代表测定背景。对于每种组织，从左到右的五个条形分别代表从用1011GC、3x1010GC、1010GC、3x109GC和109GC处理的小鼠收集的数据。当使用高剂量的AAVhu68载体时(图11和12)，在除肺以外的组织中检测到AAVhu68载体基因组。
图12A和12B提供了小鼠中表达JAb210a的AAVhu68载体的生物分布谱。向六周龄的雌性BALB/c小鼠IN给予高剂量1011GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体。三十天后，对小鼠进行尸检。收集组织(肺、脾、气管、肾、肝、心脏、脑、卵巢和眼睛)以进行生物分布分析。虚线代表测定背景。图12A显示了为每二倍体细胞的GC的数据，而图12B显示了为每μg DNA的GC的数据。当使用高剂量的AAVhu68载体时(图11和12)，在除肺以外的组织中检测到AAVhu68基因组。图12A显示大部分载体基因组沉积发生在肺中，然后是脾。肾、肝和心脏中存在非常低水平的AAVhu68载体基因组(图12A)。此外，脑、卵巢或眼睛中的AAVhu68基因组水平太接近背景，以致无法准确解释数据(图12A)。在图12B中，对于肺和脾(左)，描绘GC/μg DNA的大小为100-106，相比之下代表比例代表气管、肾、肝、心脏、脑、卵巢、眼睛和视神经的条形图的大小为100-104。
图13A和13B证明了AAVhu68.CB7.CI.JAb210a在老年小鼠(9-18月龄)中的保护谱。BALB/c小鼠接受109GC或3x109GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a，并且在七天后用5LD50的PR8进行攻击。图13A是显示在载体施用后7天进行攻击的老年小鼠的体重变化百分比(％)的线图。将小鼠每天称重，如x轴上的数据点所示。基于流感攻击当天的体重计算体重减轻百分比。图13B图示了PR8攻击后的存活百分比。这些数据显示，所有接受AAVhu68.CB7.CI.JAb210a的小鼠均在5LD50的PR8的攻击中存活。未处理小鼠在第8天实施安乐死。
图14A至图14C显示了AAV表达的MD3606在用流感病毒攻击的小鼠中的预防效力。在用致死剂量(5LD50)的小鼠适应的H1N1(A/Puerto Rico/8/34-MA)(图14A)、小鼠适应的H3N2(A/Hong Kong/1/68-MA)(FIG 14B)或小鼠适应的乙型(B/Lee/40-MA)病毒(图14C)攻击前7天用指示剂量的AAV9.MD3606载体[表示为基因组拷贝(GC)]经鼻内处理的BALB/c小鼠的生存曲线(上图)和体重减轻(下图)。
图15提供了AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体基因组的示意图。
图16提供了如实施例16中所述的载体基因组质粒的示意图。
图17A至17B提供了AAV反式质粒的示意图。图17A提供了AAV2/hu68反式包装质粒pAAV2/hu68的线性表示。在图17B中，用卡那霉素抗性基因代替pAAV2/hu68(p0065)中的氨苄青霉素抗性基因，得到pAAV2/hu68.KanR(p0068)。
图18A至18B提供了腺病毒辅助质粒的示意图。图18A提供了从亲本质粒pBHG10通过中间体pAdΔF1和pAdΔF5衍生辅助质粒pAdΔF6。在图18B中，用卡那霉素抗性基因代替pAdΔF6中的氨苄青霉素抗性基因，得到pAdΔF6(Kan)。通过由Qiagen Genomic Services执行的DNA质粒测序确认这三个腺病毒基因的身份。DNA分析显示与三个5型腺病毒基因区域(GenBank登录号AF369965)具有100％的同源性。
图19A至19B提供了如实施例16中所述的制造工艺流程图。
图20显示了AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG介导的Rag KO小鼠对甲型流感的攻击的预防。Rag KO小鼠接受了1010GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG(以圆圈表示)，并在7天后用5LD50的PR8对小鼠进行攻击并每天称重。由于到第8天时的进展性体重减轻，对未处理小鼠(倒三角形)实施了安乐死。
图21A至21B显示了AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG介导的Rag KO小鼠对流感的第二次攻击的预防。将在5LDL50PR8攻击中存活的载体处理的Rag KO小鼠用5LD50的B/Lee/40再次攻击并每天称重。由于到第8天时的进展性体重减轻，对未处理小鼠(三角形)实施了安乐死。阳性对照的小鼠(圆圈)是给予AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体并在7天后用5LD50的B/Lee/40进行攻击的小鼠；所有小鼠均在攻击中存活。正方形描绘了在预先暴露于甲型流感(PR8，图20)之后进行B/Lee/40攻击的载体处理的小鼠。
图22提供了恒河猴中表达恒河猴甲胎蛋白(rhAFP)的AAV9载体的生物分布图。作为直接液体滴注(圆圈)或通过MAD NasalTM(蓝色方块)给予动物总剂量为2x1013GC的AAV9.CB7.rhAFP，并在99天后进行尸检。收获组织用于生物分布分析。测定背景为25个基因组拷贝/500ng组织DNA。
发明内容
提供了编码抗流感病毒构建体的非复制型重组腺相关相关病毒(rAAV)。所述rAAV具有包装在AAV衣壳中的载体基因组。本文提供的组合物包含从rAAV表达的以下抗流感免疫球蛋白区域的组合的载体基因组编码序列。第一免疫球蛋白区域具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列：(Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ile Ser Ile Phe Asp Ile Tyr Ala Met Asp TrpTyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Val Ser Phe Arg Asp GlySer Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn SerLys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val TyrTyr Cys His Val Ser Leu Tyr Arg Asp Pro Leu Gly Val Ala Gly Gly Ile Gly ValTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser)。在某些实施方案中，代替SEQ IDNO：1，可以选择使用具有含I110M突变的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的替代免疫球蛋白区域，其作为SEQ ID NO：30的aa 24至aa 147再现。第二免疫球蛋白区域具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列：Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Ala Met Gly Trp Phe ArgGln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu PheVal Ala Ala Ile Asn Ala Leu Gly Thr ArgThr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser LysAsn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys Thr Ala Gln Gly Gln Trp Arg Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Glu Tyr GluPhe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser)。第三免疫球蛋白区域具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列：(Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro GlyGly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Glu Asn Lys Ala IleGly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu Cys Ile Ser LysSer Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser ArgAsp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Thr Thr Ala Gly Gly Gly Leu Cys Trp Asp Gly ThrThr Phe Ser Arg Leu Ala Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser)。第四免疫球蛋白区域具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列：(Glu Val Gln Leu Val Glu SerGly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser GlyPhe Thr Phe Ser Thr Ser Trp Met Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly LeuGlu Trp Val Ser Val Ile Asn Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val LysGly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met AsnSer Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Trp Gly Gly ProGlu Pro Thr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser)。
在某些实施方案中，本文所述的多于一个免疫球蛋白区域在融合构建体中，所述融合构建体还包含Fc区，其中任选地存在连接四个免疫球蛋白区域与Fc区的连接序列。
在某些实施方案中，载体基因组包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32。在某些实施方案中，提供了组合物，其包含载剂、稀释剂或赋形剂，和至少如本文所述的非复制型rAAV的原种。该组合物可以配制成用于鼻内、肌内或静脉内施用。
在某些实施方案中，提供了一种用于对人患者进行针对流感的免疫接种的方法，其包括施用有效量的包含本文所述的rAAV.JAb、rAAV.hJAb或rAAV.JAb210a的组合物。所述组合物可包含约109GC至约7x1013GC的剂量的rAAV.JAb、rAAV.hJAb或rAAV.JAb210a。在某些实施方案中，选择AAVhu68衣壳。在另一些实施方案中，提供了一种产品，其包括容器和包含如本文所述的rAAV.JAb、rAAV.hJAb或rAAV.JAb210a的组合物，任选地具有稀释剂和施用说明。
在以上实施方案的当前优选形式中，rAAV具有AAVhu68衣壳。在另一个实施方案中，rAAV具有AAV9衣壳。在另一个实施方案中，rAAV具有AAV1衣壳。
在某些实施方案中，本文提供的rAAV.JAb和包含rAAV.JAb的组合物可用于对人患者进行针对流感的疫苗接种或免疫接种。
在某些实施方案中，提供了rAAV.JAb或包含rAAV.JAb的组合物用于对人患者进行针对流感的疫苗接种或免疫接种的用途。
通过本发明的以下详细描述，本发明的这些和其他优点将变得明显。
具体实施方式
本发明提供了重组载体，其在体内表达抗流感抗体构建体，并且可用于提供针对甲型流感和/或乙型流感感染的被动免疫。在某些实施方案中，载体是具有新的进化枝F衣壳(在本文中称为AAVhu68)的复制缺陷型重组腺相关病毒(rAAV)。
在某些实施方案中，rAAV表达的抗体(Ab)构建体表现出针对甲型流感和/或乙型流感病毒的中和活性。在某些实施方案中，本发明的Ab构建体阻止甲型或乙型流感病毒感染宿主细胞，相对于在不存在Ab构建体的情况下所述流感病毒对宿主细胞的感染，阻止至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。抗体介导的中和活性可以例如如本文所述进行测量。测量中和活性的替代测定方法在例如WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance，Geneva：WorldHealth Organisation，2005，2002.5版中描述。通常，如在体外病毒中和测定(VNA)中测定的，根据本发明的结合分子的中和活性为1000nM或更小，优选为100nM或更小，更优选为10nM或更小，甚至更优选为1nM或更小。
在某些优选的实施方案中，提供了组合物，其中复制缺陷型腺相关载体表达四个抗流感免疫球蛋白结构域中的每一个，所述四个抗流感免疫球蛋白结构域被设计用于提供针对甲型流感和乙型流感病毒株的免疫力。在某些实施方案中，全部四个免疫球蛋白结构域均由单个rAAV载体原种表达。在此实施方案中，单个rAAV载体原种可以包含单顺反子表达盒或双顺反子表达盒。在另一些实施方案中，免疫球蛋白结构域从多于rAAV载体原种表达。在此实施方案中，rAAV可具有单顺反子或双顺反子表达盒。
在一个实施方案中，rAAV载体原种包含载体基因组，其中如本文所述的一个、两个、三个或四个免疫球蛋白结构域被表达为融合蛋白。这样的融合蛋白可以包含免疫球蛋白Fc区和/或铰链区，其中任选地存在连接四个免疫球蛋白区域中的两个或更多个的连接序列。任选地，在免疫球蛋白结构域与Fc区和/或铰链区之间可以存在连接序列。连接序列可以紧邻第一结构域(区域)的C-末端和第二结构域(区域)的N-末端，用于分离两个、三个或四个结构域或区域。可以选择长度为约1至20个氨基酸的任何合适的序列，但是优选地长度为3至18个氨基酸，或约5至约12个氨基酸。多个连接序列可以存在于单个编码的蛋白质序列中，并且这些可以独立地选择。在一个实施方案中，至少一个连接序列是GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：7)。
在某些实施方案中，表达的免疫球蛋白或免疫球蛋白融合蛋白包含在宿主细胞内引导表达的蛋白质的信号肽。任选地，信号肽可以来自对于免疫球蛋白而言外源的来源。以下实例举例说明了使用人白介素2信号肽。但是，可以选择其他合适的信号肽，例如人或病毒的。在一个实施方案中，信号肽的氨基酸序列在SEQ ID NO：6中再现。
在某些实施方案中，两个免疫球蛋白区域与第一Fc连接以形成第一链，而另外两个免疫球蛋白区域与第二Fc连接以形成第二链。这样的表达盒构建体将通常在两条链的编码序列之间包含F2A或IRES。
在某些实施方案中，四个免疫球蛋白区域在单个开放阅读框中与Fc区连接。在一个实施方案中，融合构建体包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
根据对结构域的以下描述，本文提供的四个免疫球蛋白域的这些和其他构型对于本领域技术人员将是明显的。
抗体“Fc区”是指可结晶的片段，其是抗体的与细胞表面受体(Fc受体)相互作用的区域。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1 Fc。在一个实施方案中，Fc区是人IgG2 Fc。在一个实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc。在一个实施方案中，Fc区是工程化的Fc片段。参见，例如Lobher，Elisabeth等人″Engineered IgG1-Fc-one fragment to bind them all.″Immunological reviews 270.1(2016)：113-131；Saxena，Abhishek和Donghui Wu.″Advances in therapeutic Fc engineering-modulation of IgG-Associated effectorfunctions and serum half-life.″Frontiers in immunology 7(2016)；Irani，Vashti等人″Molecular properties of human IgG subclasses and their implicatiohs fordesigning therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.″Molecular immunology 67.2(2015)：171-182；Rath，Timo等人″Fc-fusion proteins andFcRn：structural insights for longer-lasting and more effective therapeutics.″Critical reviews in biotechnology 35.2(2015)：235-254；以及Invivogen，IgG-FcEngineering For Therapeutic Use，www.invivogen.com/docs/Insight200605.pdf，2006年4月；它们的每一个通过引用并入本文。在另一个实施方案中，Fc区具有在SEQ ID NO：11中再现的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc区能够在靶组织中诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在某些实施方案中，Fc区能够诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
抗体“铰链区”是IgG和IgA免疫球蛋白类别的重链的柔性氨基酸部分，其通过二硫键连接这两条链。在一个实施方案中，铰链具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
“免疫球蛋白分子”是包含共价偶联在一起的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的免疫活性部分并且能够与抗原特异性结合的蛋白质。免疫球蛋白分子是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文可以互换使用。
“免疫球蛋白重链”是包含免疫球蛋白的抗原结合结构域的至少一部分和免疫球蛋白重链的可变区的至少一部分或免疫球蛋白重链的恒定区的至少一部分的多肽。因此，免疫球蛋白来源的重链具有与免疫球蛋白基因超家族的成员的显著的氨基酸序列同源性区域。例如，Fab片段中的重链是免疫球蛋白来源的重链。
“免疫球蛋白轻链”是包含免疫球蛋白的抗原结合结构域的至少一部分和免疫球蛋白轻链的可变区的至少一部分或恒定区的至少一部分的多肽。因此，免疫球蛋白来源的轻链具有与免疫球蛋白基因超家族成员显著的氨基酸序列同源性区域。
“免疫粘附素”是组合了结合蛋白(通常是受体、配体、抗体scFv片段或细胞粘附分子)的功能结构域与免疫球蛋白恒定结构域(通过包括铰链和Fc区)的嵌合的抗体样分子。
“片段抗原结合”(Fab)片段”是抗体上与抗原结合的区域。其由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。
如本文所用，单结构域抗体(sdAb)是由单个单体可变抗体结构域组成的结合分子，其不依赖于其他V区或结构域而特异性结合抗原或表位。单结构域抗体(sdAb)是本领域已知的，并且通常来源于天然存在的“仅重链(heavy chain only)”抗体，即不含轻链的重链抗体。这种仅重链抗体可获自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼或羊驼(也称为骆驼科动物抗体)。来自所述仅重链抗体的可变区通常被称为VHH结构域或sdAb。如本文所用的sdAb还指从包含两个重链和两个轻链的常规免疫球蛋白分离的单个可变结构域(VL或VH)。该免疫球蛋白可以包含人源化序列或其他非骆驼科来源的区域。
如本文所用，术语“多结构域抗体”是指包含至少两个彼此直接或通过连接序列连接的人源化VHH抗体的结合分子。
如本文所用，术语“NAb效价”是产生多少中和抗体(例如抗AAV NAb)的量度，所述中和抗体中和其靶向表位(例如AAV)的生理作用。抗AAV NAb效价可以如在例如以下中所述测量：Calcedo，R.等人，Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies toAdeno-Associated Viruses.Journal of Infectious Diseases，2009，199(3)：第381-390页，其通过引用并入本文。
缩写“sc”指的是自身互补的。“自身互补AAV”是指其中由重组AAV核酸序列携带的编码区被设计形成分子内双链DNA模板的构建体。在感染时，不是等待细胞介导的第二链的合成，scAAV的两个互补半部将结合形成准备立即复制和转录的一个双链DNA(dsDNA)单元。参见，例如，D M McCarty等人，“Self-complementary recombinant adeno-associatedvirus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently ofDNAsynthesis”，Gene Therapy，(2001年8月)，第8卷，编号16，第1248-1254页。自身互补的AAV描述于例如美国专利号6,596,535、7,125,717和7,456,683中，每一个都通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指与目的基因连续的表达控制序列和以反式或一定距离作用以控制目的基因的表达控制序列。
如本文所用，“不同特异性”表示提及的免疫球蛋白构建体(例如全长抗体、重链或能够与特异性靶标结合的其他构建体)与不同的靶标位点结合。这些可以指相同抗原上的不同靶标，相同病原体的不同毒株(例如不同的病毒株)或不同的抗原。
“相同特异性”是指免疫球蛋白与特异性靶位点结合的能力，所述靶位点可存在于病原体(例如流感病毒)的多个毒株中或病毒或其他病原体的单个或部分菌株上。适当地，这些特异性使得与非靶位点不存在显著或可测量的结合。
当涉及蛋白质或核酸使用时，术语“异源”表示蛋白质或核酸包含两个或更多个序列或亚序列，其在自然界中彼此之间没有相同的关系。例如，该核酸通常是重组产生的，具有来自不相关基因的两个或更多个序列，其被排列成新的功能性核酸。例如，在一个实施方案中，核酸具有来自一个基因的启动子，该启动子被排列成指导来自不同基因的编码序列的表达。因此，对于编码序列，启动子是异源的。术语“异源轻链”是含有来自抗体的可变结构域和/或恒定结构域的轻链，其具有与重链的特异性不同的靶特异性。
“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指合成或人工病毒颗粒，其中含有目的基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中，其中也包装在病毒衣壳或包膜中的任何病毒基因组序列是复制缺陷的；即，其不能产生子代病毒体，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，病毒载体的基因组不包括编码复制所需的酶的基因(基因组可以被设计成“无能力的(gutless)”-仅包含两侧是人工基因组扩增和包装所需的信号的目的转基因)，但是这些基因可以在生产过程中提供。因此，由于除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生子代病毒粒子的复制和感染，所以被认为对用于基因治疗是安全的。
“重组AAV”或“rAAV”是含有两种元件的DNA酶抗性病毒颗粒：AAV衣壳和包装在AAV衣壳内的包含至少非AAV编码序列的载体基因组。在某些实施方案中，衣壳含有由vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白构成的约60个蛋白质，其自组装形成衣壳。除非另有说明，否则“重组AAV”或“rAAV”可与短语“rAAV载体”互换使用。rAAV是“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”，因为其缺少任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因并且不能产生子代。在某些实施方案中，唯一的AAV序列是AAV反向末端重复序列(ITR)，其通常位于载体基因组的最5’和3’末端，以使位于ITR之间的基因和调节序列包装在AAV衣壳内。
术语“核酸酶抗性”表示AAV衣壳组装在表达盒周围，其被设计用于将基因递送至宿主细胞并保护这些包装的基因组序列在核酸酶孵育步骤期间免于降解(消化)，核酸酶孵育步骤被设计用于除去可能存在于生产过程中的污染核酸。
如本文所用，“载体基因组”是指包装在形成病毒颗粒的rAAV衣壳内的核酸序列。这样的核酸序列包含AAV反向末端重复序列(ITR)。在本文的该实例中，载体基因组至少以5’至3’包含AAV 5’ITR、编码序列和AAV 3’ITR。可以选择来自AAV2(与衣壳的来源AAV不同)的ITR或者除了全长ITR之外的ITR。在某些实施方案中，ITR来自与在生产期间提供rep功能的AAV相同的AAV来源或反式互补AAV。此外，可以使用其他ITR。此外，载体基因组包含指导基因产物表达的调节序列。本文更详细地讨论了载体基因组的合适组分。
在某些实施方案中，用于制备rAAV的非病毒遗传元件被称为载体(例如，生产载体)。在某些实施方案中，这些载体是质粒，但也考虑使用其他合适的遗传元件。这样的生产质粒可编码在rAAV产生期间表达的序列，例如，对于产生rAAV所需的AAV衣壳或rep蛋白，其未包装入rAAV。或者，这样的生产质粒可以携带包装在rAAV中的载体基因组。
如本文所用，“表达盒”是指包含编码序列、启动子，并且可包含其他调节序列的核酸分子。在某些实施方案中，载体基因组可以包含两个或更多个表达盒。在另一些实施方案中，术语“转基因”可以与“表达盒”互换使用。
在本发明的上下文中，术语“翻译”涉及在核糖体处的过程，其中mRNA链控制氨基酸序列的装配以产生蛋白质或肽。
与甲型流感病毒相关的术语“流感病毒亚型”是指以血凝素(H)和神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白的多种组合为特征的甲型流感病毒株。甲型流感病毒亚型可通过其H编号来指代，例如“包含H1或H3亚型的HA的流感病毒”或“H1流感病毒”“H3流感病毒”，或通过H编号和N编号的组合来指代，例如流感病毒亚型″H3N2″或″H5N1″。术语流感病毒“亚型”特别包括该亚型内的所有个体流感病毒“毒株”，其通常是由突变引起并显示出不同的致病性，并且包括天然分离株以及人工突变体或重组体等。这样的毒株也可以称为病毒亚型的各种“分离株”。因此，如本文所用，术语“毒株”和“分离株”可以互换使用。
如本文所用，术语“流感”或“流感病毒疾病”是指由甲型或乙型流感病毒感染细胞或受试者引起的病理状况。在特定的实施方案中，该术语是指由甲型或乙型流感病毒引起的呼吸***疾病。如本文所用，术语“流感病毒感染”是指流感病毒在细胞或受试者中的侵袭、繁殖和/或存在。
本文所述的载体表达了新的抗流感抗体构建体，其提供被动免疫，并且如果其在施用之后在人群中保护对抗甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染的一种或多种毒株的感染和/或降低与流感感染有关的症状，则其是治疗有效的。这样的症状可能包括但不限于发烧(发冷)、咳嗽、喉咙痛、流鼻涕或鼻塞、肌肉或身体疼痛、头痛、疲劳(疲倦)以及继发细菌感染(例如支气管炎和肺炎)的风险。
如本文所用，“免疫球蛋白构建体”、“抗体构建体”或“aAb构建体”可互换使用，是指能够与靶位点结合的构建体。在一个实施方案中，靶位点是抗原的表位或病原体的位点。在另一个实施方案中，靶位点是流感病毒的表位。在一个实施方案中，Ab构建体选自但不限于免疫球蛋白分子、免疫粘附素、单结构域抗体、多结构域抗体、全长抗体、免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。
术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并且包括RNA或RNA和蛋白质的产生。关于RNA，术语“表达”或“翻译”尤其涉及肽或蛋白质的产生。表达可以是瞬时的或稳定的。
如本文所用，“有效量”是指rAAV组合物的量，其在靶细胞中递送和表达足以减少或预防流感感染的抗流感抗体的量。可以基于动物模型而不是人患者来确定有效量。本文描述了合适的鼠模型的实例。
如本文所用，术语“靶组织”是指本文所描述的实施方案、方案或组合物靶向的组织、器官或细胞类型。在一个实施方案中，靶组织是呼吸器官或呼吸组织。在替代或另外的实施方案中，靶组织是肺。在替代或另外的实施例中，靶组织是鼻。在替代或另外的实施方案中，靶组织是鼻咽。在替代或另外的实施方案中，靶组织是呼吸道上皮。在替代或另外的实施方案中，靶组织是鼻气道上皮。在替代或另外的实施方案中，靶组织是鼻细胞。在替代或另外的实施方案中，靶组织是鼻咽细胞。在替代或另外的实施方案中，靶组织是鼻上皮细胞，其可以是纤毛鼻上皮细胞、柱状上皮细胞、杯状细胞(其将粘液分泌到由纤毛上皮细胞构成的鼻腔表面上)和在鼻咽表面排列的分层的鳞状鼻上皮细胞。在替代或另外的实施方案中，靶组织是肺上皮细胞。在另一些实施方案中，靶组织是肌肉，例如骨骼肌。
如上所述，除非另有说明，否则术语“约”在用于修饰数值时意指±10％的变化。
在整个说明书和权利要求书中使用的术语“包括(comprise)”和“包含(contain)”及其变体，包括“包括(comprises)”，“包括(comprising)”，“包含(contains)”和“包含(containing)”等其他变体，还包括其他组件、元素、整数、步骤等。术语“由...组成(consists of)”或“由...组成(consisting of)”不包含其他组件、元素、整数、步骤等。
应当注意，未用数量词限定的名词是指一个/种或多个/种，例如“增强剂”应理解为代表一种或多种增强剂。因此，未用数量词限定的名词、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
关于这些发明的描述，意图是本文所述的每种组合物在另一个实施方案中可用于本发明的方法。另外，意图还是本文所述在该方法中有用的每种组合物本身在另一个实施方案中也是本发明的实施方案。
除非在本说明书中另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义，并且通过参考公开的文本，其为本领域技术人员提供了对本申请中使用的许多术语的一般指引。
I.抗流感抗体转基因
本文所述的组合物被设计为表达四个抗免疫球蛋白区域，所述四个抗免疫球蛋白区域任选地表达为一种或多种融合蛋白。将理解的是，以下对“第一”、“第二”、“第三”和“第四”的引用用于阐明引用哪个区域。但是，这不限于它们从载体基因组表达的顺序或它们在融合蛋白中出现的顺序。因此，融合蛋白可包含位于第一区域或第二区域的上游或下游的“第三”区域，和/或“第一”区域可位于“第二”、“第三”或“第四”区域的下游。
在某些实施方案中，选择具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第一免疫球蛋白区域：Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu ArgLeu Ser Cys Ala Ala Ser Ile Ser Ile Phe Asp Ile Tyr Ala Met Asp Trp Tyr ArgGln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Val Ser Phe Arg Asp Gly Ser ThrTyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys AsnThr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysHis Val Ser Leu Tyr Arg Asp Pro Leu Gly Val Ala Gly Gly Ile Gly Val Tyr TrpGly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser。在某些实施方案中，允许该氨基酸序列中的一些变化，即，本发明涵盖了与该序列具有约95％至约99％同一性的序列。换句话说，SEQID NO：1的1、2、3、4、5或6个氨基酸可以被修饰。在一个实施方案中，替代的第一免疫球蛋白区域是指具有含I110M突变的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的免疫球蛋白区域，其作为SEQ IDNO：30的aa 24至aa 147再现。在某些实施方案中，这些氨基酸序列保守变化。但是，可以选择非保守残基。如本文所用，术语“保守变化”是指将氨基酸改变为具有相似生物化学性质(例如，电荷、疏水性和大小)的另一种氨基酸。
在某些实施方案中，第二免疫球蛋白区域具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列：GluVal Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg LeuSer Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro GlyLys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Asn Ala Leu Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr AlaAsp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu TyrLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala GlnGly Gln Trp Arg Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Glu Tyr Glu Phe Trp Gly GlnGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser。在某些实施方案中，在该氨基酸序列中允许一些变化，即，本发明涵盖了与该序列具有约95％至约99％同一性的序列。换句话说，SEQ ID NO：2的1、2、3、4、5或6个氨基酸可以被修饰。在某些实施方案中，这些氨基酸序列保守变化。
第三免疫球蛋白区域具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列：Glu Val Gln Leu Leu GluSer Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala SerGly Phe Thr Leu Glu Asn Lys Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys GluArg Glu Gly Val Leu Cys Ile Ser Lys Ser Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp SerVal Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu GlnMet Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Thr Thr AlaGly Gly Gly Leu Cys Trp Asp Gly Thr Thr Phe Ser Arg Leu Ala Ser Ser Trp GlyGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser。在某些实施方案中，在该氨基酸序列中允许一些变化，即，本发明涵盖了与该序列具有约95％至约99％同一性的序列。换句话说，SEQ IDNO：3的1、2、3、4、5或6个氨基酸可以被修饰。在某些实施方案中，这些氨基酸序列保守变化
第四免疫球蛋白区域具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列：Glu Val Gln Leu Val GluSer Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala SerGly Phe Thr Phe Ser Thr Ser Trp Met Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys GlyLeu Glu Trp Val Ser Val Ile Asn Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser ValLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Trp Gly GlyPro Glu Pro Thr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser。在某些实施方案中，在该氨基酸序列中允许一些变化，即，本发明涵盖了与该序列具有约95％至约99％同一性的序列。换句话说，SEQ ID NO：4的1、2、3、4、5或6个氨基酸可以被修饰。在某些实施方案中，这些氨基酸序列保守变化
进一步在本发明范围内的是编码免疫球蛋白区域和本文所述的其他蛋白质、肽和片段的核酸序列。例如，在SEQ ID NO：5的nt2052-2423、SEQ ID NO：13的nt 1840-2211、SEQID NO：14的nt 2052-2423、SEQ ID NO：15的nt 2052-2423、SEQ ID NO：19的nt 1840-2111、SEQ ID NO：20的nt 1210-1581、SEQ ID NO：21的nt 55-486和SEQ ID NO：32的nt 70-441中，提供了具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的免疫球蛋白区域的合适编码序列的实例。
例如，在SEQ ID NO：5的nt 2454-2822、SEQ ID NO：13的nt 2242-2160、SEQ IDNO：14的nt 2454-2822、SEQ ID NO：15的nt 2454-2822、SEQ ID NO：19的nt 2242-2610、SEQID NO：20的nt 1612-1980、SEQ ID NO：21的nt 517-885和SEQ ID NO：32的nt 472-840中，提供了具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的免疫球蛋白区域的合适编码序列的实例。
例如，在SEQ ID NO：5的nt 2853-3239、SEQ ID NO：13的nt 2641-3027、SEQ IDNO：14的nt2853-3239、SEQ ID NO：15的nt 2853-3239、SEQ ID NO：19的nt 3448-3834、SEQID NO：20的nt 2803-3189、SEQ ID NO：21的nt 916-1302和SEQ ID NO：32的nt 871-1257中，提供了具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的免疫球蛋白区域的合适编码序列的实例。
例如，在SEQ ID NO：5的nt 3270-3617、SEQ ID NO：13的nt 3058-3405、SEQ IDNO：14的nt 3270-3617、SEQ ID NO：15的nt 3270-3617、SEQ ID NO：19的nt 3865-4212、SEQID NO：20的nt 3220-3567、SEQ ID NO：21的nt 1333-1680和SEQ ID NO：32的nt 1288-1635中，提供了具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的免疫球蛋白区域的合适编码序列的实例。
核酸是指核苷酸的聚合物形式，并且包括RNA、mRNA、cDNA、基因组DNA，以及上述的合成形式和混合聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的经修饰形式。该术语还包括DNA的单链和双链形式。技术人员将理解，这些核酸分子的功能变体也旨在成为本发明的一部分。功能变体是可以使用标准遗传密码直接翻译以提供与从亲本核酸分子翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。在优选的实施方案中，编码免疫球蛋白结构域、融合蛋白和其他构建体的核酸分子被本发明涵盖，并且可用于产生表达盒和载体基因组。可以对这些序列进行密码子优化以在酵母细胞或哺乳动物细胞(例如人细胞)中表达。密码子优化的方法是已知的，并且先前已经描述(例如，WO 96/09378)。如果与野生型序列相比至少一个非优选的密码子被更优选的密码子代替，则认为该序列是密码子优化的。在本文中，非优选密码子是与编码相同氨基酸的另一密码子相比在生物体中较不频繁使用的密码子，并且更优选的密码子是与非优选密码子相比在生物体总更频繁使用的密码子。特定生物的密码子使用频率可在密码子频率表中找到，例如www.kazusa.jp/codon。优选地，将多于一个非优选密码子，优选地将大部分或全部非优选密码子用更优选的密码子替换。优选地，在密码子优化序列中使用生物中最常用的密码子。用优选的密码子替换通常导致更高的表达。技术人员还将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子可以编码相同的多肽。还应理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响由核酸分子编码的氨基酸序列的核苷酸替换，以反映要在其中表达多肽的任何特定宿主生物的密码子使用。因此，除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核酸序列可以使用常规分子生物学技术克隆，或通过DNA合成从头产生，其可以由在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如GeneArt、GenScript、Life Technologies、Eurofins)使用常规程序执行。
在一个实施方案中，rAAV载体原种包含其中一个、两个、三个或四个免疫球蛋白结构域被表达为融合蛋白的载体基因组。
在某些实施方案中，免疫球蛋白结构域可以通过化学键连接，或者可以直接连接或通过短多肽接头连接在一起。这样的接头序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。接头序列优选地为所得抗体构建体提供足够的柔韧性，并且同时对蛋白水解降解具有抗性。
任选地，为了产生同二聚体和异二聚体，将免疫球蛋白编码序列克隆到一起，或者可以直接合成(Genscript)全长基因并连接到表达载体中。在二聚体构建体中，第一免疫球蛋白区域的C末端可以连接至第二免疫球蛋白区域的末端。不同长度(10、15、35和57个氨基酸)的接头序列由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成。连接序列可以紧邻第一结构域(区域)的C-末端和第二结构域(区域)的N-末端，用于分离两个、三个或四个结构域或区域。可以选择长度为约1至60个氨基酸的任何合适的序列，但是优选地长度为3至35个氨基酸，或长度为约5至约15个氨基酸。多个连接序列可以存在于单个编码的蛋白质序列中，并且这些可以独立地选择。
合适的接头的实例包括：
SEQ ID NO：7：GGGGS GGGGS：
SEQ ID NO：23：GGGGS GGGGS GGGGS；
SEQ ID NO：24：GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS
SEQ ID NO：25：GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGSGGGGS GGGGS。
例如，在SEQ ID NO：13的nt 2212-2241、nt 2611-nt 2640、nt 3028-3057、nt3406-3435；SEQ ID NO：19的nt 2212-2241、nt 2611-2640、nt 3835-3864、and nt 4213-4242；SEQ ID NO：20的nt 1582-1611、nt 3190-3219；SEQ ID NO：21的nt 487-516、nt 886-915、nt 1303-1332；以及SEQ ID NO：32的nt 442-471、nt 841-870、nt 1258-1287中提供了合适的接头编码序列的实例。
在某些实施方案中，蛋白质还包含Fc尾。因此，在某些实施方案中，如上所述的免疫球蛋白结合结构域连接至抗体、优选人抗体的Fc片段，例如人IgG抗体如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4的Fc片段。可以直接或使用接头将结构域与Fc片段遗传融合。在某些实施方案中，通过包含1至100个氨基酸，优选1至60个氨基酸或10至60个氨基酸的连接序列将结合分子与Fc片段连接。接头的实例包括但不限于上面列出的连接序列。在某些实施方案中，免疫球蛋白结构域与Fc片段的C末端遗传融合。在另一些实施方案中，免疫球蛋白结构域或融合蛋白与Fc片段的N末端和C末端两者融合。参见例如WO 2016/124768，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，Fc片段具有在SEQ ID NO：30的aa 551至aa 772中再现的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码Fc片段的核酸序列是SEQ ID NO：10。
在某些实施方案中，载体基因组编码具有SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列的抗流感融合构建体。提供了这种构建体的一个实例是SEQ ID NO：12。在另一个实例中是SEQID NO：27。在这两个实例中，一个前导序列都被工程化改造到载体基因组中紧邻5′免疫球蛋白编码区上游的位置。然而，在某些实施方案中，载体基因组可以包含多于一个的前导序列，每个前导序列位于免疫球蛋白编码区的上游。在某些实施方案中，这些融合蛋白还包含至少一个免疫球蛋白铰链区和Fc区[例如，SEQ ID NO：12]。此外，这些融合蛋白中的每一个都包含多个接头序列。在另一些实施方案中，Fc区可包括在融合蛋白中而没有铰链区。在一个实施方案中，载体基因组是SEQ ID NO：31。
在某些实施方案中，本文提供具有抗甲型流感和乙型流感活性的单一抗体样蛋白(称为多结构域抗体或mdAb或MDAb)，其中该蛋白质是包含一个或多个免疫球蛋白结构域和一个或多个如本文所述的接头的融合蛋白。在某些实施方案中，本文提供了用于表达本文所述的MDAb的组合物。
当提及核酸或其片段时，术语“基本同源(substantial homology)”或“基本相似(substantial similarity)”表示当利用适当的核苷酸***或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳对齐时，对齐的序列中存在至少约95％至99％的核苷酸序列同一性。优选地，同源是在全长序列、或其开放阅读框、或长度为至少15个核苷酸的另一合适片段上。本文描述了合适片段的实例。
在核酸序列的情况下，术语“序列同一性”、“百分比序列同一性”或“百分比同一性”是指在用于最大对应对齐时两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是基因组的全长、基因编码序列的全长或至少约500至5000个核苷酸的片段是期望的。然而，可能期望较小片段之间的同一性，例如至少约9个核苷酸、通常至少约20至24个核苷酸、至少约28至32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。类似地，对于氨基酸序列，可以在蛋白质的全长或其片段上容易地确定“序列同一性百分比”。合适地，片段长度为至少约8个氨基酸，并且可以多至约700个氨基酸。本文描述了合适片段的实例。
当提及氨基酸或其片段时，术语“基本同源”或“基本相似”表示当利用适当的氨基酸***或缺失与另一氨基酸(或其互补链)最佳对齐时，对齐的序列中存在至少约95％至99％的氨基酸系列同一性。优选地，同源是在全长序列、或其蛋白质，例如免疫球蛋白区或结构域、AAV cap蛋白或至少8个氨基酸或更理想地至少15个氨基酸的其片段。本文描述了合适片段的实例。
术语“高度保守的”是指至少80％的同一性，优选至少90％的同一性，更优选大于97％的同一性。通过本领域技术人员已知的算法和计算机程序，本领域技术人员可以容易地确定同一性。
通常，当提及两个不同腺相关病毒的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，参照“比对”序列来确定“同一性”、“同源性”或“相似性”。“比对”序列或“比对物”是指多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列，与参考序列相比，其通常含有对缺失或额外碱基或氨基酸的校正。使用多种公开的或市售多序列比对程序中的任何一种进行比对。这些程序的实例包括“Clustal Omega”、“Clustal W”、“CAP Sequence Assembly”、“MAP”、“MEME”，其可通过因特网上的Web服务器访问。这些程序的其他来源是本领域技术人员已知的。或者，也使用Vector NTI实用程序。本领域已知的许多算法可用于测量核苷酸序列同一性，包括上述程序中包含的那些。作为另一个实例，可以使用FastaTM(GCG版本6.1中的程序)比较多核苷酸序列。FastaTM提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。例如，可以使用GCG版本6.1中提供的FastaTM以其默认参数(单词大小为6和评分矩阵的NOPAM因子)来确定核酸序列之间的序列同一性百分比，其通过引用并入本文。多序列比对程序也可用于氨基酸序列，例如“Clustal Omega”、“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”、和“Match-Box”程序。通常，这些程序中的任何程序都在默认设置下使用，但是本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。或者，本领域技术人员可以利用其他种算法或计算机程序，该算法或计算机程序至少提供由参考算法和程序提供的同一性水平或比对物。参见，例如，J.D.Thomson等人，Nucl.Acids.Res.，“A comprehensive comparison ofmultiple sequence alignments”，27(13)：2682-2690(1999)。
如本文所述，可以将核酸序列工程化到任何合适的载体中。术语“载体”是指可以在其中***第二核酸分子以引入到宿主细胞中的核酸分子，其在该宿主细胞中复制，并且在某些情况下表达。换句话说，载体能够运输与其连接的核酸分子。如本文所用，术语“载体”涵盖克隆载体以及表达载体。某些载体能够在引入它们的宿主中自主复制(例如，具有细菌复制起点的载体可以在细菌中复制)。另一些载体在导入宿主细胞后可以整合到宿主的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。根据本发明的载体可以通过本领域技术人员众所周知的方法容易地制备。
II.进化枝F AAVhu68
如本文所用，与AAV组相关的术语“进化枝(clade)”是指在***发生上彼此相关的一组AAV，如使用Neighbor-Joining算法通过至少75％的解靴带值(bootstrap value)(至少1000个重复)和基于AAV vp1氨基酸序列比对的泊松校正距离(Poisson correctiondistance)测量不大于0.05所确定的。Neighbor-Joining算法已在文献中描述。参见，例如，M.Nei和S.Kumar，Molecular Evolution and Phylogenetics(Oxford University Press，New York(2000)。可用于实施该算法的计算机程序是可获得的。例如，MEGA v2.1程序执行改进的Nei-Gojobori方法。使用这些技术和计算机程序以及AAV vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选择的AAV是否包含在本文鉴定的一个进化枝中，在另一个进化枝中，或者在这些进化枝之外。参见，例如，G Gao，等人，J Virol，2004年6月；78(12)：6381-6388，其鉴定了进化枝A、B、C、D、E和F，并且提供了GenBank登录号AY530553至AY530629的新AAV的核酸序列。还参见WO 2005/033321。
如本文所用，“AAV9衣壳”是由多个AAV9 vp蛋白构成的自组装AAV衣壳。AAV9 vp蛋白通常表达为由SEQ ID NO：36的核酸序列或与其至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的序列编码的可选剪接变体，其编码SEQ IDNO：17的vp1氨基酸序列(GenBank登录号：AAS99264)。这些剪接变体导致SEQ ID NO：17的不同长度的蛋白质。在某些实施方案中，“AAV9衣壳”包括具有与AAS99264具有99％同一性或与SEQ ID NO：17具有99％同一性的氨基酸序列的AAV。还参见US7906111和WO 2005/033321。如本文所用，“AAV9变体”包括例如WO2016/049230、US 8,927,514、US 2015/0344911和US 8,734,809中描述的那些。
rAAVhu68由AAVhu68衣壳和载体基因组构成。AAVhu68衣壳是vp1异质群、vp2异质群体和vp3蛋白异质群的组装体。如本文所用，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质”或其任何语法变体是指由不相同的元件组成的群体，例如具有具不同的修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。SEQ ID NO：16提供了AAVhu68 vp1蛋白的编码的氨基酸序列。还参见美国临时专利申请号62/614,002、62/591,002和62/464,748，其中每一个的标题为“Novel Adeno-Associated Virus (AAV) Clade F Vector and Uses Therefor”，并且其通过引用整体并入本文。
AAVhu68衣壳包含vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群，其具有相对于SEQID NO：16中预测氨基酸残基的修饰。这些亚群至少包含某些脱酰胺的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，某些亚群包含SEQ ID NO：16中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)位置，并且任选地还包含其他脱酰胺的氨基酸，其中脱酰胺导致氨基酸变化和其他任选修饰。SEQ ID NO：39提供了修饰的AAVhu68衣壳的氨基酸序列，举例说明了可以脱酰胺或以其他方式修饰的残基位置。
如本文所用，除非另有说明，否则vp蛋白的“亚群”是指vp蛋白的组，其具有至少一个确定的共同特征，并且由参考组的至少一个组成员至少于全部成员组成。例如，除非另有说明，否则vp1蛋白的“亚群”是组装的AAV衣壳中的至少一(1)个vp1蛋白并且少于全部vp1蛋白。除非另有说明，否则vp3蛋白的“亚群”可以是组装的AAV衣壳中的一(1)个vp3蛋白至少于全部vp3蛋白。例如，vp1蛋白可以是vp蛋白的亚群；vp2蛋白可以是vp蛋白的单独亚群，并且vp3是组装的AAV衣壳中vp蛋白的另一亚群。在另一个实例中，vp1、vp2和vp3蛋白可包含具有不同修饰的亚群，例如至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺的天冬酰胺，例如在天冬酰胺-甘氨酸对处。
除非另有说明，否则高度脱酰胺是指与参考氨基酸位置的预测氨基酸序列相比，在参考氨基酸位置处至少45％脱酰胺、至少50％脱酰胺、至少60％脱酰胺、至少65％脱酰胺、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、97％、99％、至多约100％脱酰胺(例如基于全部vp1蛋白，SEQ ID NO：16的氨基酸57处的至少80％的天冬酰胺可以被脱酰胺，或者基于全部vp1、vp2和vp3蛋白，SEQ ID NO：16的氨基酸409处的天冬酰胺中10％可以被脱酰胺)。可以使用2D-凝胶、质谱技术或其他合适的技术来确定这样的百分比。
不希望受理论束缚，AAVhu68衣壳中的vp蛋白中至少高度脱酰胺残基的脱酰胺被认为在性质上主要是非酶促的，由衣壳蛋白中使选择的天冬酰胺和较小程度上谷氨酰胺残基脱酰胺的基团引起。大多数脱酰胺vp1蛋白的有效衣壳组装表明这些事件发生在衣壳组装之后，或者单个单体(vp1、vp2或vp3)中的脱酰胺在结构上是良好耐受的并且在很大程度上不影响组装动力学。VP1-独特(VP1-u)区域(～aa 1-137)中的广泛脱酰胺通常被认为在细胞进入之前位于内部，表明VP脱酰胺可能发生在衣壳组装之前。
不希望受理论束缚，可以通过其C-末端残基的主链氮原子对Asn的侧链酰胺基团碳原子进行亲核攻击来发生N的脱酰胺。认为形成了中间体闭环琥珀酰亚胺残基。然后琥珀酰亚胺残基进行快速水解，得到最终产物天冬氨酸(Asp)或异天冬氨酸(IsoAsp)。因此，在某些实施方案中，天冬酰胺(N或Asn)的脱酰胺产生Asp或IsoAsp，其可以通过的琥珀酰亚胺中间体相互转化，例如如下所示。
如本文所提及，SEQ ID NO：16的每个脱酰胺N可独立地为天冬氨酸(Asp)、异天冬氨酸(isoAsp)、天冬氨酸盐(aspartate)和/或Asp和isoAsp的互变混合物、或其组合。可以存在任何合适比率的α-和异天冬氨酸。例如，在某些实施方案中，该比率可以为10∶1至1∶10的天冬氨酸比异天冬氨酸，约50：50的天冬氨酸：异天冬氨酸，或约1∶3的天冬氨酸：异天冬氨酸，或其他选择的比率。
在某些实施方案中，SEQ ID NO：16中的一个或多个谷氨酰胺(Q)脱酰胺成谷氨酸(Glu)，即α-谷氨酸、γ-谷氨酸(Glu)、或α-和γ-谷氨酸的混合物，其可以通过共同的戊二酰亚胺(glutarinimide)中间体进行相互转化。可以存在任何合适比率的α-和γ-谷氨酸。例如，在某些实施方案中，该比率可以为10∶1至1∶10的α比γ，约50∶50的α∶γ，或约1∶3的α∶γ，或其他选择的比率。
因此，rAAVhu68在rAAVhu68衣壳内包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的具有脱酰胺氨基酸的亚群，其至少包含含有至少一个高度脱酰胺天冬酰胺的至少一个亚群。此外，其他修饰可包括异构化，特别是在所选的天冬氨酸(D或Asp)残基位置。在另一些实施方案中，修饰可包括Asp位置的酰胺化。
在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含与SEQ ID NO：16的编码氨基酸序列相比具有至少4个至至少约25个脱酰胺氨基酸残基位置的vp1、vp2和vp3亚群，其中至少1％至10％被脱酰胺。这些中的大多数可以是N残基。然而，Q残基也可以被脱酰胺。
在某些实施方案中，AAV68衣壳的特征还在于以下一种或多种。AAV hu68衣壳蛋白包含：由编码SEQ ID NO：16的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68vp1蛋白，由SEQ ID NO：18产生的vp1蛋白，或者由与编码SEQ ID NO：16的1至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO：18具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白；由编码SEQ IDNO：16的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp2蛋白，由包含SEQ ID NO：18的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或者由与编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO：18的至少核苷酸412至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白；和/或由编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：18的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或者由与编码SEQ IDNO：16的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO：18的至少核苷酸607至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白。
另外或可替代地，提供了一种AAV衣壳，基于SEQ ID NO：16的vp1衣壳的编号，其包含：vp1蛋白的异质群、vp2蛋白的异质群(任选地包含位置157处的缬氨酸)和vp3蛋白的异质群，其中至少vp1和vp2亚群包含位置157处的缬氨酸，并且任选地还包含位置57处的谷氨酰胺。另外或可替代地，提供了一种AAVhu68衣壳，其包含：为编码SEQ ID NO：16氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群，为编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群，以及为编码SEQ ID NO：16的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群，其中：vp1、vp2和vp3蛋白包含具有氨基酸修饰的亚群。
AAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白通常表达为由编码SEQ ID NO：16的全长vp1氨基酸序列(氨基酸1至736)的相同核酸序列编码的可选剪接变体。任选地，vp1编码序列单独用于表达vp1、vp2和vp3蛋白。或者，该序列可以与以下一种或多种共表达：编码不具有vp1独特区域(约aa 1至约aa 137)和/或vp2独特区域(约aa 1至约aa 202)的SEQ ID NO：16的AAVhu68vp3氨基酸序列(约aa 203至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(或SEQ ID NO：18的约nt607至约nt 2211)，或者与编码SEQ ID NO：16的aa 203至736的SEQ ID NO：18具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。另外或可替选地，vp1编码序列和/或vp2编码序列可以与以下共表达：编码不具有vp1独特区域(约aa 1至约137)的SEQ ID NO：16的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(SEQ ID NO：18的nt 412至2211)，或与编码SEQ ID NO：16的约aa 138至736的SEQ ID NO：18具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。
如本文所述，rAAVhu68具有在生产***中从编码SEQ ID NO：16的vp1氨基酸序列的AAVhu68核酸和任选的例如编码不含vp1和/或vp2独特区域的vp3蛋白的另外的核酸序列产生的rAAVhu68衣壳。使用单个核酸序列vp1产生的rAAVhu68产生了vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白的异质群。更具体地，AAVhu68衣壳包含vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内相对于SEQ ID NO：16中的预测氨基酸残基具有修饰的亚群。这些亚群至少包含脱酰胺天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，天冬酰胺-甘氨酸对中的天冬酰胺是高度脱酰胺的。
在一个实施方案中，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO：18的序列，或其互补链，例如相应的mRNA或tRNA。在某些实施方案中，vp2和/或vp3蛋白可以另外地或替代地从vp1以外的不同核酸序列表达，例如以改变所选表达***中vp蛋白的比率。在某些实施方案中，还提供了编码不具有vpl独特区域(约aa 1至约aa 137)和/或vp2独特区域(约aa 1至约aa 202)的SEQ ID NO：16的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa203至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(或SEQ ID NO：18的约nt 607至约nt 2211)。在某些实施方案中，还提供了编码不具有vp1独特区域(约aa 1至约137)的SEQ ID NO：16的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(或SEQ ID NO：18的约nt 412至2211)。
然而，可以选择编码SEQ ID NO：16氨基酸序列的其他核酸序列用于产生rAAVhu68衣壳。在某些实施方案中，核酸序列具有SEQ ID NO：18的核酸序列，或者与编码SEQ ID NO：16的SEQ ID NO：18具有至少70％至99.％同一性、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，核酸序列具有SEQID NO：18的核酸序列，或者与编码SEQ ID NO：16的vp2衣壳蛋白(约aa 138至736)的SEQ IDNO：18的约nt 412至约nt 2211具有至少70％至99.％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，核酸序列具有SEQID NO：18的约nt 607至约nt 2211的核酸序列，或者与编码SEQ ID NO：16的vp3衣壳蛋白(约aa 203至736)的SEQ ID NO：18具有至少70％至99.％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列。
设计编码该AAVhu68衣壳的核酸序列(包括DNA(基因组或cDNA)或RNA(例如mRNA))在本领域技术范围内。在某些实施方案中，编码AAVhu68 vp1衣壳蛋白的核酸序列提供在SEQ ID NO：18中。还参见图1B-1D。在另一些实施方案中，可以选择与SEQ ID NO：18具有70％至99.9％同一性的核酸序列以表达AAVhu68衣壳蛋白。在某些另外的实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：18具有至少约75％同一性、至少80％同一性、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％同一性、或至少99％至99.9％同一性。这样的核酸序列可以密码子优化以在选择的***(即，细胞类型)中表达，这可以通过各种方法设计。可以使用可在线获得的方法(例如，GeneArt)、公开的方法或提供密码子优化服务的公司例如DNA2.0(Menlo Park，CA)来进行该优化。一种密码子优化方法描述于例如美国国际专利公开号WO 2015/012924中，其通过引用整体并入本文。还参见例如美国专利公开号2014/0032186和美国专利公开号2006/0136184。适当地，对产物的开放阅读框(ORF)的整个长度进行修饰。然而，在一些实施方案中，可以仅改变ORF的片段。通过使用这些方法之一，可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并产生编码多肽的密码子优化编码区的核酸片段。许多选择可用于进行密码子的实际改变或用于合成如本文所述设计的密码子优化的编码区。这样的修饰和合成可以使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规分子生物学操作进行。在一种方法中，通过标准方法合成一系列各自长度为80-90个核苷酸且跨越期望序列的长度的互补寡核苷酸对。合成这些寡核苷酸对，使得它们在退火时形成包含粘性末端的80-90个碱基对的双链片段，例如，合成对中的每个寡核苷酸以延伸超过与对中的另一寡核苷酸互补的区域3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。每个寡核苷酸对的单链末端设计为与另一个寡核苷酸对的单链末端退火。使寡核苷酸对退火，然后使约5至6个这些双链片段通过粘性单链末端一起退火，然后将它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可从Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif获得的载体。然后通过标准方法对构建体进行测序。制备由连接在一起的80至90个碱基对片段的5至6个片段构成的多个这些构建体(即约500个碱基对的片段)，使得整个期望序列在一系列质粒构建体中表示。然后用合适的限制酶切割这些质粒的***物并连接在一起形成最终的构建体。然后将最终构建体克隆到标准细菌克隆载体中，并测序。其他方法对于技术人员来说是显而易见的。此外，基因合成在商业上很容易获得。
在某些实施方案中，AAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白中的N-G对中的天冬酰胺(N)是高度脱酰胺的。在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含AAV vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白的亚群，该亚群在AAVhu68衣壳蛋白中具有至少四个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)位置。在某些实施方案中，约20％至50％的N-N对(不包括N-N-N三联体)表现为脱酰胺。在某些实施方案中，第一个N被脱酰胺。在某些实施方案中，第二N被脱酰胺。在某些实施方案中，脱酰胺为约15％至约25％脱酰胺。对于AAVhu68蛋白的AAVhu68 vp1、vp2和vp3衣壳蛋白，SEQ ID NO：16的位置259处的Q处的脱酰胺为约8％至约42％。
在某些实施方案中，rAAVhu68衣壳的特征还在于vp1、vp2和vp3蛋白的D297处的酰胺化。在某些实施方案中，基于SEQ ID NO：16的编号，AAVhu68衣壳中vp1、vp2和/或vp3蛋白的位置297处的D中约70％至约75％酰胺化。
在某些实施方案中，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个Asp异构化为D-Asp。基于SEQ ID NO：16的编号，这些异构体通常以少于残基位置97、107、384中的一个或多个处的Asp的约1％的量存在。
在某些实施方案中，rAAVhu68具有具vp1、vp2和vp3蛋白的AAVhu68衣壳，所述蛋白具有包含在下表中列出的位置处的两个、三个、四个或更多个脱酰胺残基的组合的亚群。可以使用2D凝胶电泳和/或质谱法和/或蛋白质建模技术来确定rAAV中的脱酰胺。可以用Acclaim PepMap柱和与具有NanoFlex源的Q Exactive HF(Thermo Fisher Scientific)偶联的Thermo UltiMate 3000 RSLC***(Thermo Fisher Scientific)进行在线色谱法。使用Q Exactive HF的数据依赖性top-20方法获取MS数据，从调查扫描(200-2000m/z)动态选择最丰富的尚未测序的前体离子。通过更高能量的碰撞解离片段化(collisionaldissociation fragmentation)进行测序，其中通过预测性自动增益对照(predictiveautomatic gain control)确定1e5离子的目标值，并且使用4m/z的窗口进行前体的分离。以m/z 200下120,000的分辨率获得调查扫描。HCD光谱的分辨率可设置为m/z200下30,000，最大离子注入时间为50ms，标准碰撞能量为30。S-lens RF水平可以设定为50，以给出由来自消化物的肽占据的m/z区域的最佳传递。前体离子可以从片段化选择中以单个、未指定的、或六个和更高的电荷状态排除。可以使用BioPharma Finder 1.0软件(Thermo FischerScientific)分析所获得的数据。对于肽作图，使用单入口蛋白质FASTA数据库进行搜索，其中氨甲酰甲基化设定为固定修饰；氧化、脱酰胺和磷酸化设定为可变修饰，10ppm质量准确度，高蛋白酶特异性和MS/MS谱的置信水平为0.8。合适的蛋白酶的实例可包括例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。脱酰胺肽的质谱鉴定相对简单，因为脱酰胺使完整分子的质量增加了+0.984Da(-OH和-NH2基团之间的质量差异)。特定肽的脱酰胺百分比是确定的脱酰胺肽的质量面积除以脱酰胺和天然肽的面积之和。考虑到可能的脱酰胺位点的数量，在不同位点脱酰胺的同量异位(isobaric)物质可能在单个峰中共迁移。因此，源自具有多个潜在脱酰胺位点的肽的片段离子可用于定位或区分多个脱酰胺位点。在这些情况下，观察到的同位素模式中的相对强度可用于特异性地确定不同脱酰胺肽异构体的相对丰度。该方法假定所有同量异位物质的片段化效率是相同的并且独立于脱酰胺的位点。本领域技术人员将理解，可以使用这些说明性方法的许多变型。例如，合适的质谱仪可包括例如四极飞行时间质谱仪(quadrupole time of flight mass spectrometer，QTOF)，例如Waters Xevo或Agilent6530或轨道阱(orbitrap)仪器，例如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(ThermoFisher)。合适的液相色谱***包括例如来自Waters或Agilent***的Acquity UPLC***(1100或1200系列)。合适的数据分析软件可包括例如MassLynx(Waters)、Pinpoint和Pepfinder(Thermo Fischer Scientific)、Mascot(Matrix Science)、Peaks DB(Bioinformatics Solutions)。还可以描述其他技术，例如X.Jin等人，Hu Gene TherapyMethods，第28卷，编号5，第255-267页，2017年6月16日在线发表。
在某些实施方案中，AAVhu68衣壳的特征在于，其衣壳蛋白中在基于SEQ ID NO：16的氨基酸序列编号的位置N57、N329、N452和/或N512中的至少一处的至少45％的N残基被脱酰胺。在某些实施方案中，在这些N-G位置(即基于SEQ ID NO：16的氨基酸序列的编号，N57、N329、N452和/或N512)的一处或更多处的至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少90％的N残基被脱酰胺。在这些和另一些实施方案中，AAVhu68衣壳的特征还在于具有其中在以下一个或多个位置处的N残基中约1％至约20％具有脱酰胺的蛋白质群：基于SEQ IDNO：16的氨基酸序列编号，N94、N253、N270、N304、N409、N477和/或Q599。在某些实施方案中，AAVhu68至少包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群在以下的一个或多个位置处脱酰胺：基于SEQ ID NO：16的氨基酸序列编号，N35、N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709、N735或其组合。在某些实施方案中，衣壳蛋白可具有一个或多个酰胺化氨基酸。
还观察到其他修饰，其中大多数不导致一个氨基酸转化为不同的氨基酸残基。任选地，衣壳的vp1、vp2和vp3中的至少一个Lys被乙酰化。任选地，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个Asp异构化为D-Asp。任选地，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个S(Ser，丝氨酸)被磷酸化。任选地，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个T(Thr，苏氨酸)被磷酸化。任选地，衣壳的vp1、vp2和/或vp3中的至少一个W(trp，色氨酸)被氧化。任选地，衣壳的vpl、vp2和/或vp3中的至少一个M(Met，甲硫氨酸)被氧化。在某些实施方案中，衣壳蛋白具有一个或多个磷酸化。例如，某些vp1衣壳蛋白可在位置149处磷酸化。
在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含：vp1蛋白的异质群，其是编码SEQ ID NO：16氨基酸序列的核酸序列的产物，其中vp1蛋白包含位置67处的谷氨酸(Glu)和/或位置157处的缬氨酸(Val)；vp2蛋白的异质群，其任选地包含位置157处的缬氨酸(Val)；和vp3蛋白的异质群。AAVhu68衣壳包含至少一个亚群，其中基于SEQ ID NO：16氨基酸序列的残基编号，位于vp1蛋白的位置57处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少65％的天冬酰胺(N)以及vp1、v2和vp3蛋白的位置329、452和/或512处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少70％的天冬酰胺(N)被脱酰胺，其中脱酰胺导致氨基酸改变。如本文更详细讨论的，脱酰胺的天冬酰胺可以脱酰胺为天冬氨酸、异天冬氨酸、互变天冬氨酸/异天冬氨酸对或其组合。在某些实施方案中，rAAVhu68的特征还在于以下一种或多种：(a)每个vp2蛋白独立地是编码SEQ ID NO：16的至少vp2蛋白的核酸序列的产物；(b)每个vp3蛋白独立地是编码SEQ ID NO：16的至少vp3蛋白的核酸序列的产物；(c)编码vp1蛋白的核酸序列是SEQ ID NO：18，或与编码SEQ ID NO：16氨基酸序列的SEQ ID NO：18具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。任选地，该序列单独用于表达vp1、vp2和vp3蛋白。或者，该序列可以与以下一种或多种共表达：编码不具有vp1独特区域(约aa1至约aa 137)和/或vp2独特区域(约aa 1至约aa 202)的SEQ ID NO：16的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa203至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(SEQ ID NO：18的约nt607至约nt 2211)，或者与编码SEQ ID NO：16的aa 203至736的SEQ ID NO：18具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。另外或可替选地，vp1编码序列和/或vp2编码序列可以与以下共表达：编码不具有vp1独特区域(约aa 1至约137)的SEQ ID NO：16的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138至736)的核酸序列，或其互补链相应mRNA或tRNA(SEQ ID NO：18的nt412至2211)，或与编码SEQ ID NO：16的约aa 138至736的SEQ ID NO：18具有至少70％至至少99％(例如至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。
另外或可替代地，rAAVhu68衣壳至少包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群在以下一个或多个位置处被脱酰胺：基于SEQ ID NO：16的编号，N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N512、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或其组合；(e)rAAVhu68衣壳包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群在以下一个或多个位置处包含1％至20％的脱酰胺：基于SEQ IDNO：16的编号，N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N336、N409、N410、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或其组合；(f)rAAVhu68衣壳包含vp1的亚群，其中基于SEQ ID NO：16的编号，vp1蛋白位置57处的65％至100％的N被脱酰胺；(g)rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白的亚群，其中vp1蛋白位置57处的75％至100％的N被脱酰胺；(h)rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于SEQ ID NO：16的编号，位置329处的80％至100％的N被脱酰胺；(i)rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于SEQ ID NO：16的编号，位置452处的80％至100％的N被脱酰胺；(j)rAAVhu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于SEQ ID NO：16的编号，位置512处的80％至100％的N被脱酰胺；(k)rAAV包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1至1.5个vp2比3至10个vp3蛋白质；(1)rAAV包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1个vp2比3至9个vp3蛋白。
在某些实施方案中，对AAVhu68进行修饰以改变天冬酰胺-甘氨酸对中的甘氨酸，以降低脱酰胺。在另一些实施方案中，将天冬酰胺改变为不同的氨基酸，例如以较慢的速率脱酰胺的谷氨酰胺；或改变成缺少酰胺基团(amide group)的氨基酸(例如，谷氨酰胺和天冬酰胺包含酰胺基团)；和/或缺少胺基(amine group)的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸包含酰胺基团)。如本文所用，缺少酰胺或胺侧基的氨基酸是指例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸、和/或脯氨酸。如所述的修饰可以在编码的AAVhu68氨基酸序列中发现的一个、两个或三个天冬酰胺-甘氨酸对中。在某些实施方案中，这样的修饰不是在所有四个天冬酰胺-甘氨酸对中进行的。因此，一种用于降低AAVhu68和/或工程化AAVhu68变体的脱酰胺的方法具有较低脱酰胺速率。另外或可替代的，一个或多个其他酰胺氨基酸可以改变为非酰胺氨基酸以降低AAVhu68的脱酰胺。
这些氨基酸修饰可以通过常规遗传工程技术进行。例如，可以产生含有修饰的AAVhu68 vp密码子的核酸序列，其中编码SEQ ID NO：16(精氨酸-甘氨酸对)中位置58、330、453和/或513处的甘氨酸的一至三个密码子被修饰成编码甘氨酸以外的氨基酸。在某些实施方案中，可以在位于SEQ ID NO：16中位置57、329、452和/或512处的一至三个精氨酸-甘氨酸对处对包含修饰的精氨酸密码子的核酸序列进行工程化，使得修饰的密码子编码精氨酸以外的氨基酸。每个修饰的密码子可以编码不同的氨基酸。或者，一个或多个改变的密码子可以编码相同的氨基酸。在某些实施方案中，这些修饰的AAVhu68核酸序列可用于产生突变体rAAVhu68，其具有比天然hu68衣壳具有更低脱酰胺的衣壳。这样的突变体rAAVhu68可具有降低的免疫原性和/或提高储存稳定性，特别是以悬浮形式储存。
在一个实施方案中，提供了重组腺相关病毒(rAAV)，所述重组腺相关病毒包含：(A)AAV68衣壳，其包含以下一种或多种：(1)AAV hu68衣壳蛋白，其包含：由编码SEQ ID NO：16的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp1蛋白，由SEQ ID NO：18产生的vp1蛋白，或者由与编码SEQ ID NO：16的1至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO：18具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白，由编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp2蛋白，由包含SEQ IDNO：18的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或者由与编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO：18的至少核苷酸412至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白，由编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的AAVhu68 vp3蛋白，由包含SEQ ID NO：18的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或者由与编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO：18的至少核苷酸607至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白；和/或(2)AAV衣壳蛋白，其包含：vp1蛋白的异质群，任选地包含位置157处的缬氨酸的vp2蛋白的异质群，和vp3蛋白的异质群，其中至少vp1和vp2蛋白的亚群包含位置157处的缬氨酸，并且任选地还包含位置57处的谷氨酰胺，基于SEQ ID NO：16的vp1衣壳的编号；和/或(3)为编码SEQ ID NO：16氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群，为编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群，和为编码SEQ ID NO：16的至少氨基酸203至736的核酸序列的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群，其中：vp1、vp2和vp3蛋白包含具有氨基酸修饰的亚群，该亚群包含SEQ ID NO：16中天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺的天冬酰胺(N)，并且任选地还包含含有其他脱酰胺氨基酸的亚群，其中所述脱酰胺导致氨基酸改变；(B)AAVhu68衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包含核酸分子，所述核酸分子包含AAV反向末端重复序列和编码产物的非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列与指导产物在宿主细胞中表达的序列可操作地连接。例如，四个残基(N57、N329、N452、N512)通常显示高脱酰胺水平。其他残基(N94、N253、N270、N304、N409、N477和Q599)在不同批次之间也显示多至～20％的脱酰胺水平。
在某些实施方案中，脱酰胺的天冬酰胺被脱酰胺为天冬氨酸、异天冬氨酸、互变天冬氨酸/异天冬氨酸对或其组合。在某些实施方案中，脱酰胺的谷氨酰胺被脱酰胺为(α)-谷氨酸、γ-谷氨酸、互变(α)-谷氨酸/γ-谷氨酸对或其组合。
在某些实施方案中，AAVhu68衣壳包含具有以下一种或多种的亚群：(a)基于SEQID NO：16的编号，位于vp1蛋白位置57处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少65％的天冬酰胺(N)被脱酰胺；(b)基于SEQ ID NO：16氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白位置329处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少75％的N被脱酰胺；(c)基于SEQ ID NO：16氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白位置452处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少50％的N被脱酰胺；和/或(d)基于SEQ ID NO：16氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白位置512处的天冬酰胺-甘氨酸对中至少75％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1亚群，其中如使用质谱法所测定，vp1蛋白的位置57处的75％至100％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中如使用质谱法所测定，基于SEQ IDNO：16的编号，位置329处的75％至100％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中如使用质谱法所测定，基于SEQ ID NO：16的编号，位置452处的75％至100％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于SEQ ID NO：16的编号，位置512处的75％至100％的N被脱酰胺。在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列是SEQ ID NO：18，或与编码SEQ ID NO：16氨基酸序列的SEQ ID NO：18具有至少80％至至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，该序列与SEQ ID NO：18具有至少80％至97％的同一性。在某些实施方案中，rAAVhu68衣壳还至少包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群具有从SEQ ID NO：16的氨基酸的修饰，其在选自以下的至少四个位置处包含至少约50％至100％的脱酰胺：N57、329、452、512的一个或多个，或其组合。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1、vp2和/或vp3蛋白亚群，该亚群还在以下的至少一个或多个位置处包含1％至约40％的脱酰胺：N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N336、N409、N410、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或其组合。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1、vp2和/或vp3蛋白亚群，该亚群还包含一个或多个修饰，该修饰选自以下一种或多种的一个或多个修饰：乙酰化赖氨酸、磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸、异构化天冬氨酸、氧化色氨酸和/或甲硫氨酸、或酰胺化氨基酸。在某些实施方案中，rAAVhu68包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1至1.5个vp2比3至10个vp3蛋白。在某些实施方案中，AAVhu68包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1个vp2比3至9个vp3蛋白。在某些实施方案中，载体基因组包含来自AAVhu68以外的AAV来源的AAV ITR序列。
在某些实施方案中，提供了一种组合物，其包含重组腺相关病毒hu68(rAAVhu68)的混合群，其中每个rAAVhu68独立地选自如本文所述的rAAVhu68。在某些实施方案中，平均AAVhu68衣壳包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1至1.5个vp2比3至10个vp3蛋白。在某些实施方案中，平均AAVhu68衣壳包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1个vp2比3至6个vp3蛋白。在某些实施方案中，组合物被配制用于静脉内递送。在某些实施方案中，组合物被配制用于鼻内或肌内递送。在某些实施方案中，组合物包含至少rAAVhu68载体原液和任选的载剂、赋形剂和/或防腐剂。
可以使用可用于产生重组AAVhu68的任何合适的rAAV生产***。例如，这样的生产***可包括：(a)编码SEQ ID NO：16氨基酸序列的AAVhu68衣壳核酸序列；(b)适于包装到AAVhu68衣壳中的核酸分子，所述核酸分子包含至少一个AAV反向末端重复(ITR)和编码基因产物的非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列与指导产物在宿主细胞中表达的序列可操作地连接；以及(c)足够的AAV rep功能和辅助功能，以允许将核酸分子包装到重组AAVhu68衣壳中。在某些实施方案中，(a)的核酸序列至少包含SEQ ID NO：18，或与编码SEQ ID NO：16氨基酸序列的SEQ ID NO：18具有至少70％至至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，该***任选地还包含编码SEQ ID NO：16的约aa 203至约氨基酸736的AAVhu68 vp3的SEQID NO：18的约nt 607至约nt 2211的核酸序列。在某些实施方案中。该***包含人胚肾293细胞或杆状病毒***。
在某些实施方案中，提供了用于降低AAVhu68衣壳的脱酰胺的方法。该方法包括从含有修饰的AAVhu68vp密码子的核酸序列产生AAVhu68衣壳，该核酸序列独立地包含位于SEQ ID NO：16中的位置58、330、453和/或513处的一至三个精氨酸-甘氨酸对处的修饰的甘氨酸密码子，使得修饰的密码子编码精氨酸以外的氨基酸。在某些实施方案中，该方法包括从含有修饰的AAVhu68vp密码子的核酸序列产生AAVhu68衣壳，该核酸序列独立地包含位于SEQ ID NO：16中的位置57、329、452和/或512处的一至三个精氨酸-甘氨酸对处的修饰的甘氨酸密码子，使得修饰的密码子编码精氨酸以外的氨基酸。在某些实施方案中，每个修饰的密码子编码不同的氨基酸。在某些实施方案中，两个或更多个修饰的密码子编码相同的氨基酸。在某些实施方案中，如本文所述的突变体AAVhu68衣壳包含精氨酸-甘氨酸对中的突变，使得甘氨酸变为丙氨酸或丝氨酸。突变体AAVhu68衣壳可包含一个、两个或三个突变体，其中参考AAVhu68天然地含有四个NG对。在某些实施方案中，突变体AAVhu68衣壳包含NG对中的仅单个突变。在某些实施方案中，突变体AAVhu68衣壳包含在两个不同NG对中的突变。在某些实施方案中，突变体AAVhu68衣壳包含位于AAVhu68衣壳中的结构上分开的位置的两个不同的NG对中的突变。在某些实施方案中，突变不在VP1独特区域中。在某些实施方案中，突变之一在VP1独特区域中。任选地，突变体AAVhu68衣壳不含NG对中的修饰，但包含突变以最小化或消除位于NG对外的一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺中的脱酰胺作用。
如本文所用，“编码的氨基酸序列”是指基于被翻译为氨基酸的参考核酸序列的已知DNA密码子的翻译而预测的氨基酸。下表举例说明了DNA密码子和20种常见氨基酸，示出了单字母代码(SLC)和三字母代码(3LC)。
已经描述了产生衣壳、其编码序列的方法，以及产生rAAV病毒载体的方法。参见，例如，Gao，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10)，6081-6086(2003)和US 2013/0045186A1。
如上所述，AAVhu68序列和蛋白质用于产生rAAV。以下实例描述了具有AAVhu68或AAV9载体的rAAV载体的产生。然而，在另一些实施方案中，选择另一种AAV衣壳。组织特异性由衣壳类型决定。例如，具有AAVhu68的病毒载体在以下实例中示例为可用于转导鼻上皮细胞。本文描述了AAVhu68的序列。此外，已经描述了产生具有AAV9衣壳和来源于AAV9的嵌合衣壳的载体的方法。参见，例如，US 7,906,111，其通过引用并入本文。可以选择转导鼻细胞或其他合适靶标(例如，肌肉或肺)的其他AAV血清型作为AAV病毒载体(DNA酶抗性病毒颗粒)衣壳的来源，包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8(参见，例如，美国公开专利申请号2007-0036760-A1；美国公开专利申请号2009-0197338-A1；和EP 1310571)。还参见WO 2003/042397(AAV7和其他猿猴AAV)、美国专利7790449和美国专利7282199(AAV8)、WO 2005/033321(AAV9)和WO 2006/110689，或尚待发现的或基于其的重组AAV可以用作AAV衣壳的来源。这些文献还描述了可以选择用于产生AAV的其他AAV，并且通过引用并入。在一些实施方案中，用于病毒载体的AAV衣壳(cap)可以通过前述AAV cap或其编码核酸之一的诱变(即，通过***、缺失或替代)产生。在一些实施方案中，AAV衣壳是嵌合的，其包含来自两种或三种或四种或更多种上述AAV衣壳蛋白的结构域。在一些实施方案中，AAV衣壳是来自两种或三种不同AAV或重组AAV的Vp1、Vp2和Vp3单体的嵌合体。在一些实施方案中，rAAV组合物包含超过一种的上述cap。
III.表达盒和载体
包装入AAV衣壳并递送至宿主细胞的基因组序列通常至少由转基因及其调节序列和AAV反向末端重复(ITR)构成。单链AAV和自身互补(sc)AAV都包含在rAAV中。转基因是与载体序列异源的核酸编码序列，其编码目的多肽、蛋白质、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制剂)或其他基因产物。核酸编码序列以允许转基因在靶组织的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与调节组分可操作地连接。
载体的AAV序列通常包含顺式作用的5′和3′反向末端重复序列(参见，例如，B.J.Carter，in“Handbook ofParvoviruses”，编辑P.Tijsser，CRC Press，第155 168页(1990))。ITR序列长度为约145bp。优选地，基本上编码ITR的整个序列都用在分子中，然而这些序列的一些程度的微小修饰是允许的。修饰这些ITR序列的能力在本领域的技术范围内。(参见，例如文献例如Sambrook等人，“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)；以及K.Fisher等人，J.Virol.，70：520 532(1996))。用于本发明的这种分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选择的转基因序列和相关的调节元件的两侧是5′和3′AAV ITR序列。在一个实施方案中，ITR来自不同于提供衣壳的AAV。在一个实施方案中，ITR序列来自AAV2。已经描述了缩短版本的5’ITR，称为ΔITR，其中D序列和末端分辨率位点(terminal resolution site，trs)缺失。在另一些实施方案中，使用全长AAV 5’和3’ITR。但是，也可以选择来自其他AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一个AAV来源的情况下，所得到的载体可以称为假型化的(pseudotyped)。然而，这些元件的其他配置可能是合适的。
除了上面鉴定的重组AAV载体的主要元件外，载体还包含必需的常规控制元件，其以允许转基因在用质粒载体转染或用本发明产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因可操作地连接。如本文所用，“可操作地连接的”序列包括与目的基因相邻的表达控制序列和反式或远距离起作用以控制目的基因的表达控制序列。
调节控制元件通常包含启动子序列作为表达控制序列的一部分，例如位于所选择的5′ITR序列和编码序列之间。可以使用组成型启动子、调节型启动子[参见例如WO2011/126808和WO2013/04943]、组织特异性启动子、或对生理信号有响应的启动子用于本文描述的载体中。
适用于控制治疗产物的表达的组成型启动子的实例包括但不限于鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、CB7启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、泛素C启动子(UbC)、猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期启动子、U6启动子、金属硫蛋白启动子、EF1α启动子、泛素启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子(Scharfmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4626-4630(1991)、腺苷脱氨酶启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸甘油突变酶启动子、β-肌动蛋白启动子(Lai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10006-10010(1989))、莫洛尼白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复(LTR)、单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子和本领域技术人员已知的其他组成型启动子。适用于本发明的组织或细胞特异性启动子的实例包括，但不限于，内皮素-I(ET-I)和Flt-I(其是内皮细胞特异性的)、FoxJ1(其靶向纤毛细胞)。
适用于控制治疗产物的表达的诱导型启动子包括对外源剂(例如药理学剂)或生理学诱因有响应的启动子。这些应答元件包括但不限于与结合的HIF-Iα和β的低氧应答元件(HRE)，金属离子应答元件，例如Mayo等人(1982，Cell 29：99-108)；Brinster等人(1982，Nature 296：39-42)和Searle等人(1985，Mol.Cell.Biol.5：1480-1489)所述；或热休克应答元件，例如Nouer等人所述(于：Heat Shock Response，编辑Nouer，L.，CRC，Boca Raton，Fla.，第I67-220页，1991)。
在一个实施方案中，中和抗体构建体的表达由调节型启动子控制，所述启动子对编码中和抗体构建体的基因的转录提供严格控制，例如药理学剂，或者被药理学剂或在替代实施方案中被生理学诱因激活的转录因子。优选非渗漏且可被严格控制的启动子***。
可用于本发明的作为配体依赖性转录因子复合物的调节型启动子的实例包括但不限于被其各自配体(例如糖皮质激素，***，孕激素，类维生素A，蜕皮激素及其类似物和模拟物)激活的核受体超家族成员和被四环素激活的rTTA。在本发明的一个方面，基因开关是基于EcR的基因开关。这样的***的实例包括但不限于在美国专利号6,258,603、7,045,315，美国公开专利申请号2006/0014711、2007/0161086和国际公开的申请号WO 01/70816中描述的***。嵌合蜕皮激素受体***的实例描述于以下中：美国专利号7,091,038，美国公开专利申请号2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416，以及国际公开申请号WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075和WO 2005/108617，其各自通过引用整体并入。非甾体蜕皮激素激动剂调节***的一个实例是哺乳动物诱导型表达***(New EnglandBiolabs，Ipswich，MA)。
其他启动子***可包括应答元件，包括但不限于四环素(tet)应答元件(例如，Gossen&Bujard(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-551所述)；或激素应答元件，例如Lee等人(1981，Nature 294：228-232)；Hynes等人(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2038-2042)；Klock等人(1987，Nature 329：734-736)；和Israel&Kaufman(1989，Nucl.Acids Res.17：2589-2604)，以及本领域已知的其他诱导型启动子。使用这样的启动子，可以控制中和抗体构建体的表达，例如，通过Tet-开/关***(Gossen等人，1995，Science 268：1766-9；Gossen等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，89(12)：5547-51)；TetR-KRAB***(Urrutia R.，2003，Genome Biol.，4(10)：231；Deuschle U等人，1995，MolCell Biol.(4)：1907-14)；美服培酮(mifepristone)(RU486)调节***(Geneswitch；WangY等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91(17)：8180-4；Schillinger等人，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.102(39)：13789-94)；以及人源化他莫昔芬-dep调节***(Roscilli等人，2002，Mol.Ther.6(5)：653-63)。
在本发明的另一个方面，基因开关基于FK506结合蛋白(FKBP)与FKBP雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的异二聚化，并通过雷帕霉素或其非免疫抑制类似物来调节。这样的***的实例包括但不限于ARGENTTM转录技术(ARIAD Pharmaceuticals，Cambridge，Mass.)和以下中描述的***：美国专利号6,015,709、6,117,680、6,479,653、6,187,757和6,649,595，美国公开号2002/0173474、美国公开号200910100535、美国专利号5,834,266、美国专利号7,109,317、美国专利号7,485,441、美国专利号5,830,462、美国专利号5,869,337、美国专利号5,871,753、美国专利号6,011,018、美国专利号6,043,082、美国专利号6,046,047、美国专利号6,063,625、美国专利号6,140,120、美国专利号6,165,787、美国专利号6,972,193、美国专利号6,326,166、美国专利号7,008,780、美国专利号6,133,456、美国专利号6,150,527、美国专利号6,506,379、美国专利号6,258,823、美国专利号6,693,189、美国专利号6,127,521、美国专利号6,150,137、美国专利号6,464,974、美国专利号6,509,152、美国专利号6,015,709、美国专利号6,117,680、美国专利号6,479,653、美国专利号6,187,757、美国专利号6,649,595、美国专利号6,984,635、美国专利号7,067,526、美国专利号7,196,192、美国专利号6,476,200、美国专利号6,492,106、WO 94/18347、WO 96/20951、WO 96/06097、WO 97/31898、WO 96/41865、WO 98/02441、WO 95/33052、WO 99110508、WO 99110510、WO99/36553、WO 99/41258、WO 01114387，ARGENTTM调节转录逆转录病毒试剂盒，2.0版(9109102)，和ARGENTTM调节转录质粒试剂盒，2.0版(9109/02)，其各自通过引用整体并入本文。Ariad***被设计为由雷帕霉素及其类似物(称为“rapalog”)诱导。合适的雷帕霉素的实例在以上结合ARGENTTM***的描述列出的文件中提供。在一个实施方案中，分子是雷帕霉素[例如，由Pfizer以RapamuneTM销售]。在另一个实施例中，使用被称为AP21967[ARIAD]的rapalog。可用于本发明的这些二聚体分子的实例包括但不限于雷帕霉素、FK506、FK1012(FK506的同二聚体)、雷帕霉素类似物(“rapalog”)，其可通过对天然产物进行化学修饰以添加“***物(bump)”来轻松制备，这些***物可减少或消除对内源FKBP和/或FRAP的亲和力。rapalog的实例包括但不限于，例如AP26113(Ariad)、AP1510(Amara，J.F.等人，1997，Proc Natl Acad Sci USA，94(20)：10618-23)、AP22660、AP22594、AP21370、AP22594、AP23054、AP1855、AP1856、AP1701、AP1861、AP1692和AP1889，其具有设计的使与内源FKBP的相互作用最小化的“***物”。还可以选择其他rapalog，例如AP23573[Merck]。
其他合适的增强子包括适合于期望的靶组织适应症的那些。在一个实施方案中，表达盒包含一个或多个表达增强子。在一个实施方案中，表达盒包含两个或更多个表达增强子。这些增强个可以相同或彼此不同。例如，增强子可包括CMV立即早期增强子。该增强子可以以彼此相邻的两个拷贝存在。或者，增强子的双拷贝可以被一个或多个序列分开。在另一个实施方案中，表达盒还含有内含子，例如鸡β-肌动蛋白内含子。其他合适的内含子包括本领域已知的内含子，例如WO2011/126808中描述的内含子。合适的polyA序列的实例包括例如兔结合球蛋白(rBG)、SV40、SV50、牛生长激素(bGH)、人生长激素和合成polyA。任选地，可以选择一个或多个序列来稳定mRNA。这样的序列的一个实例是经修饰的WPRE序列，其可以设计在polyA序列的上游和编码序列的下游(参见，例如MA Zanta-Boussif，等人，GeneTherapy(2009)16：605-619)。
AAV病毒载体可包含多个转基因。在某些情况下，可以使用不同的转基因编码蛋白质的每个亚基(例如，免疫球蛋白结构域、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链)。在一个实施方案中，在用包含每种不同亚基的病毒感染/转染后，细胞产生多亚基蛋白。在另一个实施方案中，蛋白质的不同亚基可以由相同的转基因编码。在这种情况下，单个转基因包含编码每个亚基的DNA，每个亚基的DNA由内部核酶进入位点(internal ribozyme entry site，IRES)或自切割肽(例如2A)分离。当编码每个亚基的DNA的大小较小，例如，编码亚基和IRES的DNA的总大小小于5千碱基时，IRES是理想的。作为IRES的替代，可以通过编码2A肽的序列来分离DNA，所述2A肽在翻译后事件中自切割。参见，例如，ML Donnelly等人，(1997年1月)J.Gen.Virol.，78(Pt 1)：13-21；S.Furler，S等人，(2001年6月)Gene Ther.，8(11)：864-873；H.Klump等人，(2001年5月)Gene Ther.，8(10)：811-817。该2A肽明显小于IRES，使其非常适合在空间是限制因素的情况下使用。更常见的是，当转基因很大，由多个亚基组成或两个转基因被共同递送时，将携带有期望转基因或亚基的rAAV共同施用，以使其在体内多联化(concatamerize)以形成单个载体基因组。在这样的实施方案中，第一AAV可携带表达单个转基因的表达盒，第二AAV可携带表达不同转基因的表达盒，以用于在宿主细胞中共表达。但是，选择的转基因可以编码任何生物活性产物或其他产物，例如，研究期望的产物。
除了上文针对表达盒所鉴定的元件外，载体还包含常规控制元件，其以允许在用质粒载体转染或者用本发明产生的病毒感染的细胞中编码产物(例如中和抗体或的部分)转录、翻译和/或表达的方式与编码序列可操作地连接。如本文所用，“可操作地连接”的序列包括表达控制序列与目的基因相邻以及表达控制序列反式或远距离起作用以控制目的基因的表达两种情况。
表达控制序列包括适当的增强子；转录因子；转录终止子；启动子；有效的RNA处理信号，例如剪接和多腺苷酸化(polyA)信号；使细胞质mRNA稳定的序列，例如土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强编码产物分泌的序列。
在一个实施方案中，选择调节序列，使得总rAAV载体基因组的大小为约2.0至约5.5kb。在一个实施方案中，期望rAAV载体基因组接近天然AAV基因组的大小。因此，在一个实施方案中，选择调节序列使得总rAAV载体基因组的大小为约4.7kb。在另一个实施方案中，总rAAV载体基因组的大小小于约5.2kb。可以基于包括启动子、增强子、内含子、poly A等在内的调节序列的大小来控制载体基因组的大小。参见，Wu等人，Mol Ther，2010年1月18(1)：80-6，其通过引用并入本文。
因此，在一个实施方案中，内含子包含在载体中。合适的内含子包括鸡β-肌动蛋白内含子，人β球蛋白IVS2(Kelly等人，Nucleic Acids Research，43(9)：4721-32(2015))；Promega嵌合内含子(Almond，B.和Schenborn，E.T.A Comparison of pCI-neo Vector andpcDNA4/HisMax Vector)；和hFIX内含子。适于本文的多种内含子是本领域已知的，包括但不限于在bpg.utoledo.edu/～afedorov/lab/eid.html上发现的内含子，其通过引用并入本文。另请参阅Shepelev V.，Fedorov A.Advances in the Exon-IntronDatabase.Briefings in Bioinformatics 2006，7：178-185，其通过引用并入本文。
在本文描述的研究中产生了多种不同的病毒基因组。然而，本领域技术人员将理解，可以用其他基因组构型，包括其他调节序列来代替启动子、增强子，并且可以选择其他编码序列。编码本文所述的免疫球蛋白结构域和/或融合蛋白的载体基因组和表达盒的实例提供于例如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：31中。适当地，这些说明性载体基因组包含载体元件，包括启动子。(例如鸡β-肌动蛋白、UBC或TBG)、内含子(例如SV40内含子或嵌合内含子)、5’UTR序列(例如c-myc)、Kozak序列、polyA(例如SV40、牛生长激素或兔珠蛋白)。在某些实施方案中，表达盒中包含IRES或弗林蛋白酶(furin)、弗林蛋白酶/F2A或两者。将理解，可以选择其他载体元件。
IV.rAAV载体生产
为了用于产生AAV病毒载体(例如重组(r)AAV)，表达盒可以携带在递送至包装宿主细胞的任何合适的载体上，例如质粒。可以改造用于本发明的质粒，使得它们适于在原核细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等体外复制和包装。合适的转染技术和包装宿主细胞是已知的和/或可由本领域技术人员容易地设计。
制备基于AAV的载体(例如，具有AAV9或其他AAV衣壳)的方法是已知的。参见例如美国公开专利申请号2007/0036760(2007年2月15日)，其通过引用并入本文。本发明不限于使用AAV9或其他进化枝F AAV氨基酸序列，而是涵盖通过本领域已知的其他方法(包括例如通过化学合成、通过其他合成技术或其他方法)产生的含有末端β-半乳糖结合的肽和/或蛋白质。本文提供的任何AAV衣壳的序列可以使用多种技术容易地产生。合适的生产技术是本领域技术人员众所周知的。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor，NY)。或者，也可以通过周知的固相肽合成方法(Merrifield，(1962)J.Am.Chem.Soc.，85：2149；Stewart和Young，SolidPhase Peptide Synthesis(Freeman，San Francisco，1969)第27-62页)来合成肽。这些方法可包括，例如，培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码AAV衣壳的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重复(ITR)和转基因组成的小基因(minigene)；以及足够的辅助功能，以允许将小基因包装到AAV衣壳蛋白中。这些和其他合适的生产方法在本领域技术人员的知识范围内，而不是对本发明的限制。
可将需要在宿主细胞中培养以将AAV小基因包装在AAV衣壳中的组分反式提供给宿主细胞。或者，可以由稳定的宿主细胞提供任何一种或多种所需组分(例如小基因、rep序列、cap序列和/或辅助功能)，所述稳定的宿主细胞已被使用本领域技术人员已知的方法改造为包含一种或多种所需组分。最合适的是，这种稳定的宿主细胞将包含在诱导型启动子的控制下的所需组分。但是，所需组分可以在组成型启动子的控制下。在适用于转基因的调节元件的讨论中，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个替代方案中，选择的稳定宿主细胞可包含在组成型启动子控制下的选择的组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的其他选择的组分。例如，可产生稳定的宿主细胞，其衍生自293细胞(其包含在组成型启动子的控制下的E1辅助功能)，但其包含在诱导型启动子的控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他稳定的宿主细胞。
这些rAAV特别适用于基因递送以用于治疗目的和用于免疫，包括诱导保护性免疫。此外，本发明的组合物还可用于体外产生期望的基因产物。对于体外生产，可以在用包含编码期望产物的分子的rAAV转染宿主细胞并且在允许表达的条件下培养细胞培养物后，从期望培养物获得期望产物(例如蛋白质)。然后可以根据需要纯化和分离表达产物。用于转染、细胞培养、纯化和分离的合适技术是本领域技术人员已知的。产生和分离适合用作载体的AAV的方法是本领域已知的。通常参见例如Grieger&Samulski，2005，″Adeno-associated virus as a gene therapy vector：Vector development，production andclinical applications，″Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.99：119-145；Buning等人，2008，″Recent developments in adeno-associated virus vector technology，″J.GeneMed.10：717-733；以及下面引用的参考文献，其每一篇通过引用整体并入本文。为了将基转因包装到病毒粒子中，ITR是与包含表达盒的核酸分子相同的构建体中顺式所需的唯一AAV组分。cap和rep基因可以反式提供。
在一个实施方案中，将本文所述的表达盒工程化为遗传元件(例如穿梭质粒)，其将其上携带的免疫球蛋白构建体序列转移到包装宿主细胞中以产生病毒载体。在一个实施方案中，可以通过任何合适的方法将选择的遗传元件递送至AAV包装细胞，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的颗粒(high velocity DNA-coated pellet)、病毒感染和原生质体融合。也可以制备稳定的AAV包装细胞。或者，表达盒可用于产生AAV以外的病毒载体，或用于在体外产生抗体混合物。用于制备这样的构建体的方法是核酸操作领域技术人员已知的，包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，MolecularCloning：A Laboratory Manual，编辑Green和Sambrook，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY(2012)。
术语“AAV中间体”或“AAV载体中间体”是指缺少包装在其中的期望基因组序列的组装的rAAV衣壳。这些也可称为“空”衣壳。这样的衣壳可以不包含表达盒的可检测的基因组序列，或仅包含不足以实现基因产物表达的部分包装的基因组序列。这些空衣壳对于将目的基因转移到宿主细胞是没有功能的。
本文描述的重组AAV可以使用已知的技术产生。参见，例如，WO 2003/042397；WO2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772B2。这样的方法包括培养包含核酸序列的宿主细胞，所述核酸序列编码编码AAV衣壳；功能性rep基因；表达盒，其至少由AAV反向末端重复(ITR)和转基因组成；和足够的辅助功能，以允许将表达盒包装到AAV衣壳蛋白中。已经描述了产生衣壳、其编码序列的方法，以及产生rAAV病毒载体的方法。参见，例如，Gao，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10)，6081-6086(2003)和US 2013/0045186A1。
在一个实施方案中，提供了可用于产生重组AAVhu68的生产细胞培养物。这样的细胞培养物包含在宿主细胞中表达AAVhu68衣壳的核酸；适于包装到AAVhu68衣壳中的核酸分子，例如载体基因组，其包含AAV ITR和编码基因产物的非AAV核酸序列，非AAV核酸序列与指导产物在宿主细胞中表达的序列可操作连接；和足够的AAV rep功能和腺病毒辅助功能，以允许将核酸分子包装到重组AAVhu68衣壳中。在一个实施方案中，细胞培养物由哺乳动物细胞(例如人胚肾293细胞等)或昆虫细胞(例如杆状病毒)组成。任选地，rep功能由hu68以外的AAV提供。在某些实施方案中，至少一部分rep功能来自AAVhu68。任选地，rep和cap序列在细胞培养物中在相同遗传元件上。在rep序列和cap基因之间可存在间隔区。任选地，间隔区是atgacttaaaccaggt(SEQ ID NO：33)。这些AAVhu68或突变体AAV衣壳序列中的任何一种可以在指导其在宿主细胞中的表达的外源调节控制序列的控制下。
在一个实施方案中，细胞在合适的细胞培养物(例如，HEK 293)中制备。制备本文所述基因治疗载体的方法包括本领域熟知的方法，例如产生用于产生基因治疗载体的质粒DNA，产生载体和纯化载体。在一些实施方案中，基因治疗载体是AAV载体，并且产生的质粒是编码AAV基因组和目的基因的AAV顺式质粒，包含AAV rep和cap基因的AAV反式质粒，以及腺病毒辅助质粒。载体产生方法可以包括以下方法步骤，例如开始细胞培养，细胞传代，细胞接种，用质粒DNA转染细胞，将转染后培养基更换为无血清培养基，以及收获含有载体的细胞和培养基。收获的含有载体的细胞和培养基在本文中称为粗细胞收获物。在另一个***中，通过用基于杆状病毒的载体感染将基因治疗载体引入昆虫细胞中。关于这些生产***的综述，一般参见例如Zhang等人，2009，″Adenovirus-adeno-associated virus hybridfor large-scale recombinant adeno-associated virus production，″Human GeneTherapy 20：922-929，其通过引用整体并入本文。制备和使用这些和其他AAV生产***的方法也在以下美国专利中有所描述，每篇专利的内容通过引用整体并入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。
此后，粗细胞收获物可以是以下方法步骤，例如载体收获物的浓缩，载体收获物的渗滤，载体收获物的微流化，载体收获物的核酸酶消化，微流化中间体的过滤，通过过滤的粗制物纯化，通过超速离心的粗制物纯化，通过切向流过滤的缓冲液交换，和/或配制和过滤以制备大量载体。
可以使用高盐浓度下的两步亲和色谱纯化然后阴离子交换树脂色谱法来纯化载体药物产品并除去空衣壳。这些方法更详细描述在以下中：2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US2016/065970及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,071和2015年12月11日提交的62/226,357，名称为“Scalable Purification Methodfor AAV9”，其各自通过引用并入本文。对于AAV8的纯化方法，2016年12月9日提交的国际专利申请PCT/US2016/065976及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,098和2015年12月11日提交的62/266,341，和rh10，2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/66013及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,055和题为“Scalable Purification Method for AAVrh10”的同样于2015年12月11日提交的62/266,347，以及对于AAV1，2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US2016/065974及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利申请62/322,083和2015年12月11日提交的“Scalable Purification Method for AAV1”的62/26,351，其均通过引用并入本文中。
为了计算空颗粒和完整颗粒含量，将所选样品的vp3带体积(例如，在本文的实施例中，碘克沙醇梯度纯化的制剂，其中GC数目＝颗粒数目)相对于负载的GC颗粒作图。将得到的线性方程(y＝mx+c)用于计算测试制品峰的带体积中的颗粒数。然后将每20μL负载的颗粒数(pt)乘以50，得到颗粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL得到颗粒与基因组拷贝的比率(pt/GC)。Pt/mL-GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL并且x100给出空颗粒的百分比。
通常，用于测定空衣壳和具有包装的基因组的AAV载体颗粒的方法是本领域已知的。参见，例如，Grimm等人，Gene Therapy(1999)6：1322-1330；以及Sommer等人，Molec.Ther.(2003)7：122-128。为了测试变性衣壳，该方法包括使经处理的AAV原种经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如，在缓冲液中含有3-8％Tris-乙酸盐的梯度凝胶，然后运行凝胶直至样品材料分离，并将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜上，优选尼龙。然后使用抗AAV衣壳抗体作为与变性衣壳蛋白结合的一抗，优选抗AAV衣壳单克隆抗体，最优选B1抗AAV-2单克隆抗体(Wobus等人，J.Virol.(2000)74：9281-9293)。然后使用二抗，其与一抗并包含用于检测与一抗结合的手段，更优选包含与其共价结合的检测分子的抗IgG抗体，最优选与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠IgG抗体。将用于检测结合的方法用于半定量测定一抗和二抗之间的结合，优选能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选化学发光检测试剂盒。例如，对于SDS-PAGE，可以取出来自柱级分的样品并在含有还原剂(例如DTT)的SDS-PAGE上样缓冲液中加热，并且在预制的梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如Novex)上分离衣壳蛋白。可以使用SilverXpress(Invitrogen，CA)根据制造商的说明书或其他合适的染色方法，即SYPRO红宝石或考马斯染色剂进行银染色。在一个实施方案中，可以通过定量实时PCR(Q-PCR)测量柱级分中AAV载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释并用DNA酶I(或另一种合适的核酸酶)消化以除去外源DNA。在核酸酶灭活后，将样品进一步稀释并使用引物和对引物之间的DNA序列特异的TaqManTM荧光探针进行扩增。在Applied Biosystems Prism 7700序列检测***上测量每个样品达到确定荧光水平所需的循环数(阈值循环，Ct)。含有与AAV载体中包含的序列的相同序列的质粒DNA用于在Q-PCR反应中产生标准曲线。从样品获得的循环阈值(Ct)值用于通过将其相对于质粒标准曲线的Ct值进行归一化来确定载体基因组滴度。也可以使用基于数字PCR的终点测定。
另外，本领域中还已知其他测量空颗粒与完整颗粒比率的实例。在分析超速离心机(AUC)中测量的沉降速度可以检测聚集体、其他次要组分以及基于其不同沉降系数提供不同颗粒物质的相对量的良好定量。这是基于长度和时间的基本单位的绝对方法，不需要标准分子作为参考。将载体样品加载到具有12mm光程长度的2通道炭-epon中心片的池中。将提供的稀释缓冲液加载到每个池的参考通道中。然后将加载的池置于AN-60Ti分析转子中并装入配有吸光度和RI检测器的Beckman-Coulter ProteomeLab XL-I分析超速离心机中。在20℃下完全温度平衡后，使转子达到12,000rpm的最终运行速度。大约每3分钟记录A280扫描，持续约5.5小时(每个样品扫描总共110次)。使用c方法分析原始数据，并在分析程序SEDFIT中实施。绘制得到的尺寸分布并对峰值积分。与每个峰相关联的百分比值表示在所有峰下的总面积的峰面积分数，并且基于在280nm处产生的原始数据；许多实验室使用这些值来计算空颗粒：完整颗粒比率。然而，因为空颗粒和完整颗粒在该波长处具有不同的消光系数，所以可以相应地调整原始数据。消光系数调整之前和之后的空颗粒与完整单体峰值的比率用于确定空颗粒-完整颗粒比率。
在一个方面，使用优化的q-PCR方法，其利用广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶K(例如可从Qiagen商购获得)。更具体地，优化的qPCR基因组滴度测定与标准测定相似，除了在DNA酶I消化之后，将样品用蛋白酶K缓冲液稀释并用蛋白酶K处理，然后加热灭活。适当地用量等于样品大小的蛋白酶K缓冲液稀释样品。蛋白酶K缓冲液可以浓缩至2倍或更高。通常，蛋白酶K处理为约0.2mg/mL，但可以在0.1mg/mL至约1mg/mL之间变化。处理步骤通常在约55℃下进行约15分钟，但可以在较低温度(例如，约37℃至约50℃)下进行较长时间段(例如，约20分钟至约30分钟)，或者较高温度(例如，高至约60℃)下进行较短时间段(例如，约5至10分钟)。类似地，热灭活通常在约95℃下保持约15分钟，但温度可降低(例如，约70℃至约90℃)并延长时间(例如，约20分钟至约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)并如标准测定中所述进行TaqMan分析。也可以使用ViroCyt或流式细胞仪进行定量。
另外或可替代地，可以使用液滴数字PCR(ddPCR)。例如，已经描述了通过ddPCR确定单链和自身互补AAV载体基因组滴度的方法。参见，例如，M.Lock等人，Hu Gene TherapyMethods，Hum Gene Ther Methods.2014 Apr；25(2)：115-25.doi：10.1089/hgtb.2013.131.Epub2014年2月14日。
简而言之，用于使具有包装的基因组序列的rAAVhu68颗粒与缺少基因组的AAVhu68中间体分离的方法涉及对包含重组AAVhu68病毒颗粒和AAVhu68衣壳中间体的悬浮液进行快速表现液相色谱(fast performance liquid chromatography)，其中AAVhu68病毒颗粒和AAVhu68中间体与在pH为10.2时平衡的强阴离子交换树脂结合，并进行盐梯度，同时在约260和约280下监测洗脱液的紫外吸收。虽然对于rAAVhu68不太理想，但pH可为约10.0至10.4。在该方法中，当A260/A280的比率达到拐点时，从洗脱级分收集AAVhu68完整衣壳。在一个实例中，对于亲和色谱步骤，可以将渗滤的产物应用于有效捕获AAV2/hu68血清型的Capture SelectTMPoros-AAV2/9亲和树脂(Life Technologies)。在这些离子条件下，显著百分比的残留细胞DNA和蛋白质流过色谱柱，而AAV颗粒被有效捕获。
V.组合物和用途
本文提供了包含至少一种rAAV原种(例如rAAVhu68原种)和任选的载体、赋形剂和/或防腐剂的组合物。rAAV原种是指多个相同的rAAV载体，例如，如下面在浓度和剂量单位的讨论中所述的量。
如本文所用，术语“AAVhu68.JAb”是指具有如本文所定义的AAVhu68衣壳的rAAV，所述衣壳具有包装在其中的编码抗流感抗体(Ab)结构域的载体基因组。如本文所用，术语“AAV9.JAb”是指具有如本文所定义的AAV9衣壳的rAAV，所述衣壳具有包装在其中的编码抗流感抗体(Ab)结构域的载体基因组。在某些实施方案中，单个rAAV原种任选地在一种或多种融合蛋白中编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的全部四个免疫球蛋白区域。载体基因组可以包括本文所示的任何基因组，例如SEQ ID NO：19；SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：31，或如本文所述改造的另一种载体基因组。
在某些实施方案中，组合物可以包含至少第二不同的rAAV原种。通过具有不同的AAV衣壳和/或不同的载体基因组，第二种载体原种可以不同于第一种载体原种。在某些实施方案中，本文所述的组合物可以包含表达本文所述表达盒的不同载体，或另一种抗流感组分(例如，抗体构建体、另一种生物和/或小分子药物)。
如本文所用，“载剂(carrier)”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶体等。将这样的介质和剂用于药物活性物质是本领域熟知的。补充的活性成分也可以引入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。递送载剂例如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可用于将本发明的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以配制用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中来递送。
在一个实施方案中，组合物包括适于递送至受试者的最终制剂，例如，缓冲至生理学相容的pH和盐浓度的水性液体悬浮液。任选地，制剂中存在一种或多种表面活性剂。在另一个实施方案中，组合物可以作为浓缩物运输，将其稀释用于向受试者施用。在另一些实施方案中，可以将组合物冻干并在施用时复原。
合适的表面活性剂或表面活性剂的组合可选自无毒的非离子表面活性剂。在一个实施方案中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如F68[BASF]，也称为泊洛沙姆188，其具有中性pH，平均分子量为8400。可以选择其他表面活性剂和其他泊洛沙姆，即由两侧是两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链的中央聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))疏水链构成的非离子三嵌段共聚物，SOLUTOL HS 15(Macrogol-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧基辛基甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一个实施方案中，制剂包含泊洛沙姆。这些共聚物通常用字母“P”(对于泊洛沙姆)跟三个数字命名：前两个数字x100给出聚氧丙烯核心的近似分子量，最后一个数字x 10给出聚氧乙烯含量百分比。在一个实施方案中，选择泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的高至约0.0005％至约0.001％的量存在。
以足够的量施用载体以转染细胞并提供足够水平的基因转移和表达，以提供治疗益处而没有不适当的副作用，或具有医学上可接受的生理作用，这可由医学领域的技术人员确定。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至期望器官(例如，肝脏(任选地通过肝动脉)、肺、心脏、眼睛、肾)、口服、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其他肠胃外施用途径。如果需要，施用途径可以组合。
病毒载体的剂量主要取决于诸如所治疗的病症，患者的年龄、体重和健康等因素，并且因此可能因患者而异。例如，病毒载体的治疗有效人剂量通常为约25至约1000微升至约5mL的含有约109至4x1014GC AAV载体的剂量范围的水性悬浮液。调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且这样的剂量可根据使用重组载体的治疗应用而变化。可以监测转基因的表达水平以确定导致含有小基因的病毒载体、优选AAV载体的剂量频率。任选地，使用本发明的组合物，可以使用与用于治疗目的描述的剂量方案类似的剂量方案进行免疫。
复制缺陷型病毒组合物可配制成剂量单位，以包含以下量的复制缺陷型病毒：约109GC至约1016GC(以治疗体重平均70kg的受试者)，包括该范围内的所有整数或分数量，并且对于人患者优选为1012GC至1014GC。在一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010或9x1010GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011或9x1011GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012或9x1012GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、7x1013、8x1013或9x1013GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014或9x1014GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在另一个实施方案中，将组合物配制成每剂量包含至少1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015或9x1015GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在一个实施方案中，对于人施用，剂量可以为每剂量1010至约1012GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在一个实施方案中，对于人施用，剂量可以为每剂量109至约7x1013GC，包括该范围内的所有整数或分数量。在一个实施方案中，对于人施用，剂量为6.25x1012GC至5.00x1013GC。在另一个实施方案中，剂量为约6.25x1012GC、约1.25x1013GC、约2.50x1013GC或约5.00x1013GC。在某些实施方案中，将该剂量均等地分成其一半，并施用于每个鼻孔。在某些实施方案中，对于人施用，剂量为6.25x1012GC至5.00x1013GC，以每个鼻孔施用两个0.2ml的等份试样，每个受试者中递送的总体积为0.8ml。
这些上述剂量可以在各种体积的载剂、赋形剂或缓冲剂制剂施用：约25至约1000微升，或更高的体积，包括该范围内的所有数字，这取决于待治疗区域的大小、使用的病毒滴度、施用途径和该方法的期望效果。在一个实施方案中，载体、赋形剂或缓冲剂的体积为至少约25μL。在一个实施方案中，体积为约50μL。在另一个实施方案中，体积为约75μL。在另一个实施方案中，体积为约100μL。在另一个实施方案中，体积为约125μL。在另一个实施方案中，体积为约150μL。在另一个实施方案中，体积为约175μL。在另一个实施方案中，体积为约200μL。在另一个实施方案中，体积为约225μL。在另一个实施方案中，体积为约250μL。在另一个实施方案中，体积为约275μL。在另一个实施方案中，体积为约300μL。在另一个实施方案中，体积为约325μL。在另一个实施方案中，体积为约350μL。在另一个实施方案中，体积为约375μL。在另一个实施方案中，体积为约400μL。在另一个实施方案中，体积为约450μL。在另一个实施方案中，体积为约500μL。在另一个实施方案中，体积为约550μL。在另一个实施方案中，体积为约600μL。在另一个实施方案中，体积为约650μL。在另一个实施方案中，体积为约700μL。在另一个实施方案中，体积为约700至1000μL。
在某些实施方案中，重组载体可通过对每个鼻孔使用两次喷雾鼻内给药。在一个实施方案中，通过交替地对每个鼻孔施用两次喷雾，例如左鼻孔喷雾，右鼻孔喷雾，然后左鼻孔喷雾，右鼻孔喷雾。在某些实施例中，交替喷雾之间可能存在延迟。例如，每个鼻孔可以接受多次喷雾，其间隔为约10至60秒，或20至40秒，或约30秒至数分钟或更长时间。这样的喷雾可以在每次喷雾中递送例如约150μL至300μL，或约250μL，以达到约200μL至约600μL、400μL至700μL、或450μL至1000μL的总剂给药体积。
在某些实施方案中，重组AAV载体可以鼻内给药，以达到5-20ng/ml的转基因表达产物(例如中和抗体构建体，JAb210a MDAb)浓度，如在给药后，例如施用载体后一周至四周，或约两周在鼻洗液中测量的。获得受试者中的鼻洗液的方法以及对转基因表达产物进行定量的方法是常规的。参见例如实施例18和19。
对于其他施用途径，例如静脉内或肌内，剂量水平将高于鼻内递送。例如，这样的悬浮液可以是约1mL至约25mL的体积剂量，剂量高至约2.5x1015GC。
可以根据公开的方法将上述重组载体递送至宿主细胞。优选悬浮在生理学上相容的载剂中的rAAV可以施用于人或非人哺乳动物患者。在另一个实施方案中，组合物包含载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。考虑到转移病毒针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的载剂。例如，一种合适的载剂包括盐水，其可以用各种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其他示例性载剂包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。缓冲剂/载剂应包含防止rAAV粘附于输注管但不干扰体内rAAV结合活性的组分。
任选地，除了rAAV和载体之外，本发明的组合物可以包含其他常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
根据本发明的组合物可包含如上文所定义的药学上可接受的载剂。合适地，本文所述的组合物包含有效量的一种或多种AAV，其悬浮在药学上合适的载剂中和/或与合适的赋形剂混合，其设计用于通过注射、渗透泵、鞘内导管递送至受试者，或用于通过其他装置或路线递送。在一个实例中，组合物被配制用于鼻内施用。在另一个实例中，组合物被配制用于肌内施用。在另一个实例中，组合物被配制用于静脉内施用。在另一个实例中，组合物被配制用于腹膜内施用。
在一个实施方案中，将包含编码抗病原体构建体(例如中和性抗体构建体)的病毒载体的组合物作为液体(例如雾化、气雾剂、喷雾剂等)以相对低的滴注量经鼻内递送至受试者，以使肺转导最小化。在一个实施方案中，小体积AAV的递送将大于约70％、大于80％、大于90％、大于约95％或大于约99％的转导(通过表达测量)限制于到鼻上皮。在另一个实施方案中，病毒载体可通过鼻内喷雾剂以外的方式(例如鼻内注射)局部递送。
在某些实施方案中，鼻内递送装置提供了喷雾器，其递送平均尺寸为约30微米至约100微米尺寸的颗粒雾。在某些实施方案中，平均尺寸为约10微米至约50微米。合适的装置已经在文献中进行了描述，并且一些是可商购的，例如，LMA MAD NASALTM(TeleflexMedical；Ireland)；Teleflex VaxINatorTM(Teleflex Medical；Ireland)；来自KurveTechnologies的Controlled Particle(CPD)。还参见PG Djupesland，DrugDeliv and Transl.Res(2013)3：42-62。在某些实施方案中，控制递送的粒度和体积以便优先靶向鼻上皮细胞并使对肺的靶向最小化。在另一些实施方案中，颗粒雾为约0.1微米至约20微米或更小，以便递送至肺细胞。这种较小的粒度可以使在鼻上皮中的保留最小化。
可以使用任何合适的方法或途径来施用本文所述的含AAV的组合物，以及任选地本文所述的AAV介导的抗体一起共同施用其他活性药物或疗法。施用途径包括例如全身、口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用。
在一个实施方案中，提供了冷冻组合物，其包含冷冻形式的如本文所述缓冲溶液中的rAAV。任选地，该组合物中存在一种或多种表面活性剂(例如，Pluronic F68)、稳定剂或防腐剂。合适地，使用时，将组合物解冻并用合适的稀释剂(例如无菌盐水或缓冲盐水)滴定至期望剂量。
任选地，本文描述的组合物可以与针对其他病毒靶标的其他抗病毒药物和/或疫苗组合使用，包括其他流感疫苗，包括：甲型流感、乙型流感和丙型流感。甲型流感是最致命的人病原体。与大流行相关的甲型流感病毒血清型包括：H1N1，其造成1918年的西班牙流感和2009年的猪流感；H2N2，其造成1957年的亚洲流感；H3N2，其造成1968年的香港流感；H5N1，其造成2004年的禽流感；H7N7；H1N2；H9N2；H7N2；H7N3；和H10N7。已经描述了针对甲型流感的广泛中和抗体。如本文所用，“广泛中和抗体(broadly neutralizing antibody)”是指可以中和来自多个亚型的多个毒株的中和抗体。例如，CR6261[The Scripps Institute/Crucell]被描述为一种单克隆抗体，可与广泛的流感病毒结合，包括1918年“西班牙流感”(SC1918/H1)以及2004年在越南从鸡传染给人的禽流感H5N1类别的病毒(Viet04/H5)。CR6261识别血凝素膜近端茎中高度保守的螺旋区，血凝素是流感病毒表面上的主要蛋白质。该抗体描述于WO 2010/130636中，其通过引用并入本文。已经描述了另一种中和抗体F10[XOMA Ltd]可用于抗H1N1和H5N1(Sui，Jianhua等人″Structural and functionalbases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza Aviruses.″Nature structural&molecular biology 16.3(2009)：265-273)。可以选择其他针对流感的抗体，例如Fab28和Fab49。参见例如WO 2010/140114和WO 2009/115972，其通过引用并入本文。还可以容易地选择其他抗体，例如WO 2010/010466、美国公开专利公布US/2011/076265和WO 2008/156763中所述的那些抗体。
例如在WO 2012/145572中描述了使用这些rAAV例如进行被动免疫的方法。其他递送和使用方法对于本领域技术人员将是明显的。例如，除了本文所述的一种或多种组合之外，本文所述的方案可以包含与生物药物、小分子药物、化学治疗剂、免疫增强剂、辐射、手术等中的一种或多种的进一步组合。如本文所述的生物药物基于肽、多肽、蛋白质、酶、核酸分子、载体(包括病毒载体)等。
在联合治疗中，在开始用另一种剂(例如抗病毒治疗、抗生素)治疗之前、期间或之后以及其任何组合(即在开始治疗之前和期间，之前和之后，期间和之后，或之前、期间和之后、)施用本文所述的AAV递送的免疫球蛋白构建体。例如，可以在8小时至30天施用AAV，在某些实施方案中，它可以是开始治疗之前约12小时、1天、约3天、约3至30天、或5至12天。
实施例
以下实施例仅是说明性的，而不是对本文所述发明的限制。
下面使用了一些缩写词：AAV，腺相关病毒；BALF，支气管肺泡灌洗液；CB7，具有巨细胞病毒增强子元件的鸡β-肌动蛋白启动子；cDNA，互补DNA；GC，基因组拷贝；HRP，辣根过氧化物酶；IN，鼻内；IP，腹膜内；ITR，反向终端重复；kg，千克；ORF，开放阅读框；polyA，多腺苷酸化；和rBG，兔β-珠蛋白。
在季节性和/或大流行性流感感染的情况下，为了开发基于腺相关病毒(AAV)载体的针对甲型和乙型流感的预防方案以替代传统流感疫苗，发现了在气道上皮中具有增强的性能特性的新型AAV载体。使用设计用于从多种人和非人灵长类动物组织中检测和分离内源性AAV的高度专业化的分子技术，从人组织中分离出了一种新型AAV AAVhu68。该载体表现出有利的表型，包括改善的可制造性和对许多不同组织类型的增强的转导。使用AAVhu68作为示例的候选AAV载体血清型，优化了流感抗体表达盒。测试了仅一种AAV载体，其编码单个开放阅读框以表达多结构域Ab(MDAb)。
实施例1-新进化枝F AAV-AAVhu68
使用QIAamp柱(Qiagen)根据制造商的推荐(具有以下修改)从人组织样品中提取组织DNA作为PCR模板。如Gao等人[Proc Natl Acad Sci USA，2002年9月3日，99(18)：11854-11859(Epub 2002年8月21日)]所述，因为Q5 DNA聚合酶(Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix，NEB)具有非凡的高保真度和强效率，选择所述Q5 DNA聚合酶以回收样品中潜在AAV的全长VP1基因，其中引物组修改如下：使用引物prm504[GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC，SEQ ID NO：28]代替AV1NS，并且使用prm505[CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA，SEQ ID NO：29]代替反向引物AV2CAS。
PCR条件修改如下：
μL
水 9
prm504 1.25
prm505 1.25
模板 1
2X Q5 12.5
PCR程序
从凝胶中切出来自PCR的～3kb的条带；用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取DNA，并克隆到ZeroPCR克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific)中。对质粒进行测序以获得AAV VP1基因的全长。对于大多数样品，对至少三个质粒完全测序，并且绘制共有序列作为该样品的最终AAV序列。
获得的编码AAVhu68的vp1衣壳蛋白的核酸序列在SEQ ID NO：18中提供。还参见图1B-1D。AAVhu68的vp1氨基酸序列在图1A和SEQ ID NO：16中提供。与AAV9(SEQ ID NO：17)、AAVhu31(SEQ ID NO：34)和AAVhu32(SEQ ID NO：35)相比，在AAVhu68中鉴定出两个突变(A67E和A157V)是关键的(图1A中圈出)。
然后通过将AAVhu68的VP1基因加载到pAAV2/9骨架中代替AAV9 VP1基因来制备pAAV2/hu68反式质粒，以评估包装效率、产量和转导性质。pAAV2/9质粒含有在衣壳基因两侧的AAV25’和3’ITR，并且可获自Penn Vector Core[University of Pennsylvania，Phila，PA US，pennvectorcore.med.upenn.edu]。
实施例2-AAVhu68载体的产量
产生并评估携带多种转基因盒(例如GFP和LacZ)的AAVhu68和AAV9载体。每种载体使用三重转染技术在293细胞中产生，如Gao等人[Gao，Guang-Ping，等人″Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.″Proceedings of the National Academy of Sciences 99.18(2002)：11854-11859.]所述。
a.pAAVhu68反式质粒的产生
编码vp1衣壳蛋白的核酸序列在SEQ ID NO：18中提供。
通过将AAVhu68的VP1基因加载到pAAV2/9骨架中代替AAV9VP1基因来制备pAAV2/hu68反式质粒，以评估包装效率、产量和转导性质。pAAV2/9质粒含有在衣壳基因两侧的AAV25’和3’ITR，并且可获自Penn Vector Core[University of Pennsylvania，Phila，PAUS，pennvectorcore.med.upenn.edu]。
b.AAVhu68载体的产量
在37℃的5％CO2气氛下，在具有10％胎牛血清的Eagle最低基本培养基中培养和维持293细胞。如Gao等人[Gao，Guang-Ping，等人″Novel adeno-associated viruses fromrhesus monkeys as vectors for human gene therapy.″Proceedings of the NationalAcademy of Sciences99.18(2002)：11854-11859.]所述进行转染，用pAAV2/hu68或pAAV2/9代替载体质粒。将转染的细胞在6孔板中进一步培养。收集细胞的总裂解物以及上清液，用于使用靶向polyA区域的探针和引物通过TaqMan(Applied Biosystems)进行病毒定量，如Gao等人[Gao，Guangping，等人″Purification of recombinant adeno-associated virusvectors by column chromatography and its performance in vivo.″Human genetherapy 11.15(2000)：2079-2091.]所述。在上清液滴度和总裂解物滴度两方面，在6孔板中头对头比较6个pAAV2/9质粒和6个pAAV2/hu68质粒的产量。每个质粒来自单个细菌菌落。
发现就总裂解物而言，AAVhu68的产量与AAV9的产量相似。然而，在上清液中，AAVhu68的产量显著高于AAV9的产量。因此，就规模化生产而言，AAVhu68被证明是比AAV9更好的载体，因为上清液对于扩大规模生产是优选的。
c.具有抗体构建体的不同AAV衣壳的比较
在一项研究中，AAVhu68载体的产量有所提高(表1)。
表1.AAV1、AAV9和AAVhu68载体的产量。
实施例3-AAVhu68介导的鼻内施用至BALB/c小鼠以保护对抗A/Puerto Rico/8/34(PR8-MTS)的鼻攻击
本研究的目的是评估和比较当在小鼠中鼻内施用(IN)时AAV1.CB7.hJAb、AAV9.CB7.hJAb和AAVhu68.CB7.hJAb载体的保护效力，所有这些载体均旨在赋予针对甲型流感(A/Puerto Rico/8/34)的预防。对于所有研究，雌性BALB/c小鼠(6周龄)购自杰克逊实验室(Bar Harbor，Maine)，并饲养在宾夕法尼亚大学转化研究实验室的动物设施(AnimalFacility of the Translational Research Laboratories at the University ofPennsylvania)中。本文描述的所有动物程序均得到宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the University ofPennsylvania)的批准。
将麻醉的小鼠通过其背切齿悬吊，并鼻内接受(IN)109基因组拷贝(GC)的每种AAV载体，所述AAV载体在PBS中稀释至作为三个17μl的等份试样递送的51μl总体积。在载体施用后7天进行攻击研究。将麻醉的小鼠通过其背切齿悬吊，并且IN施用作为三个17μl的等份试样递送的51μl流感A/Puerto Rico/8/34(即PR8)(5LD50)。在前14天中，每天对小鼠称重一次。对任何表现出痛苦或体重减轻≥30％的小鼠实施安乐死。攻击后21天处死存活的小鼠。结果显示在图2A-2B中。
总之，IN递送109GC的AAV1.CB7.hJAb赋予了针对PR8攻击的部分保护(40％)并具有明显的体重减轻(＞20％)。相比之下，IN递送109GC剂量的AAV9.CB7.hJAb和AAVhu68.CB7.hJAb赋予了对抗PR8攻击的80％保护，伴随着10-20％的体重减轻。
实施例4-AAVhu68载体施用至BALB/c小鼠以保护对抗B/Lee/40的鼻攻击
本研究的目的是评估和比较当在小鼠中IN施用时AAV1.CB7.hJAb、AAV9.CB7.hJAb和AAVhu68.CB7.hJAb载体的保护效力，所有这些载体均旨在赋予针对乙型流感(B/Lee/40)的预防。
将麻醉的小鼠通过其背切齿悬吊，并IN接受109GC的每种AAV载体，所述AAV载体在PBS中稀释至作为三个17μl的等份试样递送的51μl总体积。
在载体施用后7天进行攻击研究。将麻醉的小鼠通过其背切齿悬吊，并且IN施用作为三个17μl的等份试样递送的51μl流感B/Lee/40(5LD50)。在前14天中，每天对小鼠称重一次。对任何表现出痛苦或体重减轻≥30％的小鼠实施安乐死。攻击后21天处死存活的小鼠。结果显示在图3A-3B中。
简单地说，IN递送109GC的AAV1.CB7.hJAb、AAV9.CB7.hJAb或AAVhu68.CB7.hJAb赋予了对抗B/Lee/40的IN攻击的完全保护，并且在整个攻击过程中均无明显体重减轻。
实施例5-BALB/c小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中AAVhu68介导的hJAb表达的表达谱
本研究的目的是评估当将多种剂量的AAVhu68.CB7.hJAb IN递送至BALB/c小鼠时BALF中hJAb表达的水平。
向小鼠IN递送109GC至1011GC的剂量的AAVhu68.CB7.hJAb载体。7天后对小鼠进行尸检，并将BALF收集在500μl的PBS中。将蛋白A ELISA如下用于定量Ab的量。用蛋白A包被ELISA板。过夜孵育后，将板用0.05％Tween-20/PBS洗涤并封闭。将BALF样品在PBS中稀释，并在37℃下添加到板中1小时。使用生物素-SP-AffiniPure山羊抗人IgG Fcg特异性Ab(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)和链霉亲和素-HRP缀合物(Abcam，Cambridge，MA)检测结合。用TMB底物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)使板显色。结果示于图4。
在IN递送AAVhu68.CB7.hJAb后7天，在小鼠的BALF中检测到hJAb的显著表达。正如预期的那样，随着载体剂量从109GC增加到1011GC，载体处理的小鼠的BALF中hJAb的表达增加。
实施例6-确定AAVhu68.CB7.JAb210a对于对抗甲型流感或乙型流感进行保护的最小有效剂量(MED)
本研究的目的是确定针对甲型或乙型流感的预防所需的AAVhu68.CB7.JAb210a载体的MED。
向BALB/c小鼠IN给予在PBS中稀释至总体积为51μl的3x108GC至1010GC剂量的AAVhu68.JAb210a载体，并且在七天后(此时记录为第0天)用5LD50的PR8或B/LEE/40进行攻击，在研究期间(21天)每天称重。基于感染当天的体重计算体重百分比。
如先前所述向小鼠IN给予51μl中的107GC至1011GC的剂量的AAVhu68.CB7.JAb210a载体。在载体施用后7天进行攻击研究。将小鼠用5LD50的甲型流感病毒(PR8)(图5A和5B)或乙型流感病毒(B/Lee/40)(图6A和6B)进行IN攻击，并每天称重。
如图5A和5B所示，使用109GC剂量的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体实现了对抗PR8攻击的有效保护，并且没有伴随着动物损失或体重减轻。如图5A和5B所示，使用3x108GC剂量的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG实现了存活，并且伴随着显著体重减轻。
如图6A和6B所示，使用109GC剂量的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体实现了对抗B/Lee/40攻击的有效保护，并且没有伴随着动物损失或体重减轻。如图6A和6B所示，使用3x 108GC剂量的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG实现了存活，并且伴随着显著体重减轻。
结论是，AAVhu68.CB7.JAb210a对于对抗PR8进行保护的MED是109GC。此外，赋予对抗PR8的完全保护并且没有伴随着体重减轻的AAVhu68.CB7.JAb210a的剂量是3x109GC。
对于对抗B/Lee/40的保护，AAVhu68.CB7.JAb210a的MED为3x108GC，其相对于2016年12月15日公开的WO 2016/200543中所述的作为AAV9.FI6和AAV9.CR8033的混合物的组合治疗是显著的改善，后者针对B/Lee/40的MED为109GC。赋予对抗B/Lee/40的完全保护并且没有伴随着体重减轻的AAVhu68.CB7.JAb210a的剂量是109GC。
实施例7-用于改善体内表达的hJAb的密码子优化
本研究的目的是通过使用预计改善排列在气道的细胞中hJAb表达的密码子优化方案，通过实现气道上皮细胞中hJAb的优先表达来进一步改善AAV介导的hJAb表达的已证明的效力。使用多种不同的密码子优化方案来改善体内气道中的hJAb表达。除了评估其在流感攻击研究中的效力外，还评估了载体生产的产量。与亲本AAVhu68.CB7.hJAb相比，密码子优化导致AAVhu68.CB7.CI.JAb210a的产量提高～20％。此外，在一系列攻击究中评估了AAVhu68.CB7.CI.JAb210a对抗甲型和乙型流感的保护作用，这些研究旨在(a)建立对抗甲型流感或乙型流感的IN攻击的保护的MED，(b)评估由AAVhu68.CB7.CI.JAb210a赋予的保护的开始，以及(c)评估AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体在存在血清循环AAVhu68特异性NAb的情况下有效重新施用的能力。
实施例8-AAVhu68.CB7.CI.JAb210a介导的对抗甲型或乙型流感的保护的快速开始
本研究的目的是确定在小鼠中IN递送后，AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体对抗甲型流感(PR8)或B型(B/Lee/40)的有效保护的开始。
如之前所述，向BALB/c小鼠IN给予在PBS中稀释至总体积为51μl的109GC或1010GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体，并且在一天、两天、三天或七天后用5LD50的PR8或B/LEE/40病毒进行攻击(在图7A(PR8)和8A(B/Lee/40)中示出，分别作为攻击之前的-1、-2、-3和-7天)，并且在研究期间每天称重。基于感染当天的体重计算体重百分比。
如图7B和7C所示，用1010GC剂量的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体实现了对抗PR8攻击的有效保护的快速开始，并且没有伴随着动物损失。如图8B和8C所示，对于对抗B/Lee/40的保护，用109GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a的log10较低剂量实现了有效保护的快速开始。
实施例9-在存在AAVhu68特异性血清循环Ab的情况下经鼻施用AAVhu68.CB7.JAb210a载体
本研究的目的是确定尽管存在针对AAVhu68的血清循环NAb，但是AAVhu68.CB7.JAb210a载体有效转导气道上皮细胞的能力。如先前所述，向小鼠IN给予51μl的109GC至3x1010GC剂量范围的AAVhu68.CB7.nLacZ载体(与流感转基因不相干表达)。二十八天后(抗体应答的峰值处)或第90天(Nab应稳定化的时间)，从每只经载体处理(和未经载体处理)的小鼠中分离血清，并测定血清中AAVhu68特异性NAb的效价。将第28天和第90天组中的小鼠根据其NAb状态分层，并分配给施用AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体的三个组中的每一组(图9A-9F和图10A-10C)。组1施用109GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a(图9A，第28天，或图10A，第90天)。组2施用3x 109GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a(图9B，第28天，或图10B，第90天)。组3施用1010GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a(图9C，第28天，或图10C，第90天)。
如所预测的，AAVhu68.CB.nLacZ载体的IN递送导致产生血清循环AAVhu68特异性NAb，如图9和10的每个图的右侧所示。
可以在存在血清循环AAVhu68特异性NAb的情况下有效地重新施用AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体。预先存在的血清循环AAVhu68特异性NAb影响109GC载体的有效重新施用。然而，通过将载体剂量增加一半log10至3x 109GC或完整log10至1010GC，我们显著提高了甲型流感攻击的小鼠的存活。在血清循环AAVhu68NAb为1∶20至1∶1,280的小鼠中IN递送剂量为1010GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a导致有效保护小鼠对抗PR8攻击。增大最初暴露于AAVhu68衣壳与施用AAVhu68.CB7.CI.JAb210a之间的时间间隔导致对抗PR8的改善的保护趋势。
实施例10-在小鼠中IN递送后AAVhu68.CB7.hJAb的生物分布概况
向BALB/c小鼠IN给予剂量为1011GC(高)至109GC(低)的AAVhu68.hJAb载体，并在7天后进行尸检。收集组织(肺、肝、脾、心脏和脑)以进行生物分布分析。虚线表示测定中的背景水平。
本研究的目的是确定以下的生物分布概况：a)在IN递送剂量为109GC至1011GC的载体并且在7天后进行尸检之后，AAVhu68.CB7.CI.hJAb载体的生物分布概况；b)在IN递送剂量为提议的MED的100倍高(1011GC)的载体剂量之后，AAVhu68.CB7.CI.JAb210a载体的生物分布概况。研究分为两个部分进行。A部分评估以109至1011GC的剂量IN给予小鼠并且在载体递送后第7天进行尸检的AAVhu68.hJAb的生物分布概况。B部分评估了以最高剂量(1011GC)(其为MED的100倍高)给予小鼠的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a的生物分布概况。在载体施用后30天对小鼠进行尸检。
如之前所述，在A部分研究中，小鼠IN接受在PBS中稀释至51μl总体积的109GC至1011GC的AAVhu68.CB7.hJAb。7天后对小鼠进行尸检，并收集多个组织用于分析AAVhu68的生物分布。
如之前所述，在B部分研究中，小鼠IN接受在PBS中稀释至51μl总体积的1011GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a。30天后对小鼠进行尸检，并收集多个组织用于分析AAVhu68的生物分布。
如所预测的，当IN递送载体时，大多数载体基因组沉积在肺中。在AAVhu68.CB7.hJAb的提议的MED(109GC)下，在脑和心脏中未检测到AAVhu68基因组(图11)，而在脾和肝中检测到的AAVhu68载体基因组水平接近背景(图11)。
随着载体剂量的增加，肝、脾、心脏和脑中沉积的载体基因组的量以剂量依赖性方式增加(图11)。
当使用大剂量的AAVhu68载体时(图11、12A和12B)，在肺以外的组织中检测到AAVhu68基因组。如图12A和12B所示，大多数载体基因组沉积发生在肺中，随后是脾。肾、肝和心脏中存在非常低水平的AAVhu68载体基因组(图12A和12B)。此外，脑、卵巢或眼睛中的AAVhu68基因组水平太接近背景，以致无法准确解释数据(图12A)。
在AAVhu68.CB7.hJAb的提议MED(109GC)下，在脑和心脏中未检测到AAVhu68基因组，而在脾和肝中检测到的AAVhu68基因组水平接近背景。当使用大剂量的AAVhu68载体时(图11、12A和12B)，在肺以外的组织中检测到AAVhu68载体基因组。如图12A所示，脑、卵巢或眼睛中AAVhu68基因组的水平太接近背景，以致不能准确解释数据。
实施例11
AAVhu68.hJAb和AAVhu68.JAb210a载体在体内表现出令人印象深刻的针对甲型流感和乙型流感毒株的致死性攻击的预防特性。当应用于小鼠鼻时，即使当以低剂量施用时，它也赋予对抗甲型或乙型流感毒株的全面保护。
有趣的是，保护性低AAV载体剂量导致产生低水平的血清循环AAV特异性中和抗体。我们显示这些抗体不会损害有效的载体重新施用，如果有必要对有效的通用AAV预防窗口期间可能出现的大流行性流感毒株进行防护，则这是有益的。
目前正在IND中评估该载体的安全性特性，从而能够开展研究以支持该预防性产品进入I期临床试验。
实施例12-使用MAD NasalTM鼻内粘膜雾化(MAD nasal)装置在恒河猴鼻中递送的AAV9.CB7.hJAb的表达和载体分布概况的评估
本研究旨在评估临床递送装置MAD NasalTM鼻内粘膜雾化(MAD nasal)用于将表达恒河猴甲胎蛋白(rhAFP；JAb210a的替代物)的替代载体(AAV9)递送至恒河猴鼻。在鼻灌洗液中评估转基因产物rhAFP的起始和峰值表达水平，并在尸检时评估载体的生物分布。
在载体施用的当天，将动物镇静，称重并记录生命体征。对于鼻腔灌洗液(NLF)收集：将儿科Foley导管放置在其中一个鼻孔中，并且一旦放置到位，就向气球充气，然后将导管向回拉，直到达到阻力为止。将最多5ml磷酸盐缓冲液注入隔离的鼻腔中，并将头侧向放置，以使灌洗液流入位于鼻孔正下方的50ml Falcon管中。在该过程结束时，将远端放置的导管松开并取出，用无菌PBS进行外部清洁，然后放置在相邻的鼻孔中，重复进行该操作。恒河猴用气管内管进行插管以维持气道并保持仰卧位。对于AAV载体的液体递送(动物RA0065)：将儿科Foley导管放置在其中一个鼻孔中，向气球充气，然后将导管向回拉，直到达到阻力为止。将1013GC剂量的AAV载体(体积为1mL)添加到每个鼻孔中，并使其停留～5分钟(总剂量为2x1013GC)。
对于通过MAD nasal的AAV载体递送(动物RQ9476)：将AAV载体通过MAD nasal递送，每个鼻孔为总共0.5ml中的1013GC，两个鼻孔均给药一次(总剂量为2x1013GC)。
在选定的天(第7、21、35、50、81和99天)，监测恒河猴的生命体征、临床病理以及从右鼻孔和左鼻孔两者收集的鼻灌洗液中替代转基因产物的表达。尸检时，收集组织用于分析AAV9载体基因组。MAD nasal与AAV9载体的组合增加的安全特性是脑和嗅球中不存在载体基因组。
使用人甲胎蛋白定量ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc，Minneapolis MN，USA)通过分析NLF样品，检测了AAV9转导的气道细胞分泌的AFP。
当通过MAD nasal将0.5ml总体积中2x1013GC剂量的表达rhAFP的AAV9载体递送至恒河猴的鼻孔时，我们能够分析随着时间NLF中基因的表达。有趣的是，在分析AAV9载体的生物分布时，我们观察到了通过MAD nasal递送的AAV9载体的最小的全身传播，大多数载体基因组在鼻和气管中检出。
向雄性恒河猴IN给予AAV9.CB7.CI.rhAFP.rBG。具体而言，使用MAD NasalTM向一只恒河猴IN给予0.34ml总体积(每个鼻孔给予一个0.170ml的等份试样)中的5.45x1012GC的AAV9.CB7.CI.rhAFP.rBG(正方形，图22)。MAD NasalTM将经批准的药物雾化成可以IN施用的细雾。对于对照恒河猴(圆圈，图22)，载体以液体形式递送(每个鼻孔0.5ml)。这项短期研究旨在评估在使用MAD NasalTM递送到恒河猴鼻时AAV9.CB7.CI.rhAFP.rBG的生物分布概况。99天后对动物进行尸检。注意到在脑(数据未显示)和嗅球中检测到AAV9载体(图22)。
实施例13-恒河猴鼻中AAVhu68.CB7.CI.JAb210a表达谱的评估
本研究旨在评估在使用MAD NasalTM递送到恒河猴鼻时AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG的表达谱。通过MAD NasalTM装置，向雄性恒河猴施用0.34mL体积中的2x1013GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a，所述体积在两个鼻孔之间等分。MAD nasal将经批准的药物雾化成可以IN施用的细雾。根据SOP 7404对所有动物进行每日生存能力检查。根据SOP在所有时间点监测并记录体重、温度、呼吸频率和心率。在第7、14、21、28和35天收集鼻刷，以通过RT-PCR分析JAb210a表达。在评估第35天的数据后，决定是长期跟踪动物还是进行尸检以用于载体生物分布。在第7、14、21、28、35、56和77天收集NLF和血液样品，以分析JAb210a表达。通过专门设计用于检测JAb 210a的基于RT-PCR的测定，在第77天收集的样品中(刮取的鼻细胞，使用细刷从鼻收集的)证实了JAb210a的表达。
组织交叉反应性研究
使用单克隆Ab作为治疗剂需要评估Ab与正常人和恒河猴组织的交叉反应性。组织交叉反应性研究涉及单克隆Ab对于一系列正常人和恒河猴组织的免疫组织化学或细胞化学测试，其根据FDA在1997年2月发布的“Points to Consider in the Manufacture andTesting of Monoclonal Ab Products for Human Use”和EMA在2008年12月发布的“Guideline on Development，Production，Characterisation and Specifications forMonoclonal Antibodies and Related Products”(EMEA/CHMP/BWP/157653/2007)。本研究的目的是使用免疫组织化学评估AAVhu68.CB7.CI.JAb210a转基因产物与人和恒河猴组织的选定组的潜在交叉反应性。
实施例14-老年小鼠中AAVhu68.CB7.CI.JAb210a对抗甲型流感的保护效力的评估
本研究的目的是评估有效预防老年小鼠的潜力，并且评估当在老年(9-18月龄)BALB/c雌性小鼠中IN施用时AAVhu68.CB7.JAb210a载体对抗甲型流感(A/Puerto Rico/8/34)的保护效力。将麻醉的小鼠通过其背切齿悬吊，并使它们IN接受109GC或3x109GC的AAV载体，所述AAV载体在PBS中稀释至作为三个17μl的等份试样递送的51μl总体积。在载体施用后7天进行攻击研究。将麻醉的小鼠通过其背切齿悬吊，并且IN施用作为三个17μl的等份试样递送的51μl PR8(5LD50)。攻击后，将小鼠每天称重，如图13A所示。基于流感攻击当天的体重计算体重减轻百分比。对任何表现出痛苦或体重减轻≥30％的小鼠实施安乐死。在攻击后21天处死存活的小鼠。图13B图示了PR8攻击后的存活百分比。
总而言之，IN递送109GC或3x109GC的AAVhu68.CB7.JAb210a赋予了对抗PR8攻击的完全保护，并且导致保护老年小鼠对抗甲型流感的致死性攻击(5LD50的PR8)。
实施例15-通过流感血凝素的多结构域抗体对抗流感感染的普遍保护
本文报道的是多结构域抗体，其由一组流感血凝素的多种美洲驼单结构域抗体产生，并与针对甲型和乙型流感病毒的空前的广度和效力相关。当静脉内施用或由重组腺相关病毒载体局部表达时，多结构域抗体可保护小鼠对抗甲型和乙型流感感染。结果表明，靶向多个表位的多结构域抗体显示出增强的病毒交叉反应性和效力，并且当与腺相关病毒传递结合使用时，提供了对流感和其他高度易变的病原体的感染的预防。
疫苗对于流感控制和预防仍然是必不可少的，但是大多数由流感疫苗诱导的抗体都能识别血凝素(HA)表面糖蛋白的高度可变的头部区域。这样的抗体主要是毒株特异性的，并且赋予仅对抗一小部分相似的变体的保护。每年选择合适的疫苗株也面临许多挑战，并且与循环病毒的不良匹配可能导致次优的疫苗效力(H.Xie等人，H3N2Mismatch of2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparisonbetween Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps.Sci.Rep.5，15279(2015))。此外，若干研究表明，流感疫苗的效力在老年人中显著降低，而老年人患上流感相关并发症的风险增加。参见，例如，H.Chen等人，Avian flu：H5N1 virus outbreak inmigratory waterfowl.Nature 436，191-192(2005)；M.T.Osterholm，N.S.Kelley，A.Sommer，E.A.Belongia，Efficacy and effectiveness of influenza vaccines：asystematic review and meta-analysis.Lancet Infect Dis.12，36-44(2012)；以及W.E.Beyer等人，Cochrane re-arranged：support for policies to vaccinate elderlypeople against influenza.Vaccine31，6030-6033(2013)。针对来自甲型和乙型流感病毒的多种HA的广泛中和抗体(bnAb)已得到广泛表征。参见，例如，A.K.Kashyap等人，Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avianinfluenza outbreak reveal virus neutralization strategies.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105，5986-5991(2008)；M.Throsby等人，Heterosubtypic neutralizingmonoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered fromhuman IgM+memory B cells.PLoS One 3，e3942(2008)；D.Corti等人，A neutralizingantibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2influenza A hemagglutinins.Science 333，850-856(2011)；C.Dreyfus等人，Highlyconserved protective epitopes on influenza B viruses.Science 337，1343-1348(2012)；D.C.Ekiert等人，Antibody recognition of a highly conserved influenzavirus epitope.Science 324，246-251(2009)；J.Sui等人，Structural and functionalbases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza Aviruses.Nat.Struct.Mol.Biol.16，265-273(2009)；D.C.Ekiert等人，A highlyconserved neutralizing epitope on group 2 influenza A viruses.Science 333，843-850(2011)；R.H.Friesen等人，A common solution to group 2 influenza virus neutralization.Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111，445-450(2014)；P.S.Lee等人，Heterosubtypic antibody recognition of the influenza virus hemagglutininreceptor binding site enhanced by avidity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109，17040-17045(2012)；以及A.Forsman等人，Llama antibody fragments with cross-subtypehuman immunodeficiency virus type 1(HIV-1)-neutralizing properties and highaffinity for HIV-1 gp120.J.Virol.82，12069-12081(2008)。之前，这些bnAb已被提议在老年人和其他高危人群中用作预防剂，但这种用途受到以下的严重阻碍(i)缺乏足够的交叉反应性和对抗甲型流感和乙型流感二者的保护，其使得必须施用至少两种bnAb，以及(ii)需要多次大剂量注射以在在整个流感季节提供保护。
本文提出的是基于具有抗甲型和乙型流感活性的单抗体样蛋白(称为多结构域抗体或MDAb或JAb)的粘膜表达来进行流感预防的策略。在鼻内施用编码MDAb转基因的重组腺相关病毒(AAV)载体后，MDAb转基因在呼吸道上皮表面表达。先前的研究表明，AAV介导的bnAb在鼻咽粘膜处的表达可提供对抗甲型流感病毒感染的长期保护。参见，例如，M.P.Limberis等人，Intranasal antibody gene transfer in mice and ferretselicits broad protection against pandemic influenza.Sci.Transl.Med.5，187ra72(2013)；以及V.S.Adam等人，Adeno-associated virus 9-mediated airway expressionof antibody protects old and immunodeficient mice against influenzavirus.Clin.Vaccine Immunol.21，1528-1533(2014)。
A.AAV9表达的MD3606的预防效力。
为了评估AAV表达的MD3606(AAV9.MD3606)的体内保护作用，我们在用小鼠适应性流感H1N1、H3N2和B病毒攻击的BALB/c小鼠中评估了编码编码抗流感抗体(Ab)结构域的人源化序列的重组AAV9载体的预防效力(图14A至14B)。在流感攻击之前7天，以4×107至5×109基因组拷贝(GC)的载体剂量鼻内施用AAV9.MD3606h。施用5×109GC完全保护小鼠对抗H1N1病毒(A/Puerto Rico/8/34-MA)的致死性攻击，而利用低5倍的剂量，8只小鼠中有7只存活。通过鼻内施用5×108GC的AAV9.MD3606h(已测试的最低剂量)，完全保护了用H3N2病毒(A/Hong Kong/1/68-MA)攻击的小鼠。最后，通过鼻内施用1×109GC的AAV9.MD3606h，完全保护了用乙型流感病毒(B/Lee/40-MA)攻击的小鼠。
以低至5×108GC/小鼠的载体剂量鼻内递送AAV9.MD3606h提供了对抗甲型流感和乙型流感病毒的完全保护。虽然MD3606本身可用于不需要长期抗体暴露的适应症(如流感的暴露后预防或治疗)，但AAV表达的MD3606可用于提供对抗流感感染的长期保护。每年一次鼻内施用表达人源化MD3606的单AAV载体可能足以在整个流感季节内提供被动保护。这种预防方法对疫苗接种效果较差的老年人和其他高危人群特别有益。评估了这种预防策略的安全性和有效性。保护作用的快速开始以及MD3606与禽流感病毒株的空前的交叉反应性也可在流感大流行发生后立即提供预防性治疗，提供相对于标准的基于卵的疫苗生产而言明显的优势。
B.材料和方法-AAV9.hJAb在小鼠中的预防效力
如先前所述(M.P.Limberis等人，Intranasal antibody gene transfer in miceand ferrets elicits broad protection against pandemicinfluenza.Sci.Transl.Med.5，187ra72(2013))构建和产生了在杂交巨细胞病毒(CMV)增强子鸡β-肌动蛋白启动子(CB7)的控制下表达人源化JAb(hJAb)的AAV9载体。将购自Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，USA的六周龄雌性BALB/c小鼠饲圈养在宾夕法尼亚大学转化研究实验室的动物设施中。通过腹膜内注射PBS中的100mg/kg***/10mg/kg甲苯噻嗪混合物对小鼠进行麻醉，通过背切齿悬吊并将后肢支撑在平台上，并且鼻内施用总体积为51μl的PBS中的AAV9.hJAb载体，在交替鼻孔中作为三个17μl等份试样施用。在载体施用后一周，将经处理小鼠和未处理的小鼠称重，如上所述麻醉，并且如上所述施用51μl总体积的PBS中的攻击病毒(5LD50A/Puerto Rico/8/34-MA H1N1、5LD50A/Hong Kong/1/68-MA H3N2或5LD50B/Lee/40-MA)。每天对小鼠称重并监测疾病或痛苦的迹象。对表现出痛苦行为迹象或失去其初始体重的25％的动物实施安乐死。根据宾夕法尼亚大学的机构动物护理和使用委员会的指导批准并进行了实验。
实施例16-AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG的生产和制造
AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG由外部载体组分和内部DNA基因组组成。外部载体组分是血清型hu68，T＝1二十面体衣壳，其由比率为1∶1∶18的三种AAV病毒蛋白VP1、VP2和VP3的60个拷贝组成。衣壳包含单链DNA基因组，所述单链DNA基因组由两侧为两个AAV反向末端重复(ITR)的JAb210a转基因组成。增强子、启动子、内含子、JAb210a编码序列和多腺苷酸化(polyA)信号构成JAb210a转基因。ITR是在载体生产过程中负责基因组复制和包装的遗传元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。JAb210a编码序列的表达由CB7启动子驱动，CB7启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子(C4)和鸡β肌动蛋白启动子之间的杂合体。通过鸡β肌动蛋白内含子(CI)的存在增强了来自该启动子的转录。包含兔β珠蛋白polyA信号以介导人JAb210a mRNA转录物的终止。AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体基因组的示意图显示在图15中。
AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG的制造过程涉及用质粒DNA瞬时转染人胚肾(HEK293)细胞。AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG生产中使用的HEK293主细胞库(MCB)已按照FDA和ICH指南中的详细说明进行了测试和鉴定。在Coming 36-layer(HS-36)中通过聚乙烯亚胺(PEI)介导的HEK293细胞的三重转染来生产原料药(Bulk DrugSubstance，BDS)的批次。下游工艺涉及尽可能远的一次性的封闭式生物处理***(过滤、切向流过滤和柱色谱法)。载体纯化涉及多个正交步骤，并且将AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG在最终配制缓冲液(FFB；总盐浓度为200mM的PBS，0.001％(w/v)普鲁尼克F68和5％甘油)中配制。将BDS批次冷冻，随后解冻，合并，调节至目标浓度，通过0.22μm过滤器进行无菌过滤，并且填充在Daikyo Crystal2ml小瓶(West Pharmaceutical Services，)中。填充数据和介质鉴定提供为批文档包中的一部分。使用至多50xHS-36细胞培养容器的GMP生产批次大小，根据需要计划并使用多个批次以满足所需的载体数量。
AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG通过人HEK 293 MCB细胞的三重质粒转染产生：(i)载体基因组质粒，(ii)称为pAAVhu68.KanR的AAV辅助质粒，其中包含AAV rep2和cap hu68野生型基因，和(iii)称为pAdΔF6(Kan)的辅助腺病毒质粒。pAAVhu68.CB7.JAb210a(p3618)包装载体基因组的大小为4718bp。
A.AAV载体基因组质粒：pAAV.CB7.JAb210a.rBG(p3618)
构建了AAV载体基因组质粒pAAV.CB7.CI.JAb210a.rBG(p3618，图16)，其大小为7976bp。衍生自该质粒的载体基因组是单链DNA基因组，其具有在JAb210a表达盒两侧的AAV2衍生ITR。转基因盒的表达由CB7启动子驱动，CB7启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子(C4)与鸡β肌动蛋白启动子之间的杂合体，而鸡β肌动蛋白内含子(CI)的存在则增强了来自该启动子的转录。表达盒的polyA信号是兔β-珠蛋白(rBG)polyA。通过编码与识别多种流感抗原的MDAb样多肽融合的人IgG1 FC区的序列(GeneArt)的密码子优化和合成构建质粒，并将得到的构建体克隆到质粒pN469中，该质粒是包含CB7、CI和rBG表达元件以产生pAAV.CB7.CI.JAb210a.rBG(p3618)的AAV2 ITR两侧的表达盒。质粒的所有组成部分均由Qiagen Genomic Services通过直接测序验证，并在Puresyn确认为制造过程的一部分。
B.序列元素的描述
反向末端重复(ITR)：AAVITR(GenBank#NC001401)是两端相同但方向相反的序列。当AAV和腺病毒辅助功能以反式提供时，AAV2ITR序列充当载体DNA复制的起点和载体基因组的包装信号两者。因此，ITR序列代表载体基因组复制和包装所需的唯一顺式序列。
CMV立即早期增强子(382bp，GenBank#K03104.1)。
鸡β-肌动蛋白启动子(282bp；GenBank#X00182.1)启动子并用于驱动高水平的Jab210a表达。
选择CB7启动子来驱动hJAb的表达，因为其产生高水平的气道特异性表达。已经观察到由CB7启动子驱动的不同转基因的强的和气道特异性表达，以及包括小鼠、雪貂和MHP在内的多种物种之间的良好翻译性。
鸡β-肌动蛋白内含子：来自鸡β-肌动蛋白基因的973bp内含子(GenBank#X00182.1)存在于载体表达盒中。内含子被转录，但通过剪接从成熟mRNA中除去，将其任一侧的序列合并在一起。已经显示表达盒中内含子的存在有助于mRNA从细胞核转运至细胞质，从而增强稳定水平的用于翻译的mRNA的积累。这是旨在用于提高基因表达水平的基因载体的共同特征。
编码序列：使与识别多种流感抗原的MDAb样多肽融合的人IgG1 FC区经密码子优化和合成。通过针对多种流感抗原进行淘选，从美洲驼VHH库中鉴定出原始可变结构域。将流感特异性美洲驼VHH链完全人源化。人源化过程后，保持了人源化多结构域多肽的特异性和广度。多结构域多肽包含通过柔性Gly-Ser接头连接的4个可变重IgG结构域。
多腺苷酸化信号：127bp兔β-珠蛋白多腺苷酸化信号(GenBank#V00882.1)提供用于抗体mRNA的有效多腺苷酸化的顺式序列。该元件用作转录终止的信号，在新生转录物的3’端的特异性切割事件和添加长多腺苷酸尾。
C.AAVhu68辅助质粒：pAAV2/hu68.KanR(p0068)
构建AAV2/hu68辅助质粒pAAV2/hu.68(批次#p0065；7329bp)。它是AAV辅助质粒，其编码来自AAV血清型hu68的4个野生型AAV2 rep蛋白和3个野生型AAVVP衣壳蛋白。从人心脏组织DNA获得新的AAV序列并命名为AAV血清型hu68。为了产生嵌合包装构建体，去除含有野生型AAV2 rep和AAV9 cap基因的质粒pAAV2/9n(p0061-2)的AAV2 cap基因，并用AAVhu68cap基因质粒pAAV2/hu68(p0065)的片段替代(图17A)。通常驱动rep表达的AAV p5启动子在该构建体中从rep的5’末端移动到cap的3’末端。该设置用于在启动子和rep基因(即质粒骨架)之间引入间隔区，下调rep的表达并提高支持载体产生的能力。pAAV2/9中的质粒骨架来自pBluescriptKS。质粒的所有组成部分已通过直接测序验证。然后用卡那霉素抗性基因替代氨苄青霉素抗性基因，得到pAAV2/hu68n.KanR(p0068)(图17B)。通过由Qiagen GenomicServices进行的DNA质粒测序证实了AAVhu68衣壳基因的同一性。
D.pAdDeltaF6(Kan)腺病毒辅助质粒
构建了质粒pAdDeltaF6(Kan)，其大小为15,774bp。该质粒含有对AAV复制很重要的腺病毒基因组区域，即E2A、E4和VARNA(腺病毒E1功能由293细胞提供)，但不含其他腺病毒复制或结构基因。该质粒不含对复制重要的顺式元件，如腺病毒反向末端重复，因此预期不会产生感染性腺病毒。其来自E1、E3缺失的Ad5分子克隆(pBHG10，基于pBR322的质粒)。在Ad5 DNA中引入缺失以去除不必要的腺病毒基因的表达并将腺病毒DNA的量从32Kb减少至12kb(图18A)。最后，用卡那霉素抗性基因替代氨苄青霉素抗性基因，得到pAdeltaF6(Kan)(图18B)。保留在该质粒中的E2、E4和VAI腺病毒基因以及存在于HEK293细胞中的E1是AAV载体产生所必需的。
E.细菌主细胞库
通过将来自用于质粒DNA扩增的1L过夜细菌培养物中的1mL与等体积的无菌50％甘油混合来制备细菌主细胞库(Bacterial master cell bank，BMCB)甘油原液。从混合物制备每个构建体的BMCB甘油原液的两个0.5mL等份试样，并在-80℃下储存在Nalgene低温小瓶中。为了验证BMCB甘油原液，对扩增的质粒DNA进行涉及限制酶消化的结构分析，然后进行凝胶电泳，并通过Qiagen的Sanger测序进行全质粒序列分析。为了制备用于运输到质粒DNA制造商(Puresyn)的细菌工作细胞库(bacterial working cell bank，BWCB)甘油原液等份试样，从BMCB甘油原液接种3mL培养物并生长过夜。如上所述，使用1mL过夜培养物制备BWCB甘油原液等份试样。通过对从剩余的2ml过夜细菌培养物中提取的DNA进行了如上所述的结构分析，验证了新的BWCB甘油原液等份试样。一旦在质粒DNA生产商处接收，将BWCB甘油原液储存在-80℃的项目特定位置。通过从冷冻的BWCB甘油原液中刮取来接种生产培养物
F.质粒DNA的制造
用于毒理学/生物分布研究和1/2期试验的AAV载体生产中使用的所有质粒由Puresyn通过其特殊临床和IND就绪程序(Special Clinical and IND-Ready Program)制备。当超螺旋质粒是生产最终产品的中间体时，Puresyn产生待用于重组病毒载体或其他产品的cGMP生产的超螺旋质粒。此过程中使用的所有生长培养基都是“无动物成分的(animal-free)”(基于来自每个供应商的针对组分产品的分析证书)。该过程中使用的所有组件，包括发酵瓶、容器、膜、树脂、柱、管以及与质粒接触的任何组件都专用于单一质粒，并且经过认证不含BSE。没有共用的组件，并且在适当时使用一次性用品。使用的树脂、柱和组件仅由Puresyn用于单一质粒的制造。除了使用专用于特定质粒的组件外，在活动的基础上处理质粒。质粒的发酵、裂解和纯化在专用于产生特定质粒的房间中进行。所有房间均标记有指定的质粒名称，并且相同时间在这些房间中不处理其他质粒。在每次质粒生产活动之间都要清洁房间和设备。表2给出了每种质粒的规格。此外，在用于生产重组AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体之前，对所生产的每种质粒进行完全测序。
表2：用于质粒生产的发布规范
G.人胚肾293主细胞库
人胚肾(HEK)293细胞最初是由Frank Graham及其同事通过用剪切的5型腺病毒DNA转化HEK细胞产生(Graham FL等人Characteristics of a human cell linetransformed by DNA from human adenovirus type 5.J Gen Virol 1977；36：59-74.)。细胞表达用于高滴度rAAV生产所需的E1A和E1B基因产物。在DNA质粒转染后，HEK293细胞具有粘附性且可高度转染，产生高效价的rAAV。
H.制造过程
制造过程流程图显示在图19A至19B中，并且代表了AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体的生产过程。进入产品制备的主要试剂显示在图的左侧，过程中质量评估显示在图的右侧。还提供了每个生产和纯化步骤的描述。除非另有说明，否则产品制造遵循单元操作的线性流动并利用一次性封闭式生物处理***。AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG是在指定生产套件中制造的唯一产品。涉及从细胞接种至上清液收集的细胞培养的生产过程的所有步骤均使用无菌的一次性管和袋组件无菌地进行。细胞在10-layer(CS-10)和36-layer(S-36)中培养并且所有开放操作在ISO 5级环境中的II级生物安全柜中进行。在可能的情况下，在封闭***中进行纯化过程；然而，柱色谱操作不被视为完全封闭的***。为了使这种风险最小化，将一次性流路用作色谱柱色谱生产滑动平台(skidplatform)的一部分。在柱色谱纯化后，将产物用FFB渗滤。然后将BDS在≤-60℃下冷冻。在用经批准的规格对BDS批次进行单独测试和验证后，将它们解冻，根据需要合并，用最终制剂缓冲液调整至目标浓度，无菌过滤，并装入在其填充套件中的容器中的无菌的Daikyo Crystal2ml小瓶(West Pharmaceutical Services，Inc.)中。无菌过滤中使用的过滤器在使用后经过完整性测试的过滤器。填充后，AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG接受发布测试和质量保证(QA)审查。从细胞扩增至最终填充的整个生产过程都记录在已执行的批记录文件(BRD)中，其在分布到临床现场之前经过员和QA技术审查。
a.细胞接种
将合格的HEK293细胞系用于生产过程。从充分表征的MCB生产工作细胞库(WCB)。用于载体生产的细胞培养物从单个解冻的WCB小瓶开始，并根据Master Batch RecordDocument(MBR)进行扩增。使用Corning T-烧瓶和CS-10将细胞扩增至5x 109至5x 1010个细胞，其允许产生足够的细胞质量用于接种多达45 Hyperstack-36(HS-36)用于每批BDS的载体生产。将细胞培养在由Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)组成的培养基中，所述培养基补充有10％γ辐射的源自US的胎牛血清(FBS)。细胞依赖于锚定，并且使用TrypLETMSelect(无动物产物的细胞解离试剂)完成细胞解离。使用无菌的一次性生物过程袋和管套完成细胞接种。将细胞维持在37℃(±2℃)、5％(±0.5％)CO2气氛中。
b.瞬时转染
在生长(DMEM培养基+10％FBS)约3天后，将HS-36细胞培养基替换为新鲜的无血清DMEM培养基，并使用基于优化的聚乙烯亚胺(PEI)的转染方法用3种生产质粒转染。生产过程中使用的所有质粒均在CMO质量体系和基础设施的背景下生产，并利用控制来确保可追溯性、文档控制和材料隔离。在BSC中制备足够的质粒DNA转染复合物以转染50HS-36(每批BDS)。最初，制备含有0.1∶1∶2比率的顺式(载体基因组)质粒、反式(衣壳基因)质粒和辅助(Ad)质粒以及GMP级PEI(PEIPro，PolyPlus Transfection SA)的DNA/PEI混合物。在小规模优化研究中确定了该质粒比率对于AAV生产是最佳的。充分混合后，将溶液在室温下静置25分钟，然后添加到无血清培养基中以淬灭反应，最后添加到HS-36中。将转染混合物在HS-36的所有36层之间平衡，并将细胞在37℃(±2℃)、5％(±0.5％)CO2气氛中孵育5天。
c.细胞培养基收获
使用一次性生物过程袋通过无菌方式从单元中排出培养基来从每个HS-36收获转染的细胞和培养基。在收获培养基后，向～200升体积补充MgCl2至终浓度为2mM(Benzonase的辅因子)，并添加Benzonase核酸酶(Cat#：1.016797.0001，Merck Group)至终浓度为25单位/mL。将产物(在一次性生物过程袋中)在37℃下在培养箱中孵育2小时，以提供足够的时间酶促消化由于转染过程而存在于收获物中的残留细胞和质粒DNA。执行该步骤以使最终载体中残留DNA的量最小化。孵育后，添加NaCl至终浓度为500mM，以帮助在过滤和下游切向流过滤期间回收产物。
d.澄清化
使用深度过滤器胶囊(depth filter capsule)(1.2/0.22μm)将细胞和细胞碎片从产品中除去，所述深度过滤器胶囊串联连接为由蠕动泵驱动的无菌封闭管和袋组。澄清化确保了下游过滤器和色谱柱免受污染，并且生物负载减少过滤确保了在过滤器序列结束时，在下游纯化之前除去在上游生产过程中可能引入的任何生物负载。将收获材料通过Sartorius Sartoguard PES胶囊过滤器(1.2/0.22μm)(Sartorius Stedim BiotechInc.)。
e.大规模切向流过滤
使用定制的无菌、封闭的生物处理管、袋和膜组通过切向流过滤(TFF)实现澄清产品的体积减少(10倍)。TFF的原理是在与适当孔隙率(100kDa)的膜平行的压力下流动溶液。压差驱动较小尺寸的分子通过膜并有效地进入废物流，而保留大于膜孔的分子。通过使溶液再循环，平行流清扫膜表面，防止膜孔结垢。通过选择合适的膜孔径和表面积，可以快速减少液体样品的体积，同时保留和浓缩期望的分子。TFF应用中的渗滤包括以与液体通过膜和废物流相同的速率向再循环样品中添加新鲜缓冲液。随着渗滤体积的增加，从再循环样品中除去增加量的小分子。这导致澄清产物的适度纯化，但也实现与随后的亲和柱色谱步骤相容的缓冲液交换。因此，利用100kDa的PES膜进行浓缩，然后用最少4倍体积的由20mMTris pH7.5和400mM NaCl组成的缓冲液渗滤。将渗滤的产物在4℃下储存过夜，然后用1.2/0.22μm深度过滤器胶囊进一步澄清化，以除去任何沉淀的物质。
f.亲和色谱
将渗滤产物施加到有效捕获AAVhu68血清型的Poros TM Capture SelectTM AAV9亲和树脂(Life Technologies)。在这些离子条件下，显著百分比的残留细胞DNA和蛋白质流过柱，而AAV颗粒被有效捕获。在施加后，用5体积的低盐Benzonase溶液(2500单位/mLBenzonase，20mM Tris pH 7.5和40mM NaCl，1.5mM MgCl2)处理柱，以除去任何残余的宿主细胞和质粒核酸。洗涤柱以除去额外的进料杂质，然后进行低pH分步洗脱(400mM NaCl，20mM柠檬酸钠，pH2.5)，将其通过收集到1/10体积的中和缓冲液(200mM Bis Tris丙烷，pH10.2)中立即中和。
g.阴离子交换色谱
为了实现过程中杂质(包括空AAV颗粒)的进一步减少，将Poros-AAVhu68洗脱合并物(pool)稀释50倍(20mM Bis Tris丙烷，0.001％Pluronic F68，pH 10.2)以降低离子强度并能够与CIMultusTM QA monolith matrix(BIA Separations)结合。在低盐洗涤后，使用60柱体积(CV)的NaCl线性盐梯度(10-180mM NaCl)洗脱载体产物。该低盐梯度有效地将不含载体基因组的衣壳颗粒(空颗粒)与含有载体基因组的颗粒(完整颗粒)分离，并得到富含完整衣壳的制备物。将级分收集到含有1/100体积的0.1％pluronic F68和1/27体积的Bis-Tris pH6.3的无菌聚丙烯管中，以分别使与管的非特异性结合和暴露于高pH的长度最小化。将合并的完整颗粒峰级分在20mM Bis-Tris丙烷、0.001％PluronicF68(pH 10.2)中稀释20倍，并重新施加到已经原位清洗的相同柱上。重新施加10-180mM NaCl盐梯度并收集适当的完整颗粒峰级分。评估峰面积并与先前的数据进行比较以确定近似的载体产量。
h.最终制剂缓冲液(FFB)和生物负荷减少过滤以产生BDS
具有200mM总盐浓度、0.001％(w/v)pluronic F68和5％甘油)的PBS并且浓缩以产生产生期望目标(即4.5-5.5x 1013 GC/ml)的BDS中间体。将样品取出用于BDS中间体测试。将BDS中间体无菌过滤(0.22μm)，储存在无菌聚丙烯管中，并在隔离位置在≤-60℃下冷冻，直至释放用于最终填充。
i.最终填充
具有200mM总盐浓度、0.001％(w/v)pluronic F68和5％甘油的PBS。然后将产品通过0.22μm过滤器进行最终过滤，并装入灭菌的Daikyo Crystal2ml小瓶(WestPharmaceutical Services，Inc.)且带有压接密封塞的塞子，每小瓶的填充量≥0.5mL至≤1.0mL。将小瓶单独标记。将标记的小瓶储存在≤-60℃。一些剂量在施用前需要在FFB中稀释。给药时，稀释由药房在临床部位进行。
j.生物相容性
可能在剂量水平上产生差异的问题是在载体存储和患者施用过程中通过与塑料和其他固体表面结合而使AAV载体丢失。在这方面，将临床上合适的表面活性剂PluronicF68添加到AAV载体的最终制剂缓冲液中，并预期将这种类型的损失降至最低。
实施例17-AAVhu68.JAb210a介导的免疫缺陷小鼠对甲型流感的预防
评估了有效预防缺乏功能性免疫***的小鼠的潜力。使用缺少成熟的T细胞或B细胞的Rag KO小鼠(RagltmlMom，Jax 002216。Rag KO雌性小鼠(6-8周龄)IN接受1010GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG，其在PBS中稀释至作为三个17μl的等份试样递送的51μl总体积。7天后，用5LD50的PR8攻击小鼠。图20是显示在施用载体后7天攻击的Rag KO小鼠的体重的百分比变化(％)的线图。将小鼠每天称重，如x轴所示。基于感染流感攻击当天的体重计算体重减轻百分比。对任何表现出痛苦迹象或体重减轻≥30％的小鼠实施安乐死。所有接受AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG的Rag KO小鼠均在PR8攻击中存活。
对在攻击中存活的Rag KO小鼠随后进行乙型流感第二次攻击。由于Rag KO小鼠缺乏功能性免疫***，因此该实验用于解决先前感染对预防随后的流感攻击的效力的影响。对照Rag KO小鼠接受在PBS中稀释至51μl总体积并且作为三个17μl的等份试样递送的1010GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG，以确认在没有先前感染的情况下预防乙型流感的效力。七天后，将包括未处理的小鼠和存活者的载体处理小鼠(先前在图20中提出)的小鼠组用5LD50的B/Lee/40进行攻击(图21A和21B)。
图21A是显示用5LD50 B/Lee/40攻击的Rag KO小鼠的重量百分比变化(％)的线图。对小鼠每天称重，如x轴所示。基于感染流感攻击当天的体重计算体重减轻百分比。对任何表现出痛苦迹象或体重减轻≥30％的小鼠实施安乐死。在攻击后42天处死存活的小鼠。图21B显示了在B/Lee/40攻击后的存活百分比。在没有先前流感感染的情况下接受AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体的小鼠在5LD50的B/Lee/40攻击下存活下来。然而，对先前暴露于PR8攻击的小鼠组的存活有影响。我们观察到给予AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体并用PR8攻击的Rag KO小鼠的存活率为80％。
实施例18-AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG的毒性和耐受性；恒河猴中AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG的非临床药理/毒性和生物分布研究
A.概述
对于此非临床药理学/毒理学研究，恒河猴接受经鼻递送的两种剂量之一的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG或仅用作对照的媒介物(FFB)。将载体在无菌的1xDPBS+0.001％Pluronic F-68中稀释。用于I期临床试验的临床载体制剂是具有200mM的最终盐浓度、0.001％(w/v)pluronic F68和5％甘油的PBS。施用载体后，每天监测非人灵长类动物(NHP)的一般观察结果。每两周监测NHP的综合临床病理学(具有差异的细胞计数、临床化学和凝血组)，并每月监测对基因转移载体的免疫反应[通过IFN-γELISPOT测定评估针对AAVhu68衣壳的中和抗体(NAb)和针对衣壳和转基因两者的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)响应]。
在载体施用后第28天和第90天完成该研究的生命阶段后，对恒河猴进行尸检，并收获组织进行全面的组织病理学检查。从鼻、气管和肺部样品中提取DNA和RNA，分别通过qPCR和RT-PCR进行基因组拷贝和转基因表达分析。还评估了鼻灌洗液和血清中的JAb210a表达。尸检时，从肺、脾和骨髓中收集淋巴细胞以检查这些器官中CTL的存在。
B.载体
如实施例16中所述制造测试制品AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG。将最终产物在FFB中稀释。载体在生产后储存在＜-60℃下直至给药当天。在给药当天进行载体制备。制备和稀释均经过验证。将稀释的载体保存在湿冰上或2-8℃下直到给药多达6个小时。对照动物施用不含载体的媒介物缓冲液(对照制品)。这用作本研究的媒介物对照。对照制品在接收后保存室温直至给药当天。给药后，将剩余的载体制剂和对照制品保留并在＜-60℃下冷冻。
按照SOP 7410，使用MAD NasalTM(MAD NasalTM)装置(Teleflex，Inc)将AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG载体非侵入性地递送至每个鼻孔。MAD NasalTM将经批准的药物雾化成可以IN施用的细雾。使用通过鼻气道的直接液体滴注进行其他物种(例如小鼠)中的类似研究。然而，通过液体递送的小鼠鼻气道的基因表达与使用临床装置MAD NasalTM递送载体的高等物种的基因表达不相等。此外，NHP中的某些毒理学和免疫应答非常接近人。
表3：恒河猴和人的鼻表面积和给药体积的比较
*Handbook of Toxicology，第三版，Michael J.Derelanko，Carol S.Auletta编辑。
人鼻的表面积(0.0181m2)为恒河猴鼻的表面积(0.00616m2)的约2.94倍(表3)。因此，建议递送到NHP鼻中的体积为0.80mL(在人鼻中递送的载体体积)÷2.94＝0.272mL。提议用于人的最高临床剂量是5x1013GC。当根据恒河猴的鼻表面积将该剂量外推时，用于恒河猴的类似剂量为5x1013GC÷2.94＝1.7x1013GC。为了提高在恒河猴鼻中递送小体积时的准确性，将体积增加到0.28mL，以允许提高每个鼻孔递送两个70μL的等份试样而不是68μL的准确性；两个鼻孔都治疗。
C.动物
在这项研究中使用了7只雄性和7只雌性恒河猴(3-6岁，3-10kg)，并检查了AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG的两种不同剂量。一组NHP(组1)接受总体积为0.28mL(以四个70μL的等份试样给予)1.7x1013GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG，当基于人鼻的表面积(表3)外推时，其代表了临床试验的最高载体剂量。另一组NHP(组2)接受以总体积为0.56mL(以八个0.07mL的等份试样给予)给予的4.25x1013GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG。当基于NHP鼻的表面积外推时，该剂量为临床试验的最高载体剂量的2.5倍。
使用MAD nasal经IN施用载体。载体作为在左鼻孔和右鼻孔两者中给予的0.07mL的等份试样递送；对于1.7x1013GC剂量，在5分钟内每个鼻孔递送两个等份试样，对于4.25x1013GC剂量，在5分钟内每个鼻孔递送四个等份试样。选择通过鼻道的IN途径是因为它是靶向鼻(疾病靶标的临床部位)的最有效途径。
通过在线程序Research Randomizer(www.randomizer.org/form.htm)将每种性别的NHP随机分配到三个队列之一中。在载体给药之前，从至少三个时间点采集血液，然后将其发送至Antech GLP，以进行细胞计数以及差异和临床化学分析。在研究开始前至少两次测定NAB效价，并分离PBMC以提供对载体衣壳和转基因的细胞免疫应答的基线水平。所有基线评估均在研究开始前的一个月内进行。
研究室保持在相对于走廊正向气流的条件下。独立地为室提供每小时至少10次换气，其中100％新鲜空气通过过滤器。将动物饲养室保持在64-79°F(18-26℃)的温度范围和30-70％的湿度范围下。根据SOP 8026，通过Edstrom Watchdog System监测温度、湿度和空气变化。
将动物在ABSL-2条件下单独饲养在不锈钢笼中，所述笼分别具有4.3-6.0平方英尺的占地面积和30-32英寸的高度。所有笼的尺寸和饲养条件均符合实验动物的护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)以及根据SOP7707和7710。饲养室和笼始终在所有时间处于锁定状态，并且只有授权人员才能进入。在载体施用之前，将动物在IACUC批准的豁免下单独饲养，以防止血清转化(产生AAV载体衣壳特异性NAB)。根据SOP7709，从载体施用后两周开始动物可以成对饲养。根据SOP 7701，通过人和同种交互(conspecific interaction)(即听觉和视觉刺激)、食物奖励和个人操作性特征(manipulanda)提供动物的行为、情感和社会需求。个人操作性特征每两周进行一次清洁和轮换。通过钥匙和徽章访问来控制进入设施。维持12小时光：12小时黑暗的自动控制的光循环，并且通过建立自动化***进行控制，并且通过Edstrom Watchdog System监测。黑暗期始于1900小时(±30分钟)。根据SOP 7710和7711，笼每天清洁，并且每两周更换和消毒。每两周并且必要时经常使用笼清洁设施对笼和架子进行消毒，以防止灰尘、碎屑、废物、粪便的过多积聚或疾病危害。根据SOP 7710，用PMI Feeds Inc.，Brentwood，MO的CertifiedPrimate Diet 5048随意饲喂动物。由饲料供应商常规进行分析。通过自动供水***随意提供水。供水来自City of Philadelphia，并经反渗透过滤。将经处理的水每年进行两次可能化学污染物的分析(Lancaster Laboratories，Lancaster，PA)并且每季度进行细菌污染物的分析(QC Laboratories，Southampton，PA)。在整个研究过程中，将经过认证的浓缩设备添加到每只研究动物的笼中。污染分析由制造商进行，并且分析数据可获得。每天提供丰富的水果、蔬菜、坚果和谷类食品。每天提供个人操作性特征，例如孔眼(kong)、镜子、拼图喂食器和葡萄干球。动物还每天接受丰富的视觉和人交互。根据SOP7408，对恒河猴进行麻醉。
根据SOP 7408，对恒河猴进行麻醉。如下将载体以0.28mL至0.56mL的体积施用到鼻内。使用MAD nasal递送AAV载体。载体作为每个鼻孔中0.07mL的等份试样递送。对于1.7x1013GC剂量，在5分钟内每个鼻孔中递送两个等份试样。对于4.25x1013GC，每个鼻孔中递送四个等份试样。施用载体后，每天监测动物以进行一般观察。根据SOP 7404记录所有观察结果。
通过每日目视观察监测动物的总体外观、毒性迹象、痛苦和行为变化。在每次麻醉用于抽血时对所有动物进行身体检查。尸检时，检查动物的总体异常情况。
D.研究方案
表4研究方案
红顶(Red Top，RC)：无抗凝剂；薰衣草顶(Lavender Top，LT)：EDTA钾；绿顶(GreenTop，GT)：肝素；蓝顶(Blue Top，BT)：柠檬酸钠。
*恒河猴在这里用连续字母表示。
使用MAD NasalTM经IN施用载体。载体作为左鼻孔和右鼻孔两者中给予的70μL等份试样递送；对于1.7x1013GC剂量，在5分钟内每个鼻孔递送两个等份试样，对于4.25x1013GC剂量，在5分钟内每个鼻孔递送四个等份试样。本研究选择1.7x1013GC和4.25x1013GC的剂量。临床试验的受试者中施用的最高剂量是在0.80mL PBS中的5x1013GC，其使用MADNasalTM以0.20mL等份试样给予。组1(1.7x1013GC)和组2(4.25x1013GC)选择的剂量分别反映了临床试验计划的最高剂量5x1013GC，和为临床试验计划的最高剂量的2.5倍的剂量。
每个载体治疗组包括六只动物，是雄性和雌性恒河猴的混合。对照组包括两只动物，并在第28天处死。研究在恒河猴的鼻气道中进行，旨在评估AAV9(一种非常类似于AAVhu68的血清型)的表达谱。利用包括恒河猴AFP(rhAFP)在内的多种转基因，当将AAV直接适用于鼻时，建立NHP的鼻灌洗液中表达动力学的时间表。早在载体递送后的第14天就检测到转基因表达，并在第14-28天达到峰值。转基因表达然后稳定并在第56和84天之间开始减弱。选择本文描述的本研究中选择的时间点以捕获基因表达的峰值(第28天)并且还超过载体表达的峰值(第90天)。这些时间点允许在早期(第28天)和长期随着基因表达减弱(第90天)时收集有关载体安全性和毒性的重要信息。
在研究的第0天，使用MAD NasalTM以0.28mL总体积(四个70μL的等份试样)中的1.7x1013GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG或者0.56mL总体积(八个70μL的等份试样)中的4.25x 1013GC的AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG向恒河猴给药。
根据SOP对所有动物进行每日生存能力检查。根据SOP在所有时间点监测并记录体重、温度、呼吸频率和心率。根据SOP 7408和7411，将NHP进麻醉并收集血液。收集的血液用于CBC、临床化学和凝血组检查。通过Antech GLP进行临床病理学、临床化学和凝血组。分析动物的血液化学和血液特性的变化。在指定的时间点，对动物样品进行化学、具有差异的全血细胞计数(CBC)和血小板计数评估。根据SOP 7408对动物进行麻醉。可将儿科Foley导管放置在其中一个鼻孔中，一旦放置到位，则将气球充气，然后将导管向回拉，直到达到阻力为止。将恒河猴的头/身体向各自的侧倾斜，然后使用最多5mL的PBS(每个鼻孔)冲洗鼻腔；液体以液滴形式收集在位于相应鼻孔正下方的Falcon管中。在该过程结束时，将导管取出并丢弃，并对相邻的鼻孔重复该过程。分离血清并将其等分到标记的微量离心管中。根据SOP，使用NAB测定法对来自指定时间点的血清进行体液免疫应答检查。根据SOP6003，分离PBMC并冷冻保存。根据SOP 6002，通过IFN-γELISPOT分析对AAVhu68和JAb210a的T细胞应答，其中阳性应答标准为点形成单位(spot forming unit，SFU)/106细胞＞55，以及中等阴性对照值(无刺激)的x3。根据SOP进行血清NAB分析，根据SOP 6002进行IFN-γ ELISPOT，并且根据SOP通过TaqMan qPCR进行AAV载体脱落。根据SOP 7428，在指定的时间点收集尿液和粪便样品，在干冰上冷冻并保存在≤-60℃。根据SOP 3001提取DNA并进行TaqMan qPCR反应，但是基于样品可能必须对方案进行修改。
在计划的验尸时间点(给药后第28天和第90天)，根据SOP7422和7600对NHP实施安乐死。根据SOP 7422，通过无心跳和呼吸来确认死亡。根据SOP 7600对动物进行尸检并且收获用于全病理学的组织。还收获用于生物分布的组织，并保存在≤-60℃下。
收集的用于生物分布和组织学的组织包括心血管***：心脏、主动脉(胸腔和腹部)；消化***：肝(尾状叶(caudate)、左叶、中叶和右叶)、胆囊、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、胰腺；内分泌***：垂体腺、甲状腺左叶和右叶、甲状旁腺、肾上腺(左和右)；造血***：脾脏、胸腺、***(腹股沟，左和右)、***(肠系膜)、***(腋，左和右)、骨髓(肋骨)、淋巴集结(从肠段收集)；肌肉骨骼***：骨骼肌(四头肌)；呼吸***：鼻旁窦、筛状板、鼻中隔、咽、喉、气管、肺(4叶)；神经***：脑(包括大脑[额和枕]叶)、中脑、视神经(左和右)、视交叉、小脑、髓质/桥、眼睛(左和右，收集在用改良的戴维森固定剂中)；脊髓(颈部、胸部、腰部)、坐骨神经(左和右)；生殖***(雄性)：睾丸(左和右，收集在改良的戴维森固定剂中)、附睾(左和右)、***；生殖***(雌性)：卵巢(左和右)、子宫、乳腺(左和右)；泌尿***：肾(左和右)、膀胱；和其他：胸部纹身、皮肤、肉眼观察(在尸检时对不适合收集组织病理学的部位(例如，体液、空气(matter air)、缺失解剖部位))。
所有组织固定在10％NBF或改良的戴维森固定剂中，并根据SOP4003、4004、4006和4007进行处理。尸检过程中观察到的任何肉眼可见病灶均收集并保存在10％NBF中。通过遵循各自的SOP进行组织处理、组织病理学评估、T细胞应答和RNA制备。评价组织病理学切片。
在尸检时，分别根据SOP6004、6005和6006收集肺、肝、脾和骨髓并从每个组织中分离淋巴细胞。根据SOP 6002，通过IFN-γELISPOT分析对AAVhu68和JAb210a的T细胞应答，其中阳性应答标准为点形成单位(SFU)/106细胞＞55，以及中等阴性对照值(无刺激)的x3。尸检时，收集组织用于生物分布，在干冰上冷冻，并保存在≤-60℃下。如果需要，根据SOP3001从组织中提取DNA并进行TaqMan qPCR反应。此外，在尸检时，收集组织用于RNA表达，在干冰上冷冻并保存在≤-60℃下。从100mg的鼻、气管和肺各叶的多个区域中分离DNA酶处理的总RNA。通过分光光度法对RNA进行定量，并使用随机引物将等份试样逆转录为cDNA。通过qPCR检测载体特异性序列(跨转基因和poly A信号的区域)来定量包含载体来源信息的cDNA。
对血液化学值进行统计学分析。通过对从载体给药前的研究动物收集的所有值(最少两个基线)取平均值并计算标准偏差(SD)来产生野生型恒河猴的正常值的范围。该范围表示为平均值±SD。平均值的两个SD之外的值被认为是极值。
确定以下临床化学参数：白蛋白、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、淀粉酶、胆红素(直接)、胆红素(总)、钙、氯化物、胆固醇、肌酸磷酸激酶(CPK)、肌酐、γ谷氨酰转移酶(GGT)、葡萄糖、乳酸脱氢酶(LD)、脂肪酶、镁、磷、钾、钠、甘油三酸酯、总蛋白质和尿素氮。
收集用于CBC和血小板计数的血液，并保存在2-8℃下，直到通宵运送至AntechGLP。确定以下血液学参数：全血细胞计数、平均血小板体积(稳定8小时)、红细胞计数、红细胞分布宽度、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数、白细胞计数、白细胞差异和RBC形态。
实施例19-临床开发-用于递送抗Flu抗体的AAV载体的安全性和耐受性
A.概述
目前正在研究1期临床试验，以确定AAV2/hu68表达的转基因的适当剂量，以用于随后的2期效力评估。临床开发从1期剂量递增试验开始，该试验评估递送JAB210a MDAb的AAV2/hu68载体的单次施用，并扩展至最佳剂量下的安全性评估。如果载体在最初的1期试验中具有可接受的安全性和PK谱，则随后的2期开发可能包括在受控的流感攻击模型中评估载体的安全性、PK和初步效力。老年人群(65岁及以上)是此临床产品开发计划的目标人群。设想载体具有两个潜在作用：对付大流行的对策和传统季节性疫苗的替代品。其用作大流行对策可以是在流感大流行出现期间库存或制造活动的情况。1期试验在美国开始，并且可能在合格的CRO上扩展到第2阶段效力试验(即攻击研究)。如果在健康志愿者中证明了安全性和初步效力，则可以考虑在扩大的人群中进行后续试验以进行进一步开发。
如果1期试验证明了可接受的安全性(包括完整的6个月安全性数据和所需的临床前安全性数据)、药代动力学(PK)和初始免疫学(例如流感中和活性，转基因表达的水平和持续时间，对衣壳和转基因的免疫应答)概况，则进行2期试验。剂量选自1期试验，并在受控的流感攻击模型中进行测试。2期试验的目标是评估初步效力并确定载体的有效剂量。
如实施例16中所述制造载体。将载体配制为包含在具有200mM的总盐浓度、0.001％(w/v)pluronic F68和5％甘油的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液(最终制剂缓冲液，FFB)。将AAVhu68.CB7.CI.JAb210a.rBG在FFB中稀释后以四个剂量水平鼻内施用。初始剂量水平是根据临床前效力数据选择的，并根据非临床安全性评估进行优化，其最高剂量受没有AAV载体颗粒聚集时可以达到的浓度限制。剂量范围为6.25x1012基因组拷贝(GC)至5x1013GC，通过Teleflex Medic al(MAD300)(MAD NasalTM)经由商业认可的LMA鼻内粘膜雾化装置(IMAD)以每鼻孔两个0.2ml的等份试样施用，每个受试者的总递送体积为0.8ml。目标将是实现5-20ng/ml浓度的JAb210a MDAb，如在载体施用后两周的鼻灌洗液中测量的。在第0天时，施用在四个剂量队列(6.25x1012GC、1.25x1013GC、2.5x1013GC或5x1013GC)之一的单剂量载体。直至研究第180天(±2)，对每个给药方案的受试者的安全性和免疫原性参数进行监测。
B.目标
主要目标是基于CBC、化学物质、尿液分析、仅限于鼻的局部免疫应答和临床发现，通过不良事件的出现来评估载体在老年受试者中的安全性和耐受性。不良事件的分级是根据FDA于2007年9月发布的纳入预防性疫苗临床试验的健康成人和青少年志愿者的不良反应分级标准(Toxicity Grading Scale for Healthy Adult and Adolescent VolunteersEnrolled in Preventative Vaccine Clinical Trials)。
次要目标是评估鼻洗液和血清中流感病毒中和活性的水平和持续时间，例如，基于抗独特型ELISA和基于抗HA ELISA的测定；以评估鼻洗液和血清中JAb210a MDAb表达的水平和持续时间；评估针对转基因和衣壳的中和抗体的水平；评估针对转基因、JAb210aMDAb和衣壳的细胞应答水平，如通过IFNγ ELISPOT测定和鼻、咽、尿、直肠和血液样品中的载体脱落测量的。
C.研究设计
为了评估初步的安全性和耐受性，了解载体在健康志愿者中的药代动力学，以及选择用于进一步开发的剂量水平，进行了利用基于临床前数据的剂量水平的开放标签剂量递增试验。该研究最多招募五个队列，每个队列四位受试者。在治疗前4-12周对受试者进行筛选，并随访6个月。
健康志愿者用载体经IN治疗。研究目标是评估安全性和耐受性，了解载体的药代动力学，以及选择用于进一步开发的最佳剂量。
使用单一递增载体剂量并在剂量递增前对每个剂量组进行正式安全性评估的开放标签试验。四个队列，每个队列四位受试者，针对定义为在鼻灌洗液中产生5-20ng/ml的MDAb的最佳剂量的适应性扩展至八位。
a.施用
通过使用批准的MAD NasalTM向将每个鼻孔0.2ml连续两次施加到每个鼻孔中，使每位志愿者IN接受0.8ml剂量的载体。五个队列中进入最多24名志愿者。队列1-4接受不断提高水平的载体，最后队列(队列5)扩大至最佳剂量水平(由队列1-4中的安全性和药代动力学参数定义)下的8名志愿者。
在第0天使用MAD NasalTM施用载体。
队列1：剂量为6.25x1012GC；
队列2：剂量为1.25x1013GC；
队列3：剂量为2.50x1013GC；
队列4：剂量5.00x1013GC；
队列5：最佳剂量水平下的扩大的队列。
在队列中受试者的给药之间需要观察一周。队列之间总共四周用于在递增至下一剂量之前评估安全性数据。
在载体施用的前一晚，将受试者送入研究住院部。在早晨，获得空腹血液，然后对受试者进行IN施用。在前24小时内频繁监测生命体征。在第1、3、7、14和28天以及第2、4和6个月(代表研究结束)收集血液、鼻灌洗液、尿液和直肠拭子进行安全性测试。样品用于安全性实验室，检测载体脱落，评估转基因表达以及转基因和载体衣壳的免疫原性。
研究持续时间是载体施用后6个月(180天)。
停止规则是基于剂量限制性毒性的发生。剂量限制性毒性定义为在队列内出现任何一种治疗相关的4级或任何两种3级治疗相关的不良事件。在做出有关剂量递增、队列扩大或停止的任何决定之前，应仔细检查所有不良事件。
表5
b.目标人群，纳入/排除标准
诊断和主要纳入标准为65岁及以上的健康男性或女性受试者，体重指数≥19至≤30kg/m2，体重≥50至≤100kg。如果有生育潜能的女性在研究进入之前具有阴性前血清妊娠测试并且其使用有效的避孕方法(荷尔蒙，宫内节育器)，则有资格进入。
纳入标准为：65岁及以上的男性或女性受试者；能够给予参加的书面知情同意；健康，如通过根据病史、体格检查、生命体征和基线时的临床安全实验室检查确定的；非习惯性吸烟者(习惯性吸烟者是每周抽超过4支香烟或其他烟草制品的人)，并同意在参与期间不使用烟草制品；女性应符合以下标准之一：绝经后至少一年或手术不育。
排除标准为：季节性枯草热或季节性过敏性鼻炎或常年性过敏性鼻炎或慢性或鼻或鼻窦疾病的重要病史；在施用载体之前需要治疗长达一年的哮喘病史；具有异常鼻结构的受试者，包括中隔偏斜和鼻息肉、慢性鼻窦炎、哮喘或COPD；正在使用鼻内类固醇；由研究者评估存在重大的不受控制的医学或精神疾病(急性或慢性)(这包括但不限于对于在筛选的3个月内的并且在第0天进行攻击之前再次确认的不受控制的症状或药物毒性建立新的医学或外科治疗或重大剂量改变)；HIV-1或HIV-2或HBsAg或HCV抗体的阳性血清学；3年内的癌症或癌症治疗，不包括基底细胞癌或鳞状细胞癌，其是允许的；存在免疫抑制或可能与免疫应答性受损有关的任何医学疾病，包括但不限于糖尿病；在最近的3个月内，目前正在接受(或具有接受历史)可能不利地影响免疫***的任何药物或其他治疗，例如过敏注射、免疫球蛋白、干扰素、免疫调节剂、细胞毒性药物或已知经常与重要的主要器官毒性有关的其他药物，或全身性皮质类固醇(口服或注射)(允许局部皮质类固醇)；研究前一年的药物或化学滥用史；在施用载体之前30天内接受任何研究产品或未注册药物，或者目前登记在任何研究性药物研究中或在接下来的研究期内打算参加这样的研究；在载体施用前6个月接受血液或血液制品或者在研究期间计划施用；施用载体前72小时内的急性疾病，定义为存在中度或重度具有或没有发烧的疾病(由研究者通过病史和体格检查确定)，或经口发烧＞38℃；怀孕和/或哺乳期女性；AAV2/hu68的血清循环中和抗体＞1∶80；根据研究者的意见，任何可能干扰主要研究目标和评估的病症。
c.剂量水平确定
基于临床前效力数据选择初始剂量水平，并且基于临床安全性评估进行了优化，最高剂量受AAV聚集特性的限制。剂量范围为6.25x1012至5x1013GC/剂量，通过MAD NasalTM以每个鼻孔2x 0.2ml施用。目标是在施用载体后两周的鼻洗液中具有5-20ng/ml的JAb210aMDAb的目标。当调整总体重后，这些剂量大幅低于给予猴、小鼠和雪貂的剂量。在与临床试验的载体在结构上类似的载体或AAV载体的形式的任何剂量下，在这些物种中进行的任何非临床研究中未观察到实质性毒性。
d.剂量施用和持续时间
每个剂量组通过MAD NasalTM接受每个鼻孔0.4ml的载体。受试者依次给药。同一剂量组内的治疗间隔将由非临床研究确定(例如1周)。一旦一个队列中的所有受试者均通过研究第14天，则评估初步安全性数据。如果未发现安全问题，则开始将剂量递增至下一剂量。在完成队列4并证明了最高剂量的初步安全性后，则进入第五和最后的队列，用于在最佳剂量下扩大至总共8位受试者(即，另外4位受试者)，最佳剂量为最大耐受剂量或可以施用的最高剂量。最大受试者数目为24。
e.提出的临床研究的持续时间
在第-12至-4周的访问0(筛选)期间，进行了知情同意书/HIPAA、人口统计学评估/病史以及纳入/排除筛选。
在访问时，包括在第-12到-4周的访问0(筛选)、第-4至-1周的访问1(筛选)、第0天的访问2、第7天的访问3、第14天的访问4、第28天的访问5、第2个月的访问6、第4个月访问7、和第6个月的访问8时，检查药物史和安全性实验室(包括：全面代谢组[钠、钾、氯、二氧化碳、葡萄糖、血尿素氮、乳酸脱氢酶、肌酐、肌酐磷酸激酶、钙、总蛋白、白蛋白、AST、ALT、碱性磷酸酶和总胆红素]；CBC[白细胞计数、血红蛋白、血细胞比容、血小板计数、红细胞分布宽度、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白和平均红细胞血红蛋白浓度]；尿液分析[尿液颜色、浊度、pH、葡萄糖、胆红素、酮、血液、蛋白质、白细胞]；凝血[PT、INR、PTT]；血清学检查(HIVAb、HBsAg、HepCAb、RPR))。
尿液妊娠测试(仅适用于有生育能力的女性)，避孕咨询，心电图(基于最近的FDA指南对每次访问的QT和QTC的变化进行分析)和肺功能测试(呼吸量测定(包括肺活量，用力肺活量，以0.5、1、2和3秒时间间隔进行的用力呼气量(forced expiratory volume，FEV)，用力呼气流量25-75％(forced expiratory flow 25-75％，FEF 25-27)和最大自主通气量(maximal voluntary ventilation，MVV))，体格检查(体重、身高(仅在访问1测量)、BMI)，胸部x射线(如果在筛选的3个月内进行并且发现是正常的，并且受试者没有持续出现肺部体征或症状，则不必重复胸部x射线)，生命体征(输注日的生命体征：输注前，给药后15(±5)、30(±5)分钟和1(±10分钟)、3(±10分钟)和6小时(±10分钟)，包括血压、心率、温度、呼吸)，研究血液(对于衣壳和转基因的T细胞应答)，研究鼻洗液(通过基于细胞的中和测定得到的Ab水平)，研究血清(针对衣壳和转基因的NAB，Ab水平)，峰值鼻呼气流量(使用便携式吸气流量仪表进行。在呼气后，将附接小口罩的仪表水平放置以在鼻部周围形成气密密封。然后指示受试者用力并剧烈吸气(约1秒钟)。每次测试完成后，通过指针在校准刻度上的位置记录流量)和SNOT-22问卷(22分问卷，向患者询问一系列健康和生活质量问题，并让他们对其症状从0(无症状)到5(尽可能严重)评分。得分是所有选择的数字的总和(最高110)。在第-4到-1周的访问1(筛选)、在第0天的访问2、在第7天的访问3、在第14天的访问4、在第28天的访问5、在第2个月的访问6、第4个月的访问7和第6个月的访问8，还允许患者标记最多5个对他们最重要的问题/关注点)。
在第0天的访问2进行载体施用和24小时住宿的接纳。
在第0天的访问2、第7天的访问3、第14天的访问4、第28天的访问5、第2个月的访问6、第4个月的访问7和第6个月的访问8，监测不良事件。
在第0天的访问2、第7天的访问3、第14天的访问4和第28天的访问5，进行局部和全身反应原性评估。
f.观察与测量方法
主要目标是单次递增剂量的载体溶液的安全性和耐受，如通过从基线开始至治疗后六个月的不良事件的发生以及实验室参数和生命体征的变化所定义的。安全性评估还包括在施用载体溶液后的14天的急性时期鼻粘膜和肺的反应原性评估。
次要目标是评估PK，包括鼻洗液中转基因浓度、血清浓度、最大浓度、清除率、消除半衰期；通过测量抗体对IP的所有组分(包括AAV2/hu68衣壳、JAb210a MDAb)的抗体结合和T细胞应答评估单次递增剂量的免疫原性。
评价包括血液化学(肝功能检查[LFT]、肌酐)，血液学(具有差异的全血细胞计数[CBC]、血小板、凝血酶原时间/部分凝血活酶时间(prothrombin time/partialthromboplastin time，PT/PTT)、肌酐磷酸激酶(CPK)、肌钙蛋白和尿液分析，在整个试验过程中对以上进行评估并且在施用载体溶液后在急性/亚急性期进行更频繁的监测。在整个试验过程中进行血清、鼻灌洗液和PBMC采样，以监测转基因表达并评估针对转基因和AAV2/hu68衣壳的抗体和细胞应答。施用载体溶液之前，对所有女性志愿者进行尿液人绒毛膜***(HCG)测试。
在研究期间(即6个月)收集不良事件(Adverse event，AE)和严重不良事件(serious adverse event，SAE)。
在整个试验过程中定期评估药代动力学(PK)，以确定JAb210a MDAb表达的动力学。定期对鼻洗液和血清采样，并通过质谱和ELISA使用测定法测定Ab水平。
根据常规方法开发质谱、抗独特型测定、转基因表达(ELISA)、载体脱落评估。
g.载体溶液的施用
载体溶液的施用以两个连续的0.2ml剂量进入每个鼻孔(即，总共0.8ml的载体溶液)进行。使用由Teleflex Medical(Teleflex.com)制造的商业认可的装置来施周载体溶液。该装置称为LMA MAD NasalTM(鼻内粘膜雾化装置)。该公司的程序指南中提供了有关如何最好地使用该装置以IP递送到鼻粘膜的详细信息。基本上，将受试者放置在卧位，并将装置的尖端放置在每个鼻腔通道孔口处(一次一个)，然后通过通过注射器将流体推入雾化器来递送载体溶液。
h.研究设计和样本量确定
安全性是剂量递增方案所基于的主要终点。安全性监测包括临床观察和实验室测试结果，并根据FDA 2007年9月发布的纳入预防性疫苗临床试验的健康成人和青少年志愿者的不良反应分级标准进行分级。唯一的修订与评估指导文档中的临床异相关，其集中在与注射部位相关的发现中。建立了与近端和远端呼吸***临床发现相关的标准。
最大耐受剂量(MTD)定义为低于受试者表现出剂量限制性毒性(dose-limitingtoxicity，DLT)的剂量时的剂量，剂量限制性毒性定义为两名受试者中的任何治疗相关3级事件或一个治疗相关4级事件。应认识到，在提出的剂量范围内可能无法达到MTD。在这种情况下，所用的最高剂量是用于未来试验的推荐剂量。在MTD下或在未达到MTD的情况下在最高剂量下，治疗至少八名受试者。因此，可能有必要增加四名额外的受试者，以确保以推荐剂量治疗八名受试者。
设计是标准的“4+4”I期剂量递增试验，每个剂量水平4名患者，在任何水平的剂量限制性毒性(DLT)的情况下，扩展至每个水平8名患者水平，前提是在推荐剂量下扩展4名额外患者以更好地表征最佳剂量和在该水平下的毒性率。在剂量队列内的患者之间使用至少7天，并且在列队之间使用2周以确保对潜在的短期毒性进行充分评估。给药后对受试者观察6个月，尽管用于确定是否已达到MTD和/或递增至下一剂量的观察期是该队列的总体数据，在列队中的最后受试者之后包括至少14天。
如果队列中的0/4名受试者经历了3或4级毒性，则将剂量升级并且在下一更高剂量下治疗接下来的四名受试者；如果1/4名受试者经历了治疗相关的3级毒性，则以相同剂量治疗额外4名受试者。如果额外受试者中没有人经历治疗相关的3级或4级毒性(总计为1/8)，则将剂量升级并且在下一更高剂量下治疗接下来的四名受试者。如果任何额外受试者发生3级或4级毒性(总计＞1/8)，则将额外4名受试者纳入较低剂量组，如果无有害物，则将其视为MTD；如果任何受试者经历治疗相关的4级毒性，则不再将更多受试者纳入该剂量，并且将额外4名受试者纳入比发生4级毒性的剂量低的剂量队列，以确定MTD。
i.安全性和不良事件
涉及受试者或其他人的风险的无法预料的问题被定义为符合以下所有标准的任何事件、经验或结果：性质、严重性或频率未曾预料到(即未在与研究相关的文件例如IRB批准的方案或同意书形式、调查人员手册等中描述)；与参与研究有相关或可能相关(即，可能相关意味着有合理的理由认为事件、经历或结果可能是由研究所涉及的程序引起的)；以及暗示研究使受试者或其他人受到更大伤害的风险(包括身体、心理、经济或社会伤害)。
不良事件(AE)是在研究过程中出现或严重程度恶化的任何症状、体征、疾病或经历。并发疾病或受伤应视为不良事件。如果存在以下异常，则诊断程序的异常结果被认为是不良事件：导致研究撤回；与严重的不良事件相关；与临床体征或症状相关；导致额外治疗或进一步的诊断测试；被研究者认为具有临床意义的。
不良事件分为严重或非严重。严重的不良事件是以下任何不良事件：致命，危及生命，需要或延长住院时间，导致持续或严重的残疾或无能力，先天性异常或出生缺陷，重要医学事件。
重要医学事件是可能不会立即威胁生命，但显然具有重要的临床意义的事件。它们可能危害受试者，并且可能需要干预以防止上述其他严重后果之一。例如，药物过量或滥用，没有导致住院治疗的癫痫发作，或急诊科的支气管痉挛的强化治疗通常被认为是严重的。
所有不符合任何严重标准的不良事件应被视为非严重不良事件。
预先存在的病症是研究开始时存在的病症。如果在研究期间病症的频率、强度或特征恶化，则应将预先存在的病症记录为不良事件。
筛选时，任何临床上有意义的异常都应记录为预先存在的病症。在研究结束时，还必须记录符合不良事件定义的任何新的临床上有意义发现/异常，并将其记录为不良事件。
研究人员将跟踪所有未解决的不良事件，直到事件得到解决、受试者不再随访或对不良事件有了其他解释。在最后的计划的访问中，研究人员应指示每名受试者报告受试者或受试者的私人医生认为可能合理地与参与本研究相关的任何后续事件。研究人员应通知研究发起人在受试者中止或终止研究参与后的任何时间发生的可能合理地与本研究相关的任何死亡或不良事件。如果研究者应了解到参与本研究的受试者随后孕育的后代的癌症发生或先天性异常，也应通知发起人。
如果满足以下条件之一，则将临床实验室异常记录为不良事件：实验室异常不能通过重复测试反驳以确认异常；异常暗示了疾病和/或器官毒性；异常具有需要积极管理的程度；例如剂量变化、停药、更频繁的随访评估，进一步的诊断调查等。
除非另有明确指示，否则任何导致住院或延长住院的不良事件被记录并报告为严重不良事件。如果病症满足不良事件标准，则将导致手术的任何病症记录为不良事件。在以下情况下，病症、住院、延长住院或手术均未报告为不良事件：用于预先存在的病症的诊断或选择性手术程序的住院或延长住院。如果手术的目的是选择性的或诊断性的，且结果是平凡的，则不应将手术报告为不良事件的结果；需要住院或延长住院以允许本发明的效力测量。
研究者有责任确保根据以下描述符将AE记录在CRF的适当页面上：轻度：与日常活动没有限制或仅有轻微不适相关；中度：与日常活动受限或明显不适相关；严重：与无法进行日常活动或与研究药物非常明显的不适有关。
研究人员根据以下定义确定AE与研究药物的关系：
很可能(Probable)：遵循从施用载体溶液开始的合理的时间顺序，遵循对于可疑研究示踪剂的已知或预期响应模式；并且不能通过受试者/患者的临床状况的已知特征来合理地解释的反应；
可能(Possible)：遵循从施用研究示踪剂开始的合理的时间顺序，遵循对于可疑研究示踪剂的已知或预期响应模式，但是可以容易通过许多其他因素产生的反应；
不太可能(Unlikely)：不遵循从施用研究示踪剂开始的合理的时间顺序的反应。但是，不能排除来自载体溶液的因果关系。
无(None)：存在足够的数据来表明病因与研究示踪剂无关的反应。
为确保使受试者的风险最小化，将受试者在单独队列中进入到研究中，每个队列四至八名受试者。在向队列中的所有受试者施用载体溶液后，直到该队列中的最后一名受试者完成了至少2周的随访并且对整个队列进行了初步安全性评估和检查之后，才进行其他队列中受试者的给药。队列成员之间的给药以不少于1周的间隔进行。在此研究中，剂量限制性毒性(DLT)定义为队列内的至少两个3级毒性事件，或者4级事件，其中这些事件被认为是治疗相关的。如上所述，队列中的一名受试者经历3级治疗相关毒性触发在该剂量下对额外四名受试者给药，该队列中至多8名受试者。在该剂量下第二名受试者具有治疗相关3级毒性将触发剂量降低，如果需要在较低剂量下治疗额外四名受试者，以确保治疗总共8名受试者；如果在该较低剂量下没有超过两个3级毒性或没有4级毒性，则将其视为MTD。任何治疗相关的4级毒性都将停止在该剂量下累计，并且触发在较低剂量下对额外4名受试者进行累计，以帮助确定MTD。任何严重不良事件应理解报告并评估其与研究治疗药物的关系。如果SAE被认为是治疗相关的，则其可以作为研究的终止标准。
j.统计学分析
使用了多种描述性统计数据(包括图形方法)来总结效力终点。对于测量的连续变量，计算平均值、标准差、中值和范围。适当时对于对总结统计产生置信区间。尽管报告了实际的p值，但使用α＝0.05的双向显著性水平(I类误差)进行了假设检验。对于测量的连续变量，两组比较(例如剂量组之间)通常采用Wilcoxon秩和检验；Wilcoxon符号秩检验用于配对数据，例如肺功能参数相对于基线的变化。使用Fisher精确检验比较各组之间的分类变量，使用McNemar检验比较患者内的分类变量。
本说明书中列出的所有专利、专利公开和其他公开以及标记为“17-7987PCT_ST25.txt”的序列表以及优先权申请2018年1月17日提交的美国临时专利申请号62/618,443，2017年9月20日提交的美国专利申请号62/560,834，2017年5月10日提交的美国专利申请号62/504,293和2017年2月2日提交的美国专利申请号62/464,753，其通过引用并入本文。尽管已经参照特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
(序列表自由文本)
为数字标识符<223>下包含自由文本的序列提供以下信息

Claims (29)

1.一种非复制型重组腺相关相关病毒(rAAV)，其具有AAV衣壳，所述AAV衣壳具有包装在其中的载体基因组，所述载体基因组包含AAV反向末端重复序列和编码免疫球蛋白区域(a)、(b)、(c)和(d)的至少一个核酸序列，其中免疫球蛋白区域(a)、(b)、(c)和(d)中的每一个从所述rAAV表达，其中
(a)是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第一免疫球蛋白区域：(Gln Val Gln Leu ValGlu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala AlaSer Ile Ser Ile Phe Asp Ile Tyr Ala Met Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly LysGln Arg Glu Leu Val Ala Val Ser Phe Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp SerVal Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu GlnMet Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Val Ser Leu TyrArg Asp Pro Leu Gly Val Ala Gly Gly Ile Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr LeuVal Thr Val Ser Ser)；
(b)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第二免疫球蛋白区域：(Glu Val Gln Leu LeuGlu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala AlaSer Gly Arg Thr Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg GluPhe Val Ala Ala Ile Asn Ala Leu Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val LysGly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met AsnSer Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ala Gln Gly Gln Trp ArgAla Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Glu Tyr Glu Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu ValThr Val Ser Ser)；
(c)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第三免疫球蛋白区域：(Glu Val Gln Leu LeuGlu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala AlaSer Gly Phe Thr Leu Glu Asn Lys Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly LysGlu Arg Glu Gly Val Leu Cys Ile Ser Lys Ser Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ala AspSer Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr LeuGln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Thr ThrAla Gly Gly Gly Leu Cys Trp Asp Gly Thr Thr Phe Ser Arg Leu Ala Ser Ser TrpGly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser)；
以及
(d)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的第四免疫球蛋白区域：(Glu Val Gln Leu ValGlu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala AlaSer Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser Trp Met Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly LysGly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Asn Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp SerVal Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu GlnMet Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Trp GlyGly Pro Glu Pro Thr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser)。
2.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述第一、第二、第三和/或第四免疫球蛋白区域在融合构建体中，所述融合构建体还包含Fc区，其中任选地存在连接所述四个免疫球蛋白区域与所述Fc区的连接序列。
3.根据权利要求2所述的rAAV，其中所述融合构建体还包含位于两个或更多个所述免疫球蛋白区域之间的所述连接序列。
4.根据权利要求2或3所述的rAAV，其中独立选择每个连接序列。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的rAAV，其中至少一个连接序列是GGGGSGGGGS(SEQID NO：7)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组在所述第一免疫球蛋白的氨基末端包含来自对于所述免疫球蛋白而言外源的来源的信号肽。
7.根据权利要求6所述的rAAV，其中所述信号肽是人白介素2信号肽。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组包含单顺反子表达盒。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组包含双顺反子表达盒。
10.根据权利要求9所述的rAAV，其中两个所述免疫球蛋白区域与第一Fc连接以形成第一链，并且另外两个免疫球蛋白区域与第二Fc连接以形成第二链。
11.根据权利要求9或10所述的rAAV，其中所述载体基因组包含IRES或F2A序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组包含5’UTR。
13.根据权利要求12所述的rAAV，其中所述5’UTR是人c-myc 5’UTR的片段。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组包含单链AAV 5′反向末端重复和AAV 3′反向末端重复。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组编码具有SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：30的氨基酸序列的抗流感融合构建体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV，其中所述rAAV具有AAVhu68衣壳，其中所述AAVhu68衣壳包含：
AAVhu68 vp1蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp1蛋白选自：由编码SEQ ID NO：16的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的vp1蛋白，由SEQ ID NO：18产生的vp1蛋白，或者由与编码SEQ ID NO：16的1至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO：18具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白，
AAVhu68 vp2蛋白的异质群，所述AAVhu68 vp2蛋白选自：由编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的vp2蛋白，由包含SEQ IDNO：18的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或者由与编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO：18的至少核苷酸412至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白，
AAVhu68 vp3蛋白的异质群，所述AAVhu68vp3蛋白选自：由编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的vp3，由包含SEQ ID NO：18的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或者由与编码SEQ ID NO：16的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO：18的至少核苷酸607至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的rAAV，其中编码所述蛋白质的所述核酸序列是SEQ ID NO：18，或者与编码SEQ ID NO：16的氨基酸序列的SEQ ID NO：18具有至少80％至至少99％同一性的序列。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的rAAV，其中所述序列与SEQ ID NO：18具有至少80％至97％同一性。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV，其中所述AAV具有AAV9衣壳，其中所述AAV9衣壳包含具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列或由SEQ ID NO：36编码的氨基酸序列的vp1衣壳蛋白。
21.一种组合物，其包含载剂、稀释剂或赋形剂，和至少根据权利要求1至20中任一项所述的非复制型rAAV的原种。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物被配制用于鼻内施用。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述组合物被配制用于肌内或静脉内施用。
24.根据权利要求1至20中任一项所述的rAAV或根据权利要求21至23中任一项所述的组合物，其用于对人患者进行针对流感的疫苗接种或免疫。
25.根据权利要求24所述的rAAV或组合物，其适于以约109至约7x1013GC的rAAV向患者鼻内给药。
26.根据权利要求1至20中任一项的rAAV或根据权利要求21至25中任一项的组合物用于保护人患者对抗流感的用途。
27.一种用于对人患者进行针对流感的免疫接种的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的rAAV或根据权利要求21至25中任一项所述的组合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中向所述患者鼻内施用约109至约7x1013GC的rAAV的量的剂量。
29.一种产品，其包括容器，所述容器包含根据权利要求1至20中任一项所述的rAAV，任选的稀释剂，和施用说明。
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