CN108135994B - Aav-介导的抗-流感抗体的表达及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供表达抗‑流感抗体的AAV载体。本申请还描述了可用于为预防或抗‑病毒目的而递送所述载体的药用组合物。本申请提供递送这样的载体的方法。

Description

AAV-介导的抗-流感抗体的表达及其使用方法
以电子形式提交的材料的援引并入
申请人通过引用将随附以电子形式提交的序列表材料并入本文。该文件被标记为"UPN_15-7484PCT_ST25.txt"。
联邦政府资助的研究的声明
本发明部分地在Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA)颁发的W911NF-13-2-0036的政府支持下进行。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
流感感染在美国是第七大死因，等同于每年49,000例死亡，占全世界几乎500,000例死亡的很大比例[预防，C.f.D.C.a. 与季节性流感相关的死亡的估计：美国(Prevention, C.f.D.C.a. Estimates of deaths associated with seasonalinfluenza: United States), 1976-2007. 2010; 得自：MMWR Morb. Mortal. Wkly.Rep. 59:1057-1062]。每年流感流行的经济负担估计是大约$870亿。该费用的一半以上覆盖几乎1百万患者需要的医院护理，其中的70%是老年患者(>65岁的年龄) [Molinari,N.A., et al., Vaccine, 2007. 25(27): p. 5086-96]。此外，免疫妥协个体，例如患有HIV/AIDS的患者、器官移植接受者，或罹患自身免疫性疾病的那些个体被考虑为流感的高危组并对感染，以及其并发症具有增加的易感性，其包括致命的肺炎和急性呼吸窘迫综合征[Oliveira, E.C., et al.,, J Intensive Care Med, 2003. 18(2): p. 80-91.]。流感是属于正粘病毒科的RNA病毒。有3种流感病毒属；A [Medina, R.A.和A. Garcia-Sastre, Nat Rev Microbiol, 2011. 9(8): p. 590-603.]、B [Paul Glezen, W., etal., Am J Public Health, 2013. 103(3): p. e43-51]和C。这些类型的流感根据基质和核蛋白质之间的抗原差异来分类。在美国，流感A和B对冬季月份期间的季节性流行病负有责任。尚不知流感C引起流行病且与轻度呼吸道疾病有关。
流感A或B的人与人之间传播通常由于通过感染患者的打喷嚏或咳嗽传播的悬浮微粒或细微飞沫而发生。流感病毒通常进入鼻气管通道。在那里血细胞凝集素(HA)结合于存在于呼吸道上皮细胞上的唾液酸受体，并且病毒包膜与宿主细胞膜融合。随后病毒RNA进入细胞溶质并最终进入宿主细胞核，在那里它进行复制。病毒复制后，宿主细胞然后溶胞，数千个病毒被释放。这样的循环继续，病毒复制并最终传播至下呼吸道，在那里它引起在某些高危受试者组中可能是致死的严重疾病[Medina，引用同上]。
虽然在美国流感疫苗覆盖率在最近十年已经增加，研究已经证实季节性流感疫苗在老年患者和免疫妥协患者中的低效率[Ljungman, P., Clin Microbiol Infect, 2012.18 Suppl 5: p. 93-9]。流感病毒和人类宿主对流感感染的免疫应答的几个方面协力针对简单的预防补救措施。适应性免疫应答的关键靶标例如病毒的HA蛋白快速进化，产生仅部分地保护新感染的免疫记忆应答[Medina，引用同上]。人类对天然感染或流感疫苗的应答在广度上通常是有限的，提供仅针对密切相关的流感亚型的保护作用。这已导致6月龄及以上的受试者的年度接种疫苗，对抗预测在即将到来的季节期间出现的季节性流感病毒株。
流感A病毒可感染人和各种其它哺乳动物包括猪、马、狗以及鸟[Medina，引用同上]。根据两种表面蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的结构，这些病毒被分为两种亚型。有18个已知的HA亚型和11个已知的NA亚型[CDC. 流感病毒的类型. 2014；得自：http://www.cdc.gov/flu/about/viruses/-types.htm]。流感A与大规模的流行病和大流行相联系，值得注意的是与显著的发病率和丧失生命有关的1918年的大流行。流行性流感，也称为季节性流感，通常是不复杂的，且仍然仅局限于人的上呼吸道[Molinari，引用同上；Glezen，引用同上]。病毒性肺炎极少发生，但易感受试者群体，包括孕妇、老年人、患有先前已存在的心血管和肺疾病的患者，被认为是来自流感B的并发症的高危组。通常季节性流感被认为导致轻度疾病。
新流感大流行的出现仍然是一种可导致重大的生命损失和世界性经济混乱的威胁。相信从先前的流感感染和疫苗接种生成的免疫记忆谱有助于弱化新感染的后遗症并增强疫苗的效果。当定居于动物宿主的流感病毒获得人呼吸道趋性并传播于人时，情况却非如此[Juno, J., et al., Clin Dev Immunol, 2012. 2012: p. 797180]。这些动物传染病的毒株与人群中正常传播的那些是完全不同的并可导致具有致命后果的大流行，因为它们不能有效地被对人类病毒株开发的疫苗控制[Juno，引用同上]。如从2009 H1N1大流行得知的[Shapshak, P., et al., Mol Diagn Ther, 2011. 15(2): p. 63-81]，疫苗开发时间不足以快到支持应答于出现大流行的群体疫苗接种。不像流行病，流感大流行是不频繁的，但可导致严重的生命丧失。大流行流感病毒源自非人(即，鸟类)和人病毒之间的遗传分类。区段化病毒的再分类是用于快速新病毒创立的关键机制。这些“抗原漂移”事件将免疫学新流感病毒引入没有先前已存在的免疫力的人群。上一世纪中的两次人类流感大流行与源自具有非人类来源的基因组的基因组区段的再分类的谱系相联系。在最近的大流行期间(2009)，相对于大流行年间，年青人群不成比例地受需要住院的下呼吸道疾病的影响[Dawood, F.S., et al., Lancet Infect Dis, 2012. 12(9): p. 687-95.]。
流感疫苗在防止流感方面不总是有效的。在2013年早期，在美国海军扫雷舰上接种疫苗的102名年青(21-44岁的年龄)健康男性的群体中报告了流感爆发。几乎25%的这些接种疫苗的受试者表现出需要医学护理的流感症状。PCR分析显示流感毒株是H3N2并与2013-2014年流感季节中流行的毒株共享99%同源性(类似于2013-2014年流感疫苗的H3N2抗原成分)[T. L. Aquino, et al., 接种疫苗的群体中的流感爆发(Influenza Outbreakin a Vaccinated Population) — USS Ardent. mmwr 63(42); 947-949 2014]。
两种单克隆抗体已作为预防流感的候选物出现。对于流感A，FI6 [Oliveira, etal，引用同上]，由Lanzavecchia小组[US2010/0080813]发现，而对于流感B，CR8033[Dreyfus, C., et al., Science, 2012. 337(6100): p. 1343-8; US专利8,852,595]，一种由Wilson (The Scripps Research Institute)和Friesen (Crucell)小组发现的抗体。已报道FI6对抑制几种流感A的毒株(包括大流行毒株A/H1N1/1918和A/H1N1/2009)是高度有效的，并在所有组1和组2 HA中具有广泛和有效的反应性和中和特性[Corti, D., etal., Science, 2011. 333(6044): p. 850-6]。重要的是，这些Ab已表明即使在多次连续传代后，也不生成逃避突变体[Oliveira，引用同上；Paul Glezen，引用同上]。已报道当这种抗体经由载体递送时，它保护小鼠和雪貂免遭来自多种流感A毒株的致死性攻击[Limberis, M.P., et al., Sci Transl Med, 2013. 5 (187): p. 187ra72; Limberis,M.P., et al., Clin Vaccine Immunol, 2013. 20(12): p. 1836-7; Adam et al. ClinVaccine Immunol. 2014 Nov;21(11):1528-33;]。
有一种通用抗体，CR9114 [Dreyfus., C. et al, Science, 2012, 337(6100):p1343-8], 其结合于组1和组2流感A和流感B病毒二者。然而，这种抗体的用途受到中和各种流感A和B毒株需要的相对高的抗体浓度的阻碍。对于组1病毒的IC50范围介于从0.1至100 µg/ml，仅有两个毒株落入0.1和1 µg/ml之间，而其余的在1和100 µg/ml之间。对于组2病毒的IC50是甚至更不有利的，仅有一个毒株在1 µg/ml以下[Dreyfus，引用同上]。需要相对高浓度的CR8071用于针对流感B的体内保护作用，而次优剂量导致与非-免疫小鼠比较的更大体重损失(图S2，和逃避突变体在仅15次传代后生成[Dreyfus，引用同上]。另一种流感B抗体CR8020导致逃避突变体在仅4次传代后生成[Dreyfus，引用同上]。
目前有一种批准的鼻内递送的疗法(FluMist Quadrivalent)。然而，它不适合于对蛋具有严重过敏的受试者和2-17岁且服用阿司匹林或含阿司匹林的药物的受试者[Shapiro RJ, S.K., et al. "通用生物学处理的潜在的美国市场和相关的成本节约(Thepotential American market for generic biological treatments and theassociated cost savings)". 2008; 得自：http://www.sonecon.com/docs/studies- /0208 _Generic –BiologicsStudy.pdf]。
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的成员。这些小DNA病毒作为在体内递送后实现稳定的转基因表达的载体，已显示出巨大的前景。AAV起初作为腺病毒的实验室制剂中的污染物被发现[Melnick, J.L., et al., Association of 20-Millimicron Particles withAdenoviruses. J Bacteriol, 1965. 90(1): p. 271-4]。这些分离株的免疫学特征鉴定提示AAV存在6个血清型。血清-流行病学研究表明人广泛地暴露于各种AAV血清型，而大于60%的群体显示到10岁时对6个AAV血清型的大多数的NAb [Calcedo, R., et al., JInfect Dis, 2009. 199(3): p. 381-90]。在二十一世纪早期，AAV载体库通过从人和非-人灵长类动物分离几百种新的AAV病毒而得到扩大[Gao, G., et al., J Virol, 2004.78 (12): p. 6381-8]。超过120个基因型的AAV载体，包括来自人和NHP组织源的原始6个血清型进行了分离、***发生表征和在6个不同的进化枝中组织[Gao, G., et al., JVirol, 2004. 78(12): p. 6381-8]。
本领域对有效治疗和/或预防应用的抗流感疗法仍存在着需求。
发明概述
在一个方面，本发明提供可用于针对流感感染进行被动免疫的组合物。该组合物包含从AAV载体表达的抗流感A抗体和从第二AAV载体表达的抗流感B抗体。在一个实施方案中，第一非复制重组AAV具有AAV9衣壳(rAAV9)和包含核酸序列的载体基因组，所述核酸序列编码：(a) AAV反向末端重复序列(ITR)，(b) 增强子，(b) 鸡β-肌动蛋白启动子，(c)内含子，(d) 5’ UTR，(e) 可操作地连接于F16v3重链的前导肽，(f) FI6v3可变重链；(g) 人IgG1 Fc链(CH2-3)；(h) 可操作地连接于免疫球蛋白κ可变轻链的前导肽；(i) 免疫球蛋白恒定轻链；(j) 弗林蛋白酶识别位点；(k) F2A接头；(l) 多腺苷酸化信号；和(m) AAV反向末端重复序列。在某些实施方案中，组合物含有第二非复制rAAV9，其具有包含核酸序列的载体基因组，所述核酸序列编码：(a) AAV反向末端重复序列(ITR)，(b) 增强子，(b) 鸡β-肌动蛋白启动子，(c)内含子，(d) 5’ UTR，(e) 可操作地连接于CR8033重链的前导肽，(f)CR8033可变重链；(g) 人IgG1 Fc链(CH2-3)；(h) 可操作地连接于免疫球蛋白可变κ轻链的前导肽；(i) 恒定轻链cDNA；(j) 弗林蛋白酶识别位点；(k) F2A接头；(l) 多腺苷酸化信号；和(m) AAV反向末端重复序列，和含水液体悬浮基质。
在另一方面，提供保护人类患者对抗流感的方法，其包括给予有效量的如本文提供的抗流感组合物。合适地，患者被给予约1 x 1010-约3 x 1013基因组拷贝的量的剂量。在某些实施方案中，组合物经鼻内给予。在其它实施方案中，组合物经肌内或静脉内给予。
在进一步的方面，提供一种产品，其包括含有如本文描述的抗流感组合物、任选的稀释剂和用于给药的说明书的容器。
在更进一步的方面，本发明提供预防流感的方法，其包括给予表达如本文描述的合成的抗流感抗体的载体。这样的疗法可与表达不同抗体的其它载体，或其它抗-病毒组合物组合。任选地，该方法可用作疫苗，即在流感暴露之前。
本发明的还有的其它方面和优点将容易地从本发明的以下详细描述中变得显而易见。
附图简述
图1A-1B作为GTP101载体成分的示意图提供。FIG 1A是AAV-FI6 mAb的示意图和图1B是AAV-CR8033 mAb的图示。
图2是提供制备过程的概观的流程图。
图3A和3B提供用于保护以避免PR8攻击所需的AAV2/9.CB7.FI6的最小有效剂量(MED)的测定。(A) 在用5LD50 PR8攻击后，用不同剂量的AAV2/9.CB7.FI6鼻内(IN或i.n.)处理的小鼠的体重。(B) 受攻击的小鼠的存活率。当小鼠出现于困境中或它们的体重下降≥30%时，对小鼠实施安乐死。
图4A和4B显示在肺(BALF)和鼻(NLF)表面上FI6表达的测定。小鼠经IN给予各个剂量的AAV2/9.CB7.FI6，评价在尸体剖检时收获的肺和鼻衬里的表面液体中表达的抗体水平。图4A提供在BALF中的FI6表达的结果和图4B提供在NLF表面的FI6表达的结果。
图5显示在幼稚(naïve)小鼠和用AAV2/9.CB7.FI6接种疫苗的小鼠的肺中病毒载量的定量。来自非-接种疫苗的(naïve)和AAV2/9.CB7.FI6接种疫苗的组的3只小鼠在第6天进行尸体剖检，以定量肺中的病毒载量。
图6A和图6B显示保护以免流感攻击的快速起效。1x1011 GC的AAV2/9.CB7.FI6经IN递送至BALB/c小鼠，8小时后用5LD50的PR8攻击小鼠。图6A显示在第0天攻击后的小鼠的体重。图6B显示受攻击的小鼠的存活率。当小鼠出现于困境或它们的体重下降≥30%时，对小鼠实施安乐死。
图7A和图7B显示为了保护以避免被B/Lee/40攻击所需的AAV2/9.CB7.CR8033的MED的测定。图7A显示在用5LD50 B/Lee/40攻击后，经IN用不同剂量的AAV2/9.CB7.CR8033预处理的小鼠的体重。图7B显示受攻击的小鼠的存活率。当小鼠出现于困境或它们的体重下降≥30%时，对小鼠实施安乐死。
图8显示混合两种AAV载体对保护以避免被流感A (PR8)攻击的影响。小鼠用1x109GC的AAV2/9.CB7.FI6 (三角形)或者用1x109 GC的AAV2/9.CB7.FI6和1x109 GC的AAV2/9.CB7.CR8033的混合物(正方形)给予。14天后用5LD50 PR8 (流感A)攻击小鼠。当小鼠出现于困境或它们的体重下降≥30%时，对小鼠实施安乐死。
图9显示混合两种AAV载体对保护以避免被流感B攻击的影响。小鼠用1x109 GC的AAV2/9.CB7.CR8033 (三角形)或者用1x109 GC AAV2/9.CB7.CR8033和1x109 GC AAV2/9.CB7.FI6的混合物(正方形)给予。小鼠在14天后用5LD50 B/Lee/40 (流感B)攻击。当小鼠出现于困境或它们的体重下降≥30%时，对小鼠实施安乐死。
图10显示血清-循环AAV2/9-特异性NAb的水平。小鼠经鼻内(i.n.)给予剂量范围从1x109至1x1011 GC/小鼠的AAV2/9载体，血清中的AAV2/9中和抗体在AAV2/9递送后第28天测定。
图11A-11G显示载体-介导的针对流感A (PR8)攻击的预防。6周龄雌性BALB/c小鼠(n=5/组)经i.n.给予在总体积50 µl PBS中的1x109 GC的AAV2/9.CB7.CR8033和1x109 GC的AAV2/9.CB7.FI6的混合物。载体在3种不同的溶液中配制：PBS-pH 6.8、PBS-pH 7.2或PBS-pH 7.4。在载体给予后7天用5LD50的PR8攻击小鼠。每日记录动物的体重且当它们出现于困境或当它们失去其攻击前体重的≤ 30%时，对小鼠实施安乐死。小鼠经i.n.给予在PBS-pH6.8 (图11A)、PBS-pH 7.2 (图11D)或PBS-pH 7.4 (图11G)中的1x109 GC AAV2/9.CB7.CR8033和1x109 GC的AAV2/9.CB7.FI6并在7天后用PR8攻击。图11A、11D和11G显示小鼠随时间推移的体重；黑色圆圈代表经由吸液管接受载体(液体递送)的小鼠，深灰色正方形代表接受通过IMAD处理的载体的小鼠和浅灰色三角形代表不接受载体(幼稚小鼠)并用作PR8攻击的对照的小鼠。幼稚小鼠由于严重的体重损失在第8天被实施安乐死。在实验结束(第21天)时，处死幸存者，收获BALF用于抗体表达并处理肺用于通过Taqman PCR定量AAV9基因组。图11B、11E和11H显示在给予分别在PBS-pH 6.8、PBS-pH 7.2和PBS-pH 7.4中配制的各自109 GC的AAV2/9.CB7.CR8033和AAV2/9.CB7.FI6的混合物的小鼠的BALF中，通过蛋白A ELISA量化抗体表达。对于装置(IMAD)和吸液管控制(液体)，结果以ng/mL显示。图11C、图11F和图11-I显示在给予分别在PBS-pH 6.8、PBS-pH 7.2和PBS-pH 7.4中配制的各自109 GC的AAV2/9.CB7.CR8033和AAV2/9.CB7.FI6的混合物的小鼠肺中，通过Taqman PCR量化的AAV9基因组。
图12A-12G显示对抗用PR8和流感B (B/Lee/40)病毒攻击的载体-介导的预防作用。6周龄雌性BALB/c小鼠(n=5/组)经i.n.给予1x109基因组拷贝(GC)的AAV2/9.CB7.CR8033和1x109 GC的AAV2/9.CB7.FI6在总体积50 µl PBS中的混合物。载体在PBS-pH 7.4中配制。小鼠在7天后用5LD50的PR8 (图12A)或B/Lee/40 (图12D)病毒攻击。每天记录动物的体重并在它们出现于困境或当它们失去其攻击前体重的≤ 30%时，对小鼠实施安乐死。用PR8 (图12A)或B/Lee/40 (图12D)攻击的小鼠随时间推移的体重被显示出。黑色圆圈代表经由吸液管接受载体(液体递送)的小鼠，深灰色正方形代表接受通过IMAD处理的载体的小鼠和浅灰色三角形代表不接受载体(幼稚小鼠)和用作PR8攻击的对照的小鼠。除了一只幸存外，幼稚小鼠(5只中的4只)到第8天实施安乐死。在实验结束(第21天)时，处死幸存者，为抗体表达收获BALF并为通过Taqman PCR定量AAV9基因组处理肺。图12B显示通过蛋白A ELISA在BALF中定量的抗体表达，而图12C显示在给予在PBS-pH 7.4中配制的各109 GC的AAV2/9.CB7.CR8033和AAV2/9.CB7.FI6的混合物并用PR8攻击的小鼠中，通过Taqman PCR定量的存在于肺中的AAV9基因组。图12E显示通过蛋白A ELISA量化的在BALF中的抗体表达，而图12F显示在给予在PBS-pH 7.4中配制的各1x109 GC的AAV2/9.CB7.CR8033和AAV2/9.CB7.FI6的混合物并用B/Lee/40攻击的小鼠中，通过Taqman PCR定量的存在于肺中的AAV9基因组。图12G显示通过IMAD投入的载体悬浮液(0.5mL)的量以评价载体溶液的物理损失。如所显示的，当载体溶液通过IMAD投入时，观察到起始体积的4-6.6%的物理液体损失。
发明详述
本文提供为由两部分构成的(bipartite)药物产品的组合物，所述药物产品包含血清型9的两个非复制重组腺相关病毒(AAV)载体，其表达分别赋予针对流感A和流感B的被动免疫作用的重组抗体。
本文提供的组合物具有超过目前可用的流感疫苗的几种优点。体内共同表达的抗流感A和抗流感B抗体构建体提供针对流感A和流感B感染的被动免疫。换言之，与递送流感抗原并依赖于患者的免疫***以建立免疫应答并生成抗体的传统疫苗相反，本文提供的组合物递送抗-流感抗体至患者。因此，所述疫苗对具有在用流感抗原免疫后不能产生满意的保护性免疫应答的免疫***的患者是有用的。而且，本文提供的组合物可在给予后提供比基于抗原的疫苗方法更快起效的保护作用。
其它优点包括组合物可经鼻内递送的事实；因此，所述方法是最小侵入性的，且无轻微感染的风险或与递送目前具有减毒病毒的鼻内疫苗相关的其它副作用。还有的另一个优点是组合物对具有蛋过敏的患者可能是有用的。所述组合物对服用阿司匹林或含阿司匹林的药物的患者没有禁忌。而且，本文提供的rAAV组合物显著减少为有效蛋白治疗剂所需的重复胃肠外给予的次数。在某些实施方案中，在递送至鼻上皮细胞后，仅需要每年约1次的再给予。在还有的另一个优点中，本文提供的组合物可在比许多传统的基于病毒的流感疫苗更短的时间范围内产生。因此，本发明的组合物提供用于保护处于危险的群体的更加实用的方法。
在某些实施方案中，当鼻内递送约3 mL或更少，2 mL或更少，或1 mL或更少，0.5mL或更少，例如在约100 µL-250 µL的范围内的剂量时，本文提供的载体表达有效水平的功能性抗体。一般来说，组合物在约5.5-约8.5、6-8，或6.5-7.5，或6.8、7.2，或7.4的pH下配制。因此，本文提供的载体以对于计量剂量是方便的剂量，或以含有预先测量的剂量的产品或药剂盒提供治疗水平的抗体时是高度有效的。在某些实施方案中，组合物以喷雾的体积和液滴大小优先靶向鼻内上皮细胞的细胞的方式被配制用于鼻内递送。鼻上皮细胞中的表达已显示赋予保护性被动免疫。组合物也可被配制用于靶向肺的鼻内递送。除了鼻上皮细胞，或优先鼻上皮细胞，例如通过调节鼻内递送的体积和/或液滴大小，还可靶向肺。当与肌内递送的常规流感疫苗比较时，鼻内递送的AAV导致Ab表达(在数小时或几天内)的更快起效。然而，在某些实施方案中，本文描述的组合物可被配制用于通过其它途径，例如肌内注射、静脉内注射，或其它合适的途径递送。在这样的情况下，合适的制剂和体积可由本领域技术人员确定。
抗体构建体
在某些实施方案中，本文提供的组合物递送经由非-复制病毒载体在体内细胞中表达和从那里分泌的两种流感抗体，以提供保护免疫。如在本文的实施例中说明的，病毒载体是rAAV，而所述组合物含有两个不同的rAAV贮库，其中的每一个具有不同的载体基因组。在第一贮库中，载体基因组含有对于流感A抗体的编码序列。在第二贮库中，载体基因组含有对于流感B抗体的编码序列。
流感A抗体是合成的FI6构建体。对于FI6v3重链、轻链可变链、可变区和互补决定区的氨基酸序列，见例如美国专利公布号2010/0080813。也见，美国专利8,124,092。在某些实施方案中，构建编码FI6的F16轻链可变区(GenBank登录号PDB: AEL31310.1, GI:342674599和342674581)的F16v3表达盒，其连接于人IgG1的恒定(CH1、CH2和CH3)结构域和轻链种系κ序列(连接于人CL结构域)，产生单克隆抗体结构。在另一个实施方案中，FI6表达盒含有FI6v3的全长重链(见，SEQ ID NO:1的nt 2440-2760 (CH1)、nt2761-3426 (CH2-CH3))。编码示例性轻链的cDNA以SEQ ID NO: 1的nt 3511-3909提供(前导序列nt 3511-3510，κ链nt 3571-3909)。在又一个实施方案中，合成的FI6构建体至少含有FI6v3重链可变区、重链恒定区CH1、CH2和CH3，和免疫球蛋白轻链。
在某些实施方案中，编码构成抗流感A抗体的免疫球蛋白结构域的核酸序列被设计用于在人细胞中表达。这样的序列可包括，例如FI6v3重链可变区(SEQ ID NO:1的nt2053-2439)和恒定区CH2和CH3 (SEQ ID NO:1的nt 2761-3426)。然而，本文提供的F16v3氨基酸序列的其它编码序列可被工程改造并由本发明涵盖。见，例如编码重链可变区(如SEQID NO:2的氨基酸)、CH1 (如SEQ ID NO:3的氨基酸)，和/或CH2-CH3 (如SEQ ID NO:4的氨基酸)的其它序列。也见，SEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19、20、21、22或23。
在某些实施方案中，“可变”轻链是源自种系来源的κ链。例如，在此提供的例子利用lcl|IGKV4-1*01种系基因[智人] (见，例如SEQ ID NO:1的nt 3571-3909或SEQ ID NO:8的nt 3265-3606)。任选地，另一种编码κ轻链(SEQ ID NO: 5)和/或恒定轻链(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的核酸序列可被选择。在另一个供替代的选择中，另一种合适的种系序列可被选择。在另一个实施方案中，轻链是λ链。优选地，不改变重链配偶体的抗原特异性的种系序列被选择作为轻链的来源。这样的免疫球蛋白种系序列的来源例如在Kabat数据库，www.ncbi.nlm.nih.gov/和http://www.imgt.org/genedb/table
Figure DEST_PATH_IMAGE002
mode=3d&selectGenes=IGKV4-1&selectSpecies=Homo%20sapiens中提供。
流感B抗体是合成的CR8033抗体。对于CR8033的重链、轻链、可变区和互补决定区的氨基酸序列，见例如美国专利8,852,595。抗体具有为源自CR8033抗流感抗体的工程改造序列的重链。在一个实施方案中，在此提供的工程改造的抗体含有密码子优化的重链可变区(例如SEQ ID NO:8的nt 1753-2133)、CH1 (例如SEQ ID NO:8的nt 2134-2454)，和CH2-CH3 (例如SEQ ID NO:8的nt 2455-3120)。在某些实施方案中，CH1区可以省略。在其它实施方案中，编码重链可变区(例如SEQ ID NO:9)、CH1 (例如SEQ ID NO:10)和/或CH2-3 (例如SEQ ID NO: 11)的不同的核酸序列可被选择。
在还有的其它实施方案中，轻链可源自F16抗体。见，例如Corti et al, Science,2011 Aug 12; 333 (6044): 860-6, Epub 2011 Jul 28。
在某些实施方案中，在此提供的合成的F16抗体构建体可在体外表达并用于，例如，蛋白疗法或用于产生抗-独特型抗体。该抗体构建体至少由F16重链与来自种系来源的轻链的组合构成。
在其它实施方案中，在此提供的合成的CR8033抗体构建体可在体外表达并用于，例如蛋白疗法或用于产生抗-独特型抗体。该抗体构建体至少由CR8033重链与来自种系来源的轻链的组合构成。
这样的表达方法和用途是本领域已知的。
载体基因组
为表达选择的免疫球蛋白结构域，核酸分子可被设计为含有为在选择的哺乳动物物种，例如人中优化表达免疫球蛋白多肽而选择的密码子。而且，核酸分子可包含用于选择的抗体的每条重链和轻链的异源性前导序列，其编码与由可变和恒定区构成的重链和轻链多肽的上游融合的IL-2信号前导肽。然而，另一种异源性前导序列可替代IL-2信号/前导肽的一个或两个。信号/前导肽对于每个重链和轻链免疫球蛋白构建体可以是相同或不同的。这些可以是天然发现于免疫球蛋白(例如IgG)中的信号序列，或可以是来自异源来源。这样的异源来源可以是细胞因子(例如IL-2、IL12、IL18等)、胰岛素、白蛋白、β-葡糖醛酸酶、碱性蛋白酶或纤连蛋白分泌信号肽，或来自组织特异性分泌蛋白的序列，及其它。
如本文所用的，“表达盒”指包含至少第一开放阅读框(ORF)和任选的第二ORF的核酸序列。ORF可含有2、3或4个抗体结构域。例如，ORF可含有全长重链。或者，ORF可含有一个或两个抗体结构域。例如，ORF可含有重链可变结构域和单个重链恒定结构域。在另一个实例中，ORF可含有轻链可变和轻链恒定区。因此，表达盒可被设计为双顺反子，即含有来自共享调控序列的指导其上的ORF的表达的调控序列。在此情况下，两个ORF通常通过接头分开。合适的接头，例如内部核酶结合位点(IRES)和/或弗林蛋白酶(furin)-2a自-裂解肽接头(F2a) [见，例如Radcliffe和Mitrophanous, Gene Therapy (2004), 11, 1673-1674]是本领域已知的。合适地，ORF可操作地连接于指导在靶细胞中表达的调控序列。这样的调控序列可包括polyA、启动子和增强子。为从AAV载体促进共同-表达，增强子和/或polyA序列的至少一个可由第一和第二表达盒共享。
在一个实施方案中，rAAV在选择的AAV衣壳内包装了一种核酸分子，其包含表达盒，所述表达盒包含：5’ AAV反向末端重复序列(ITR)、启动子、5’ UTR、任选的Kozak序列、可操作地连接于包含重链的第一免疫球蛋白链的第一信号肽、接头序列、可操作地连接于第二免疫球蛋白链的第二信号肽和3’ AAV ITR，其中第二免疫球蛋白是免疫球蛋白轻链，其中所述表达盒在宿主细胞中，在允许链装配成具有提供重链的抗体特异性的功能性抗体构建体的条件下共同表达免疫球蛋白链。在一个实施方案中，重链是合成的抗流感FI6v3重链免疫球蛋白，而轻链是来自种系的κ轻链。
在一个实施方案中，表达盒包含来自与AAV衣壳不同的来源的AAV ITR以形成假型AAV。在一个实施方案中，表达盒还包含组成型启动子和RGB polyA。其它合适的载体元件例如启动子和polyA序列可被选择。例如，最小启动子和/或最小polyA可被选择以节约空间。通常，在这个实施方案中，每个启动子位于增强子序列的任一邻近(左方或者右方(或5’或3’))，而polyA序列位于ITR的邻近，ORF在其之间。虽然优选首先表达重链序列，但ORF的顺序可以变化，如由此编码的免疫球蛋白结构域。例如，轻链恒定和可变序列可位于增强子的左边，而重链可由位于增强子右边的ORF编码。或者，重链可位于增强子的左边，而编码轻链的ORF位于增强子的右边。或者，相反的构型是可能的。
在另一个实施方案中，rAAV在选择的AAV衣壳内包装了一种核酸分子，其包含：5’AAV反向末端重复序列(ITR)、启动子、5’ UTR、任选的Kozak序列、可操作地连接于Fi6免疫球蛋白重链的IL-2信号肽、F2a、可操作地连接于种系κ轻链的IL-2信号肽，和3’ AAV ITR。在一个实施方案中，AAV衣壳是AAV9或AAV8。在进一步的实施方案中，ITR来自AAV2，或来自不同于AAV衣壳来源的不同来源。
合适的调控序列可被选择并从各种来源获得。在一个实施方案中，最小启动子和/或最小polyA可被利用以节约大小。
如本文所用的，术语“最小启动子”意指包含TATA-盒和用来指定转录起始位点的其它序列的短DNA序列，其中调控元件被加入以控制表达。在一个实施方案中，启动子指包含最小启动子加能够控制编码序列或功能性RNA的表达的调控元件的核苷酸序列。这种类型的启动子序列由近端和较远端的上游元件组成，后一元件通常被称为增强子。在一个实施方案中，最小启动子是巨细胞病毒(CMV)最小启动子。在另一个实施方案中，最小启动子源自人CMV (hCMV)，例如hCMV立刻早期启动子衍生的最小启动子(见，US 20140127749，和Gossen和Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 5547-5551)，其通过引用结合到本文中)。在另一个实施方案中，最小启动子源自病毒源例如：SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立刻早期启动子，或鲁斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus, RSV)早期启动子；或来自真核细胞启动子，例如，β肌动蛋白启动子(Ng, Nuc. Acid Res. 17:601-615,1989; Quitsche et al., J. Biol. Chem. 264:9539-9545, 1989)、GADPH启动子(Alexander, M. C. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5092-5096, 1988,Ercolani, L. et al., J. Biol. Chem. 263:15335-15341, 1988)、TK-1 (胸苷激酶)启动子、HSP (热休克蛋白)启动子、UbB或UbC启动子、PGK、Ef1-α启动子或含有TATA盒的任何真核启动子(美国公布申请号2014/0094392)。在另一个实施方案中，最小启动子包括微小-启动子(mini-promoter)，例如在美国公布申请号2014/0065666中描述的CLDN5微小-启动子。在另一个实施方案中，最小启动子是胸苷激酶(TK)启动子。在一个实施方案中，最小启动子是组织特异性的，例如肌肉-细胞特异性启动子最小TnISlow启动子、最小TnIFast启动子或肌肉肌酸激酶启动子之一(美国公布申请号2012/0282695)。这些文件的每一篇通过引用结合到本文中。
重组AAV载体(AAV病毒颗粒)可包含，包装在AAV衣壳内的，表达如在本说明书中描述的功能性抗体的核酸分子。表达盒可含有用于每个表达盒内的开放阅读框的调控元件，而核酸分子可任选地含有另外的调控元件。
AAV载体可含有全长AAV 5’反向末端重复序列(ITR)和全长3’ ITR。5’ ITR的缩短的版本，称为∆ITR，已被描述，其中D-序列和末端分解位点(trs)缺失。缩写词“sc”指自身互补。“自身互补AAV”指一种构建体，其中由重组AAV核酸序列携带的编码区已被设计形成分子内双链DNA模板。在感染时，不是等待细胞介导的第二链的合成，scAAV的两个互补的一半将缔合形成一个双链DNA (dsDNA)单元，其准备直接复制和转录。见例如D M McCarty et al, “Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectorspromote efficient transduction independently of DNA synthesis”, Gene Therapy,(2001年8月), 第8卷, 16期, 1248-1254页。自身互补AAV描述于，例如美国专利号6,596,535；7,125,717；和7,456,683中，其每一篇通过引用以其整体结合到本文中。
当要生产假型AAV时，ITR从不同于衣壳的AAV源的来源选择。例如，AAV2 ITR可被选择与具有对选择的细胞受体、靶组织或病毒靶标的特定效率的AAV衣壳一起使用。在一个实施方案中，来自AAV2的ITR序列，或其缺失的版本(∆ITR)，为了方便而使用并加快监管批准。然而，来自其它AAV来源的ITR可被选择。当ITR的来源是来自AAV2，而AAV衣壳是来自另一个AAV来源时，生成的载体可被称为假型的。然而，其它来源的AAV ITR可被利用。
各种AAV衣壳已被描述。生成AAV载体的方法已被广泛描述于文献和专利文件中，包括，例如WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。AAV衣壳的来源可从靶向所需组织的AAV选择。例如，合适的AAV可包括，例如AAV9 [US 7,906,111；US2011-0236353-A1]、rh10 [WO 2003/042397]和/或hu37 [见例如US 7,906,111；US 2011-0236353-A1]。然而，其它AAV，包括，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 [美国专利7790449；美国专利7282199]及其它。然而，AAV衣壳的其它来源和其它病毒元件可被选择，如其它免疫球蛋白构建体和其它载体元件。
产生和分离适合于递送至受试者的AAV病毒载体的方法是本领域已知的。见例如美国专利7790449；美国专利7282199；WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；和US 7588772 B2]。在一个***中，发生器细胞系用编码由ITRs侧接的转基因的构建体和编码rep和cap的构建体瞬时转染。在第二***中，稳定地供应rep和cap的包装细胞系用编码由ITRs侧接的转基因的构建体瞬时转染。在这些***的每一个中，AAV病毒体在用辅助腺病毒或疱疹病毒感染的应答中产生，需要从污染病毒分离rAAVs。最近，已开发出不需要用辅助病毒感染的***以回收AAV - 需要的辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA，和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52，和UL29，和疱疹病毒聚合酶)也通过该***以反式供应。在这些较新的***中，辅助功能可通过具有编码需要的辅助功能的构建体的细胞的瞬时转染供应，或细胞可被工程改造以稳定地含有编码辅助功能的基因，其表达可以转录或转录后水平控制。在又一个***中，由ITRs和rep/cap基因侧接的转基因通过用杆状基于病毒的载体感染而引入昆虫细胞中。对于有关这些生产***的评述，一般见例如Zhang et al., 2009, "用于大规模重组腺相关病毒生产的杂交的腺病毒-腺相关病毒(Adenovirus-adeno-associatedvirus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production)",Human Gene Therapy 20: 922-929，其每一篇的内容通过引用以其整体结合到本文中。制备和使用这些和其它AAV生产***的方法也被描述于以下美国专利中，其内容通过引用以其整体结合到本文中：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化(poly(A))信号是最小poly(A)信号，即需要有效的聚腺苷酸化的最小序列。在一个实施方案中，最小poly(A)是合成的poly(A)，例如在Levitt et al, Genes Dev., 1989 Jul, 3(7):1019-25；和Xia et al, Nat Biotechnol.2002 Oct; 20 (10):1006-10. Epub 2002 Sep 16中描述的poly(A)。在另一个实施方案中，poly(A)源自兔β-球蛋白poly(A)。在一个实施方案中，polyA双向地起作用(An et al,2006, PNAS, 103(49): 18662-18667。在一个实施方案中，poly(A)源自SV40早期poly A信号序列。这些文件的每一篇通过引用结合到本文中。
任选地，单个增强子，或同一增强子，可调控质粒构建体中多个异源性基因的转录。各种适合用于本发明的增强子是本领域已知的并包括，例如，CMV早期增强子、Hoxc8增强子、nPE1和nPE2。在此有用的另外的增强子描述于Andersson et al, Nature, 2014年3月, 507(7493):455-61，其通过引用结合到本文中。还有的其它增强子元件可包括，例如载脂蛋白增强子、斑马鱼增强子、GFAP增强子元件，和例如描述于WO 2013/1555222中的组织特异性增强子，土拨鼠肝炎后转录后调控元件。另外地，或者作为选择，其它的，例如，杂交的人巨细胞病毒(HCMV)-立刻早期(IE)-PDGR启动子或其它启动子-增强子元件可被选择。为增强表达，其它元件可以是内含子(像promega内含子或嵌合鸡球蛋白-人免疫球蛋白内含子)。本文有用的其它增强子可在http:// promoter.cdb.riken.jp/中发现的哺乳动物启动子/增强子数据库中找到。
在此描述的构建体还可含有其它表达控制或调节序列，例如包含适宜的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定胞浆的mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即，Kozak共有序列；增强蛋白稳定性的序列；和当需要时，提高编码的产品分泌的序列。在以下工作实施例中，所用的Kozak序列是：CCACCATG (SEQ ID NO:1的nt (1988)..(1992))；然而，其它合适的序列可被选择。启动子可从组成型启动子、组织-特异性启动子、细胞-特异性启动子、响应于生理信号的启动子，或可调控的启动子中选择[见，例如WO 2011/126868和WO 2013/049492]。
这些对照序列是“可操作地连接”于免疫球蛋白构建体基因序列。如本文所用的，术语“可操作地连接”指与感兴趣的基因邻近的表达控制序列和以反式起作用或在一定的距离控制感兴趣的基因的表达控制序列二者。
适合于控制表达抗体结构域的组成型启动子的例子包括，但不限于鸡β-肌动蛋白(CB)或来自其它物种的β肌动蛋白启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、类人猿病毒40(SV40)的早期和晚期启动子、U6启动子、金属硫蛋白启动子、EFlα启动子、遍在蛋白启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子(Scharfmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4626-4630 (1991)、腺苷脱氨酶启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸甘油变位酶启动子，β-肌动蛋白启动子(Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989)、UbB、UbC、莫洛尼氏白血病病毒(Moloney Leukemia Virus)和其它逆病毒的长末端重复序列(LTR)、单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子和本领域技术人员已知的其它组成型启动子。适合用于本发明的组织-或细胞-特异性启动子的实例包括，但不限于，内皮素-I (ET -I)和Flt-I，其是对内皮细胞、FoxJ1特异性的(其靶向纤毛细胞)。
虽然不太理想，可利用适合于控制表达抗体结构域的诱导性启动子，包括对外源性物质(例如药用物质)或对生理信号有响应的启动子。这些应答元件包括，但不限于结合HIF-Iα和β的缺氧应答元件(HRE)，例如由Mayo et al. (1982, Cell 29:99-108);Brinster et al. (1982, Nature 296:39-42)和Searle et al. (1985, Mol. Cell.Biol. 5:1480-1489)中描述的金属-离子应答元件，或例如由Nouer et al. (在：热休克应答(Heat Shock Response), ed. Nouer, L., CRC, Boca Raton, Fla., ppI67-220,1991)中描述的热休克应答元件。
在一个实施方案中，开放阅读框的表达由可调控的启动子控制，其提供对ORF (基因)转录，例如，药用物质，或由药用物质或在备选的实施方案中，由生理信号激活的转录因子的严格控制。可以使用的为配体依赖的转录因子染色体组的可调控的启动子的例子包括，而不限于，由它们的各自的配体(例如糖皮质激素、***、孕激素、维甲酸、蜕皮激素，及其类似物和模拟物)激活的核受体超家族的成员和由四环素激活的rTTA。这样的***的实例, 包括，而不限于，ARGENT™转录技术(ARGENT™ Transcriptional Technology)(ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, Mass.)。这样的启动子***的实例例如在WO2012/145572中描述，其通过引用结合到本文中。在其它实施方案中，小RNA基开关描述于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25605380中。
还有的其它启动子可包括，例如人巨细胞病毒(CMV)即刻-早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、JC多形瘤病毒启动子、髓磷脂碱性蛋白(MBP)或胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疱疹病毒(HSV-1)隐性相关启动子(LAP)、鲁斯氏肉瘤病毒(rousesarcoma virus, RSV)长末端重复序列(LTR)启动子、神经元-特异性启动子(NSE)、血小板衍化生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑色素-浓集激素(MCH)启动子、CBA、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、基质金属蛋白启动子(MPP)，和鸡β-肌动蛋白启动子。对于每个表达盒，启动子可以是相同或不同的。
在某些实施方案中，载体基因组各自含有由反向末端重复序列(ITRs)侧接的免疫球蛋白表达盒。表达盒含有由CB7启动子，一种巨细胞病毒(CMV)立刻早期增强子(C4)和鸡β肌动蛋白启动子之间的杂交种驱动的编码序列。来自该启动子的转录因存在鸡β肌动蛋白内含子(CI)增强。人c-myc基因的5’非翻译区(UTR)被定位于mAb编码区作为翻译增强子的上游。用于表达盒的多腺苷酸化信号是兔β-球蛋白(RBG) polyA。前导(信号)肽在抗体的重链和轻链二者之前并介导抗体从转导的细胞的分泌。重链和轻链由含有弗林蛋白酶裂解位点和FMDV 2A序列的接头分离。该接头介导重链和轻链的翻译后裂解，而例外是单个氨基酸取代(重链的末端赖氨酸用精氨酸残基取代)，从最终mAb产品完全除去。
在一个实施方案中，载体包含组成型启动子。在另一个实施方案中，5’ UTR是来自人c-myc基因的截短的UTR。接头序列可以是F2A或IRES。重链信号肽和轻链信号肽可以是相同或不同的。在一个实施方案中，前导序列是白细胞介素(IL) IL-2前导序列，其可以是例如用于FI6v3重链的野生型IL2 (Myrmqllscialslalvtns, SEQ ID NO:24)，或合成的前导序列，例如用于种系κ轻链的突变的IL2 (Myrmqllllialslalvtns, SEQ ID NO:5)或用于CR8033重链的突变的IL2前导序列(Mrmqllllialslalvtns, SEQ ID NO: 25)。可以采用其它包括先天抗体信号肽的前导序列，或其它异源性前导序列。在一个实施方案中，野生型或合成的polyA可被选择。如本文所用的载体可以是任何合适的遗传元件，其转染、转导或感染宿主细胞并表达装配到功能性抗体的免疫球蛋白。这样的载体可选自慢病毒载体、杆状病毒载体、细小病毒载体、质粒、修饰的RNA，和DNA分子，其中mRNA和DNA可呈现为纳米粒子的形式。
在一个实施方案中，用于携带流感A抗体的AAV载体的载体基因组包含：
反向末端重复序列(ITR)：AAV2 ITRs (GenBank # NC001401)仅代表载体基因组复制和包装需要的顺式序列。具有得自与其衣壳不同的来源的ITRs的AAV被称为"假型"。在某些实施方案中，得自并非AAV2的来源的ITRs可选择这个构建体以生成另一种假型AAV。或者，可选择来自相同来源的ITRs作为衣壳。
巨细胞病毒(CMV)立刻早期增强子(260 bp, C4; GenBank # K03104.1)。在另一个实施方案中，可选择另一种增强子。见，增强子的以下讨论。
鸡β-肌动蛋白启动子(281 bp; CB; GenBank # X00182.1)。在某些实施方案中，可选择另一种启动子。见，启动子的以下讨论。在还有的其它实施方案中, 可包括多个增强子和/或启动子。
鸡β-肌动蛋白内含子：来自鸡β肌动蛋白基因的875 bp内含子(GenBank #X00182.1) 存在于载体表达盒内。
C-myc 5’ UTR：智人(Homo sapiens) v-myc鸟类骨髓细胞瘤病病毒致癌基因同系物(MYC) mRNA (GenBank登录号NM002467)的核苷酸381-428。
前导(信号)肽cDNA：密码子优化的cDNA序列(http://www.uniprot.org/uniprot/P60568)在FI6重链前面和在FI6重链的框内。FI6v3可变重链cDNA：一种编码人重链可变区抗流感病毒可变区的密码子优化的人cDNA序列(GenBank登录号AEL31303.1)。
恒定重链1 (CH1)：编码人免疫球蛋白重链(GenBank登录号BAF64540.1)的蛋白序列的密码子优化的cDNA被合成。
FI6 Fc链(CH2-3)：编码GenBank登录号2J6E_A的人免疫球蛋白部分的密码子优化的cDNA，例外的是用精氨酸替代的C-末端赖氨酸和在位置57用谷氨酸替代天冬氨酸)。
前导(信号)肽cDNA：在通用轻链之前的密码子优化的cDNA序列(描述于[Zhang etal中的ILhy1，引用同上)被合成。
通用轻链cDNA：密码子优化的人cDNA序列(GenBank登录号ACJ71709.1)被合成。
恒定轻链cDNA：密码子人序列(GenBank登录号AGH70219.1)被合成。
弗林蛋白酶识别位点：精氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸和密码子优化的cDNA被合成。
F2A接头：源自FMDV (GenBank # CAA2436.1)的24个氨基酸肽和密码子优化的cDNA被合成。
多腺苷酸化信号：127 bp兔β-球蛋白多腺苷酸化信号(GenBank # V00882.1)提供对抗体mRNA的有效的聚腺苷酸化的顺式序列。
在某些实施方案中，用于携带流感B抗体的AAV载体的载体基因组包含：反向末端重复序列(ITR)：AAV2 ITRs；巨细胞病毒(CMV)立刻早期增强子；鸡β-肌动蛋白启动子；鸡β-肌动蛋白内含子；截短的c-myc 5’ UTR；前导(信号)肽cDNA；CR8033可变重链cDNA；恒定重链1 (CH1)：密码子优化的cDNA；CR8033 Fc链(CH2-3)；前导(信号)肽cDNA；通用轻链cDNA；恒定轻链cDNA；弗林蛋白酶识别位点；F2A接头；多腺苷酸化信号。
在某些实施方案中，流感A和/或流感B的载体元件可以变化。例如，如上说明的载体基因组，但没有AAV ITRs，可用于不同的表达***(例如杆状病毒、慢病毒、质粒、裸DNA)。本文描述了其它合适的用于AAV或非-AAV表达***的载体元件，包括，例如启动子、增强子、接头、polyA、内含子。
由包装在载体内的核酸分子携带的二个或更多个ORF可从两个表达盒表达，其中的一个或两个可以是双顺反子。
用于选择的免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)或其它元件(例如前导序列)的编码序列可被获得和/或合成。测序核酸(例如RNA和DNA)的方法是本领域技术人员已知的。一旦核酸的序列是已知的，有基于网络和市场上可买到的计算机程序，以及基于服务的公司，其反翻译氨基酸序列至核酸编码序列。见，例如通过EMBOSS, http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/的backtranseq；Gene Infinity (http://www.geneinfinity.org/sms/sms_backtranslation.html)；ExPasy (http://www.expasy.org/tools/)。在一个实施方案中，RNA和/或cDNA编码序列被设计用于在人细胞中的最佳表达。用于合成核酸的方法是本领域技术人员已知的且可被用于所有的，或部分的在此描述的核酸构建体。
密码子-最佳的编码区可用各种不同的方法设计。这种优化可使用在线获得的方法(例如GeneArt)、公布的方法，或提供密码子优化服务，例如如DNA2.0 (Menlo Park, CA)的公司执行。一个密码子优化算法被描述于例如美国专利申请号WO 2015/012924中，其通过引用结合到本文中。也见例如美国专利公布号2014/0032186和美国专利公布号2006/0136184。合适地，对于产品的开放阅读框(ORF)的全长被修饰。然而，在一些实施方案中，只有ORF的片段可被改变。通过使用这些方法之一，人们可应用任何给定的多肽序列的频率，并产生编码多肽的密码子-优化编码区的核酸片段。
为用于生产AAV病毒载体(如，重组(r) AAV)，可在任何合适的载体，例如，被递送至包装的宿主细胞的质粒上携带表达盒。可用于本发明的质粒可被工程改造，以致它们适合于复制和包装于原核细胞、哺乳动物细胞，或二者中。合适的转染技术和包装宿主细胞是已知的和/或可容易地由本领域技术人员设计。
生成和分离适合用作载体的AAVs的方法是本领域已知的。一般见例如Grieger &Samulski, 2005, "Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vectordevelopment, production and clinical applications", Adv. Biochem. Engin/ Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology", J. Gene Med. 10:717-733；和下文引用的参考文献, 其每一篇通过引用以其整体结合到本文中。对于包装转基因进入病毒体，ITRs是在于含有表达盒的核酸分子相同的构建体中顺式需要的唯一AAV成分。cap和rep基因可以反式供应。
在一个实施方案中，本文描述的表达盒被工程改造到遗传元件(如，穿梭质粒)中，其转染其上携带的免疫球蛋白构建体序列进入包装的宿主细胞，以供生产病毒载体。在一个实施方案中，选择的遗传元件可通过任何合适的方法，包括转染、电传孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA-涂层的颗粒、病毒感染和原生质体融合而递送至AAV包装细胞。稳定的AAV包装细胞也可制得。或者，表达盒可被用来生成并非AAV的病毒载体，或用于在体外产生抗体的混合物。用来制备这样的构建体的方法是核酸处理领域的技术人员已知的并包括遗传工程改造，重组工程改造，和合成技术。见例如分子克隆：实验室手册(MolecularCloning: A Laboratory Manual), ed. Green和Sambrook, Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor, NY (2012)。
AAV载体
如本文所用的，“AAV9衣壳”指具有GenBank登录号：AAS99264的氨基酸序列的AAV9，其通过引用结合到本文中。本发明涵盖来自这个编码序列的一些变化，其可包括与GenBank登录号：AAS99264和US7906111 (也即WO 2005/033321)中参考的氨基酸序列具有约99%同一性的序列(即，与参考序列少于约1%的变化。然而，在其它实施方案中，其它AAV9的变体，或与以上-参考的序列具有至少约95%同一性的AAV9衣壳可被选择。生产衣壳，因而编码序列的方法，和生产rAAV病毒载体的方法已被描述。见，例如Gao, et al, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)和US 2013/0045186A1。
术语"AAV9媒介"或“AAV9载体媒介”指组装的rAAV衣壳，其缺乏所需的包装在其中的基因组序列。这些也可被称为“空”衣壳。这样一种衣壳可含有表达盒的未可检测的基因组序列，或仅仅部分地包装的足以获得基因产品的表达的基因组序列。这些空衣壳对转移感兴趣的基因至宿主细胞是非-功能性的。
本文描述的重组腺相关病毒(AAV)可使用已知的技术生成。见例如WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。这样一种方法包括培养宿主细胞，其含有编码AAV衣壳的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重复序列(ITRs)和转基因构成的表达盒；和充分的允许表达盒的包装进入AAV衣壳蛋白的辅助功能。
简言之，细胞在合适的细胞培养(例如HEK 293)细胞中制备。生产本文描述的基因疗法载体的方法包括本领域熟知的方法，例如用于生产基因疗法载体的质粒DNA的形成，载体的形成，和载体的纯化。在一些实施方案中，基因疗法载体是AAV载体，而生成的质粒是编码AAV基因组和感兴趣的基因的AAV顺式-质粒，含有AAV rep和cap基因的AAV反式-质粒，和腺病毒辅助质粒。载体生成过程可包括诸如启动细胞培养、细胞传代、细胞接种、使用质粒DNA的细胞转染、转染后培养基交换为无血清培养基，和含有载体的细胞和培养基的收获的方法步骤。收获的含有载体的细胞和培养剂在此被称为天然细胞收获物。
天然细胞收获物此后可以经过方法步骤，例如载体收获物的浓缩、载体收获物的渗滤、载体收获物的微流化、载体收获物的核酸酶消化、微流化介质(microfluidizedintermediate)的过滤、通过色谱的粗纯化、通过超速离心的粗纯化、通过切向流过滤的缓冲液交换，和/或制备大容量(bulk)载体的制剂和过滤。
一种在阴离子交换树脂色谱之后在高盐浓度中的两步骤亲和色谱纯化被用来纯化载体药物产品并除去空衣壳。这些方法被更详细地描述于于2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,071和2015年12月11日提交，且标题为“用于AAV9的可扩展的纯化方法(Scalable Purification Method for AAV9)”的美国专利申请号62/226,357中，其通过引用结合到本文中。纯化方法对于AAV8是于2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,098，和2015年12月11日提交的美国专利申请号62/266,341，和对于rh10是于2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,055和2015年12月11日提交，且标题为“用于AAVrh10的可扩展的纯化方法(Scalable Purification Method for AAVrh10)”的美国专利申请号62/266,347，和对于AAV1是于2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,083和2015年12月11日提交，且标题为“对于AAV1的可扩展的纯化方法(Scalable Purification Method forAAV1)”的美国专利申请号62/26,351，通过引用全部结合到本文中。
为计算空的和实心颗粒含量，将选择的样本的VP3带体积(例如在本文的实施例中，碘克沙醇(iodixanol)梯度-纯化的制剂，其中GC的# = 颗粒的#)对标记的GC颗粒作图。生成的线性方程(y = mx+c)被用来计算在试验物品峰的所述带体积中颗粒的数目。每20 µL负载的颗粒(pt)数目然后乘以50，以得到颗粒(pt) /mL。Pt/mL除以GC/mL得到颗粒与基因组拷贝的比率(pt/GC)。Pt/mL–GC/mL得到空的pt/mL。空的pt/mL除以pt/mL并x 100得到空颗粒的百分比。
一般说来，测定空衣壳和具有包装的基因组的AAV载体颗粒的方法已是本领域已知的。见，例如Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al.,Molec. Ther. (2003) 7:122-128。为测试变性的衣壳，所述方法包括使处理的AAV贮库经历SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述凝胶由能够分离3种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如，含有在缓冲液中的3-8%三羟基氨基甲烷醋酸盐的梯度凝胶，然后使凝胶运行直至样本材料被分离，并将凝胶印迹到尼龙或硝基纤维素膜上，优选尼龙。然后将抗-AAV衣壳抗体用作结合于变性的衣壳蛋白的初次抗体，优选抗-AAV衣壳单克隆抗体，最优选B1抗-AAV-2单克隆抗体(Wobus et al.,J. Virol. (2000) 74:9281-9293)。然后使用二次抗体，即结合于初次抗体的抗体并包括用于检测与初次抗体结合的装置，更优选含有共价结合于它的检测分子的抗-IgG抗体，最优选共价连接于辣根过氧化物酶的羊抗-小鼠IgG抗体。检测结合的方法被用来半-定量测定初次和二次抗体之间的结合，优选能够检测放射性同位素发射、电磁辐射，或比色变化的检测方法，最优选化学发光检测试剂盒。例如，对于SDS-PAGE，可采集来自柱部分的样本并在含有还原剂(例如DTT)的SDS-PAGE上样缓冲液中加热，将衣壳蛋白溶解于预制的梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如Novex)中。银染法可使用SilverXpress (Invitrogen,CA)，依据制造商的指示或其它合适的染色方法，即SYPRO宝石红(SYPRO ruby)或科麦西染色(coomassie stains)执行。在一个实施方案中，在柱部分中的AAV载体基因组(vg)浓度可通过定量实时PCR (Q-PCR)测量。稀释样本并用DNase I (或另一种合适的核酸酶)消化以除去外源性DNA。在灭活核酸酶后，样本被进一步稀释并使用引物和对引物之间的DNA序列特异性的TaqMan™荧光检测探针扩增。对于每个样本，达到限定水平的荧光需要的循环数(阈值循环, Ct)在Applied Biosystems Prism 7700序列检测***(Applied BiosystemsPrism 7700 Sequence Detection System)上测量。含有与在AAV载体中含有的序列相同的序列的质粒DNA被采用，以生成Q-PCR反应中的标准曲线。从样本获得的循环阈值(Ct)数值被用来通过使它归一化至质粒标准曲线的Ct值，来测定载体基因组滴度。基于数字PCR的终点测定也可使用。
在一个方面，采用优化的q-PCR方法，其利用广谱的丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶K(例如可从Qiagen经商业买到)。更特别地，优化的qPCR基因组滴度测定类似于标准测定，除了在DNase I消化后，样本用蛋白酶K缓冲液稀释并用蛋白酶K处理，接着热灭活。合适的样本用蛋白酶K缓冲液以等于样本大小的量稀释。蛋白酶K缓冲液可以浓缩至2倍或更高。通常，蛋白酶K处理是约0.2 mg/mL，但可从0.1 mg/mL至约1 mg/mL变化。处理步骤一般在约55℃执行约15分钟，但可在较低的温度(例如约37℃-约50℃)执行较长的时间段(例如约20分钟-约30分钟)，或在更高温度(例如最高约60℃)执行较短的时间段(例如约5-10分钟)。类似地，热灭活一般是在约95℃约15分钟，但温度可以降低(例如约70-约90℃)和时间可以延长(例如约20分钟-约30分钟)。然后稀释样本(例如1000倍)并经受如于标准测定中描述的TaqMan分析。
另外地，或者作为选择，微滴式数字PCR (ddPCR)可被采用。例如，用ddPCR测定单链和自身互补AAV载体基因组滴度的方法已被描述。见，例如M. Lock et al, Hu GeneTherapy Methods，Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr; 25 (2): 115-25. doi:10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。
简言之，分离具有包装的基因组序列的rAAV9颗粒与缺乏基因组的AAV9媒介的方法包括使包含重组AAV9病毒颗粒和AAV 9衣壳媒介的悬浮液经受快速高效液相色谱，其中AAV9病毒颗粒和AAV9媒介结合于在pH 10.2平衡的强阴离子交换树脂，并经受盐梯度，同时监测洗脱液以供在约260和约280的紫外吸光度。虽然对于rAAV9不是最佳，pH可在约10.0-10.4的范围内。在这个方法中，当A260/A280的比率达到拐点时，从洗脱的部分收集AAV9完整衣壳。在一个实例中，对于亲和色谱步骤，渗滤的产品可被应用于Capture SelectTMPoros-AAV2/9亲和树脂(Life Technologies)，其有效地捕获AAV2/9血清型。在这些离子的条件下，显著百分比的残留的细胞DNA和蛋白流过柱，同时AAV颗粒被有效地捕获。
合适的制剂是缓冲至生理上相容的pH和盐浓度的水性悬浮液。任选地，一个或多个表面活性剂存在于制剂中。
合适的表面活性剂，或表面活性剂的组合，可选自非毒性的非-离子型表面活性剂中。在一个实施方案中，选择以伯羟基端接的双功能嵌段共聚物表面活性剂，例如Pluronic® F68 [BASF]，也称为泊洛沙姆188，其具有中性pH，具有8400的平均分子量。可选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即由聚氧乙烯(聚(氧化乙烯))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(氧化丙烯))的中心疏水链构成的非离子型三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15 (聚乙二醇(Macrogol)-15羟基硬脂酸)、LABRASOL (聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、TWEEN (聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一个实施方案中，制剂含有泊洛沙姆。这些共聚物通常用字母"P"命名(代表泊洛沙姆)，后接3个数字：首两个数字 x 100给出聚氧丙烯核心的大约分子质量，而最后的数字 x 10得到百分比聚氧乙烯含量。在一个实施方案中，泊洛沙姆188被选择。表面活性剂可以至多约0.0005 %-约0.001%的悬浮液的量存在。
用途和方案
在一个实施方案中，治疗流感和/或预防流感病毒的感染的方法包括共同给予在此提供的合成的FI6v3抗体和合成的CR8033抗体。任选地，这样一种被动免疫疗法可与传统疫苗，与另外的抗流感抗体，或与其它可选择的抗-病毒成分合并。
在某些实施方案中，两种抗体从不同的rAAV9载体共同表达。在另一个实施方案中，rAAV-介导的人工抗体递送与不同的抗体表达***合并。
优选地，载体悬浮于生理上相容的载质中，以供给予人或非-人哺乳动物患者。合适的载体可由本领域技术人员在考虑到转移病毒涉及的适应症后容易地选择。例如，一个合适的载体包括盐水，其可用各种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其它示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、麦芽糖，和水。载体的选择不是限制本发明。任选地，除了rAAV和载体，本发明的组合物还可含有其它常规药用成分，例如防腐剂，或化学稳定剂。
在某些实施方案中，两个不同的载体贮库(例如rAAV9.FI6v3 + rAAV9.CR8033)被分别配制。在这样一个实施方案中，它们可被分开递送，但基本上彼此同时，例如在数分钟-约1小时内。在某些实施方案中，两个不同的载体贮库被混合并合并成以供给药的单一的组合物。无论是否分开递送或以组合的悬浮液递送，两个载体贮库以基于基因组拷贝的约1:1比例混合。在其它实施方案中，这个比例可以改变，例如从约3:1、约2:1至约1:2 (基于总基因组拷贝)。
在某些实施方案中，rAAV9制剂是含有悬浮于磷酸盐-缓冲盐水(PBS)中的有效量的AAV载体的悬浮液，所述PBS具有约200 mM、0.001% (w/v) Pluronic F68和5%甘油的总浓度。合适地，制剂被调节至生理学上可接受的pH，例如在pH 6-9，或pH 6.5-8, pH 7.0-7.7，或pH 7.2-7.8的范围内。然而，在最广泛的范围和这些子范围内的其它pHs可被选择以供其它途径递送。
在一个实施方案中，制剂可含有，例如，至少约1 x 109 GC/mL-3 x 1013 GC/mL的浓度，如在例如M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods.2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14中所述，通过oqPCR或数字微滴PCR (ddPCR)测量的，其通过引用结合到本文中。
在某些实施方案中，如在此提供的组合物被配制用于鼻内递送。本发明涵盖包含药剂盒的产品，其包括用于本发明的组合物的鼻内递送装置和容器，任选地含有其它成分，例如稀释剂等。
在某些实施方案中，鼻内递送装置提供气雾剂喷射器，其递送具有大小约30微米-约100微米的平均大小范围的粒子薄雾。在某些实施方案中，平均大小范围是约10微米-约50微米。合适的装置已描述于文献中，而一些是市场上可买到的，例如，LMA MAD NASAL™(Teleflex Medical; Ireland); Teleflex VaxINator™ (Teleflex Medical;Ireland)；购自Kurve Technologies的控制颗粒分散仪(Controlled ParticleDispersion®) (CPD)。也见，PG Djupesland, Drug Deliv and Transl. Res (2013) 3:42-62。在某些实施方案中，递送的颗粒大小和体积被控制以优先靶向鼻上皮细胞并使靶向肺的最少。在其它实施方案中，颗粒的薄雾是约0.1微米-约20微米，或更少，以递送至肺细胞。这样的较小颗粒大小可最大限度地减少在鼻上皮细胞中的停留。
任何合适的方法或途径可被用来给予如在此描述的含AAV的组合物，并任选地，用来共同给予与本文描述的AAV-介导的抗体组合的其它活性药物或疗法。给药途径包括，例如，***的、口服、静脉内、腹膜内、皮下，或肌内给予。
在一个实施方案中，提供含有在如本文描述的缓冲溶液中的rAAV的、呈冷冻形式的冷冻组合物。任选地，一个或多个表面活性剂(例如Pluronic F68)、稳定剂或防腐剂存在于该组合物中。合适地，为了应用，组合物被解冻并用合适的稀释剂，例如无菌盐水或缓冲盐水滴定至所需剂量。
任选地，本文描述的组合物可与其它抗-病毒药物和/或对抗其它病毒靶标的疫苗，包括其它流感疫苗，包括：流感A、流感B和流感C的疫苗组合使用。A型病毒是毒力最强的人类病原体。与大流行有关的流感A的血清型包括，H1N1，其引起1918年西班牙流感，和2009年的猪流感；H2N2，其引起1957的亚洲流感；H3N2，其引起1968年香港流感；H5N1，其引起2004的禽流感；H7N7；H1N2；H9N2；H7N2；H7N3；和H10N7。对抗流感A的广泛的中和抗体已被描述。如本文所用的，“广泛的中和抗体”指可中和来自多个亚型的多个毒株的中和抗体。例如，CR6261 [The Scripps Institute/ Crucell]已描述为单克隆抗体，其结合于广泛范围的流感病毒包括1918年"西班牙流感" (SC1918/H1)和结合于2004年在越南从鸡突然传播至人的禽流感H5N1型病毒(Viet04/H5)。CR6261识别一种在血细胞凝集素(流感病毒表面上的主要的蛋白)的膜-最接近的茎中的高度保守的螺旋状区。该抗体描述于WO 2010/130636中，通过引用结合到本文中。另一种中和抗体，F10 [XOMA Ltd]已被描述为对抗H1N1和H5N1有用的。[Sui et al, Nature Structural and Molecular Biology (Sui, et al. 2009,16(3):265-73)]。可选择对抗流感的其它抗体，例如Fab28和Fab49。见，例如WO 2010/140114和WO 2009/115972, 其通过引用结合于此。还有的其它抗体，例如在WO 2010/010466、US公布专利公布号US/2011/076265，和WO 2008/156763中描述的那些，可容易地被选择。
使用这些rAAV，例如用于被动免疫的方法例如在WO 2012/145572中描述。递送和应用的其它方法对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，除了本文描述的一个或多个组合，如在此描述的疗法还可包括与生物药物、小分子药物、化疗剂、免疫增强剂、放射、手术等的一个或多个的组合。如在此描述的生物药物是以肽、多肽、蛋白、酶、核酸分子、载体(包括病毒载体)等为基础的。
在组合疗法中，在此描述的AAV-递送的免疫球蛋白构建体在开始用另一种药剂，例如抗-病毒疗法、抗体，及其任何组合的疗法之前, 期间，或之后，即在开始所述疗法之前和期间，之前和之后，期间和之后，或之前、期间和之后给予。例如，AAV可在开始疗法之前1和30天，优选3和20天之间，更优选在5和12天之间给予。
如上所述，术语“约”当用来修饰数值时，意指±10%的变化，除非另外指明。
如本说明书和权利要求书通篇所用的，术语“包含”和“含有”及其变体包括，“包含”、“包括”、“含有”和“涵盖”，及其它变体，包含其它成分、元件、整数、步骤等。术语“由…组成”或“由…构成”不包含其它成分、元件、整数、步骤等。
术语"相同的"或百分比"同一性"，在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，指是相同的或具有指定百分比的氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列或对比特定区(例如当与比较窗口或指定区比较和比对最大的一致时，在此提供的任何一个修饰的ORFs)是相同的(即，约70%同一性，优选75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或更高同一性的核苷酸，如使用具有下述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过手动比对和目视检查(见，例如NCBI网站等)所测定的。作为另一个实施例，聚核苷酸序列可使用Fasta，一种GCG版本6.1的程序比较。Fasta提供查询和搜索序列之间最好的重叠区的比对和百分比序列同一性。例如，核酸序列之间的百分比序列同一性可使用具有其默认参数的Fasta (6个字长和用于评分矩阵的NOPAM因素)测定，如在GCG版本6.1中提供的，通过引用结合到本文中。一般来说，这些程序以默认设置使用，虽然本领域技术人员在需要时可改变这些设置。或者，本领域技术人员可利用提供如同通过参考的算法和程序提供的至少同一性或比对水平的另一种算法或计算机程序。这个定义也指，或可应用于序列的符合度。该定义也包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些。如下所述的，优选的算法可解释缺口等。优选地，同一性存在于为至少约25、50、75、100、150、200个氨基酸或核苷酸长度的区域，和常常存在于为至少225、250、300、350、400、450、500个氨基酸或核苷酸长度的区域或氨基酸或核酸序列的全长。
通常，当比对基于氨基酸序列准备时，比对包括相对于参考AAV序列的如此确定的***和缺失，且氨基酸残基的编号是基于对于比对提供的参考标度。然而，任何给定的AAV序列可具有比参考标度更少的氨基酸残基。在本发明中，当讨论亲代序列时，术语“相同的位置”或“对应的位置”指位于每个序列中相对于比对序列的参考标度的相同残基编号的氨基酸。然而，当取出比对时，每个蛋白可具有位于不同的残基编号的这些氨基酸。比对使用任何各种公开的或市场上可买到的多个序列比对程序(Multiple Sequence AlignmentPrograms)执行。用于氨基酸序列的序列比对程序是可获得的，例如，“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“ BLOCKMAKER”、“MEME”，和“匹配箱(Match-Box)”程序。一般来说，任何这些程序以默认设置使用，虽然本领域技术人员在需要时可改变这些设置。或者，本领域技术人员可利用提供如同通过参考的算法和程序提供的至少同一性或比对水平的另一种算法或计算机程序。见，例如J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensivecomparison of multiple sequence alignments”, 27 (13): 2682-2690 (1999)。
如本文所用的，“有效量”指在靶标细胞中递送和表达足以减轻或预防流感感染的抗-流感抗体的量的rAAV9组合物的量，有效的量可基于动物模型，而不是人类患者测定。合适的鼠科动物模型的实例在本文描述。
如本文所用的，术语"患者"一般指诊断或处于流感感染风险的人。这样的患者也可在此称为"受试者"。术语"受试者"也可指非-人动物，例如猫、狗，和非-人灵长类动物。
“功能性抗体”可以是抗体或免疫球蛋白，其以足够的结合亲和力结合于选择的靶标(例如癌细胞或病原体，例如病毒、细菌，或寄生虫上的抗原)以影响所需生理结果，其可以是保护性的(例如被动免疫)或治疗性的。
如本文所用的，“免疫球蛋白结构域”指相对于常规的全长抗体限定的抗体重链或轻链的结构域。更特别地，全长抗体包含含有以下4个结构域的重(H)链多肽：一个N-末端可变(VH)区和3个C-末端恒定(CH1、CH2和CH3)区和含有以下两个结构域的轻(L)链多肽：一个N-末端可变(VL)区和一个C-末端恒定(CL)区。Fc区可含有两个结构域(CH2-CH3)。Fab区可含有一个恒定区和一个可变区用于每个重链和轻链。恒定区同种抗免疫球蛋白适合于可包含例如G1m17.1和G1m3的那些构建体。
如本文所用的，“不同的特异性”表示参考的免疫球蛋白构建体(如，全长抗体、重链，或其它能够结合特异性靶标的构建体)结合于不同的靶点。这些可指相同抗原上的不同的靶标，相同癌的不同的毒株(例如不同的病毒毒株)或指不同的抗原。
"相同的特异性"指免疫球蛋白结合于可存在于病原体的多个毒株(如，流感病毒)或单一病毒，或病毒毒株亚型或其它病原体中的特异性靶点的能力。合适地，这些特异性对非-靶点没有显著的或可测量的结合。
术语“异源性”当涉及蛋白或核酸使用时，表示蛋白或核酸包含在性质上彼此相同关系中未发现的两个或更多个序列或子序列。例如，通常从不相关的被安排制备新功能性核酸的基因重组地产生具有两个或更多个序列的核酸。例如，在一个实施方案中，核酸具有从一个被安排从不同的基因直接表达编码序列的基因的启动子。因此，相对于编码序列，启动子是异源性的。术语“异源性轻链”是含有来自具有不同于重链特异性的靶标特异性的抗体的可变区和/或恒定区的轻链。
如说明书通篇使用的，术语"一"或"一个"指一个或多个。同样，术语"一" (或"一个")、"一个或多个"和"至少一个"在此可互换使用。
除非在本说明书中另外指定，在此所用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员和通过参考公布的正文(其提供本领域技术人员对用于本申请的许多术语的一般指导)通常理解的相同意义。
以下实施例说明生产和使用AAV2/9载体的混合物的方法，其中一种表达对流感A的广泛的中和抗体(称为FI6)；其它的表达对流感B的广泛的中和抗体(称为CR8033)。在一个实施方案中，在此称为GTP101的组合物在具有总盐浓度达到200 mM、0.001% (w/v)Pluronic F68和5%甘油的磷酸盐-缓冲盐水(PBS)中配制。AAV2/9将在稀释成4个剂量水平的无菌缓冲溶液后经鼻内(IN)给予。初始剂量水平已基于临床前有效性数据选择，并将基于非临床安全性评估，用可获得的无AAV载体颗粒聚集的浓度限制的最高剂量改进。剂量范围是从3x1012至2.4x1013基因组拷贝(GC)，作为4 x 0.2 ml/每鼻孔经由鼻内粘膜雾化装置(IMAD)给予。应该理解，本发明涵盖有关这些示例性研究的变化。例如，可使用鼻内给药的其它装置、其它剂量、体积，和其它方案。另外地，组合物可适用于其它给药途径。
以下实施例仅仅是示例性的并不是对在此描述的本发明的限制。
实施例1：AAV载体
在杂合巨细胞病毒增强子鸡β-肌动蛋白启动子的控制下，表达FI6v3和CR8033单克隆抗体的重链和轻链的AAV9载体被设计、克隆和包装。用来构建用于以下研究的每个载体的顺式-质粒在SEQ ID NO: 1 (FI6v3)和SEQ ID NO: 8 (CR8033)中提供，其通过引用与它们的特征结合于此。AAV9载体使用先前例如在美国专利公布申请号US 2009/0275107中描述的技术，使用人HEK 293 MCB细胞的三重转染生成；也见M. Lock et al, Hum GeneTher, 2010; 21(10): 1259-1271。
人HEK 293 MCB细胞用以下质粒转染：(i) 载体基因组质粒，(ii) 称为pAAV2/9.KanR (含有AAV rep2和cap 9野生型基因)的AAV辅助质粒和(iii) 称为pAdΔF6(Kan)的辅助腺病毒质粒。GTP101包装的载体基因组的大小是1) AAV-FI6: 4650nt.和2) AAV-CR8033: 4585nt。利用杆状病毒***的生产细胞系，也可使用其它方法。备选的顺式-质粒和载体可使用在此提供的其它编码序列生成。
A.GTP101 AAV载体基因组质粒1: pAAV.CB7.CI.FI6.RBG
AAV-FI6 mAb载体基因组质粒pAAV.CB7.CI.FI6.RBG (p3193)大小是7,471 bp。源自这个质粒的载体基因组是具有AAV2衍生的侧接mAb表达盒的ITR的单链DNA基因组。FI6编码序列编码对流感A特异性的mAb。从转基因盒的表达由CB7启动子(巨细胞病毒(CMV)立刻早期增强子(C4)和鸡β肌动蛋白启动子之间的杂合体)驱动，而自这个启动子的转录因鸡β肌动蛋白内含子(CI)的存在而增强。人c-myc基因的5’非翻译区(UTR)定位于mAb编码区的上游作为翻译增强子。用于表达盒的polyA信号是兔β-球蛋白(RBG) polyA。前导(信号)肽在抗体的重链和轻链二者之前并介导抗体从转导的细胞的分泌。重链和轻链由含有弗林蛋白酶裂解位点和FMDV 2A序列的接头分开。这个接头介导重链和轻链的翻译后裂解，而例外是单个氨基酸取代(重链中的末端赖氨酸用精氨酸残基取代)，被从最终mAb产品完全除去。包含5’ UTR和密码子优化的mAb编码序列的抗体翻译盒被重新合成并亚克隆到pZac2.1中以制备p3191。基因盒随后使用NheI/NotI酶穿梭进入CB7骨架，pN406，用抗体翻译盒替代多接头，以得到pAAV.CB7.CI.FI6.RBG (p3193)。质粒的所有组成部分已通过用QiagenGenomic Services直接测序来证实。
B.GTP101 AAV载体基因组质粒2: pAAV.CB7.CI.CR8033.RBG
AAV-CR8033 mAb载体基因组质粒pAAV.CB7.CI.CR8033.RBG (p3523)大小是7,462bp。源自这个质粒的载体基因组是具有AAV2衍生的侧接mAb表达盒的反向末端重复序列(ITR)的单链DNA基因组。CR8033编码序列编码对流感B特异性的mAb。从转基因盒的表达由CB7启动子(巨细胞病毒(CMV)立刻早期增强子(C4)和修饰的鸡β肌动蛋白启动子之间的杂合体)驱动，而从这个启动子的转录因鸡β肌动蛋白内含子(CI)的存在而增强。人c-myc基因的截短的5’ UTR定位于mAb编码区的上游作为翻译增强子。用于表达盒的polyA信号是兔β-球蛋白(RBG) polyA。前导(信号)肽在抗体的重链和轻链二者之前并介导抗体从转导的细胞的分泌。重链和轻链由含有弗林蛋白酶裂解位点和FMDV 2A序列的接头分开。这个接头介导重链和轻链的翻译后裂解，而例外的是单个氨基酸取代(重链中的末端赖氨酸用精氨酸残基取代)，从最终mAb产品完全除去。包括5’非翻译区和编码TCN032 mAb的密码子优化的mAb编码序列的抗体翻译盒被重新合成，并亚克隆到pZac2.1中以制备p3187。TCN032的轻链使用EcoRV/BsiWI酶位点，用源自上述的pAAV.CB7.CI.FI6.RBG (p3193)的“通用”轻链替代。CR8033可变重链编码序列已经密码子优化、重新合成并将被用来经由SphI/SalI限制性位点替代TCN032可变重链。整个翻译盒将使用SphI/NotI酶穿梭进入CB7启动子骨架质粒，pN437，用CR8033翻译盒替代TCN032翻译盒并生成质粒pAAV.CB7.CI.CR8033.RBG (p3523)。质粒的所有组成部分通过用Qiagen Genomic Services直接测序来证实。
C. 卡那霉素骨架克隆
来自(pAAV.CB7.CI.FI6.RBG (p3193)和pAAV.CB7.CI.CR8033.RBG (p3523)二者的转基因盒将被克隆进入AAV2 ITR-侧接的构建体。这个构建体中的质粒骨架源自pZac2.1(一种基于pKSS的质粒)，并含有卡那霉素抗性基因。最终的载体基因组质粒是pAAV.CB7.CI.FI6.RGB.KanR和pAAV.CB7.CI.CR8033.RBG.Kan。最终的载体基因组质粒的所有组成部分将通过测序证实，而该序列作为GMP制备过程的部分被证实。
D.序列元件的描述
1. 反向末端重复序列(ITR): AAV ITRs (GenBank # NC001401)是两端相同，但朝向相反的序列。当AAV和腺病毒辅助功能以反式提供时，AAV2 ITR序列作为载体DNA复制的来源和载体基因组的包装信号二者起作用。因此，ITR序列仅仅表示载体基因组复制和包装需要的顺式序列。
2. 巨细胞病毒(CMV)立刻早期增强子(260 bp, C4; GenBank # K03104.1)。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
3. 鸡β-肌动蛋白启动子(281 bp; CB; GenBank # X00182.1)启动子被用来驱动高-水平抗体表达。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
4. 鸡β-肌动蛋白内含子：来自鸡β肌动蛋白基因的875 bp内含子(GenBank #X00182.1)存在于载体表达盒中。内含子被转录，但通过剪接，将其任一侧的序列结合在一起，从成熟的mRNA除去。内含子在表达盒中的存在已显示促进mRNA从核向细胞质的转运，因而促进用于翻译的稳定水平的mRNA的积聚。这是旨在增加基因表达水平的基因载体的普通特征。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
5. C-myc 5’ UTR:智人v-myc鸟类骨髓细胞瘤病病毒致癌基因同系物(MYC) mRNA(GenBank登录号NM002467)的核苷酸381-428。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
6. 前导(信号)肽cDNA：在FI6重链之前并与其在框中的密码子优化的cDNA序列(GenBank登录号AAB8686.1)被合成。
7. FI6v3可变重链cDNA：密码子优化的人cDNA序列(GenBank登录号AEL31303.1)被合成。
8. 前导(信号)肽cDNA：在CR8033重链之前并与其在框中的密码子优化的cDNA序列(描述于[Zhang, L., Q. Leng，和A.J. Mixson, J Gene Med, 2005. 7(3): p. 354-6]的ILco2)被合成。
9. CR8033可变重链cDNA：密码子优化的人cDNA序列(GenBank登录号AFP87542.1)被合成。
10. 恒定重链1 (CH1)：密码子优化的cDNA (GenBank登录号BAF64540.1)被合成。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
11. CR8033 Fc链(CH2-3)：密码子优化的cDNA (GenBank登录号226787，除了C-末端赖氨酸用精氨酸替代外)被合成。
12. FI6 Fc链(CH2-3)：密码子优化的cDNA (GenBank登录号2J6E_A，除了C-末端赖氨酸用精氨酸替代和天冬氨酸被谷氨酸替代的位置57外)由GeneArt合成。
13. 前导(信号)肽cDNA：在通用轻链(描述于[Zhang et al，引用同上]中的ILhy1)之前的密码子优化的cDNA序列被合成。
14. 通用轻链cDNA：密码子优化的人cDNA序列(GenBank登录号ACJ71709.1)被合成。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
15. 恒定轻链cDNA：密码子人序列(GenBank登录号AGH70219.1)被合成。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
16. 弗林蛋白酶识别位点：精氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸和密码子优化的cDNA被合成。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
17. F2A接头：源自FMDV (GenBank # CAA2436.1)的24个氨基酸的肽和密码子优化的cDNA被合成。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
18. 多腺苷酸化信号：127 bp兔β-球蛋白多腺苷酸化信号(GenBank # V00882.1)提供用于抗体mRNA的有效多腺苷酸化的顺式序列。这个元件作为转录终止(在新生转录物的3’端的特异性裂解事件)并加入长的多腺苷酸尾的信号起作用。这个元件存在于两种载体基因组质粒中。
E.AAV2/9辅助质粒pAAV2.9.KanR
这个AAV2/9辅助质粒p5E18.AAV2/9n (p0061; 7330bp)是编码来自AAV血清型9的4个野生型AAV2 rep蛋白和3个野生型AAV VP衣壳蛋白的AAV辅助质粒[J Virol. 2004 Ju;78(12): 6381-8]。
为了创立嵌合包装构建体，来自质粒p5E18的AAV2 cap基因，含有野生型AAV2 rep和cap基因，被除去并用从肝DNA扩增的AAV2/9 cap基因的PCR片段替代，以得到质粒p5E18VD2/AAV2/9。注意通常驱动rep表达的AAV p5启动子在这个构建体中从rep的5’端移至cap的3’端。这种排列起着在启动子和rep基因(即质粒骨架)之间引入间隔区，下调rep的表达并增加支持载体生产的能力的作用。p5E18中的质粒骨架来自pBluescript KS。质粒的所有组成部分通过直接测序来证实。氨比西林抗性基因将被卡那霉素抗性基因替代，以得到pAAV2/9n.KanR。
F. pAdDeltaF6(Kan)腺病毒辅助质粒
质粒pAdDelta (∆)F6(Kan)的大小是15,774 bp。质粒含有对AAV复制是重要的腺病毒基因组的区，即E2A、E4和VA RNA (腺病毒E1功能由293细胞提供)，但不含其它腺病毒复制或结构基因。质粒不含对复制至关重要的顺式元件例如腺病毒反向末端重复序列，因此不期望生成感染性腺病毒。其源自Ad5 (pBHG10，基于pBR322的质粒)的E1、E3缺失的分子克隆。将缺失引入Ad5 DNA以除去不必要的腺病毒基因的表达并从32Kb至12kb减少腺病毒DNA的量。最终，氨比西林抗性基因被卡那霉素抗性基因替代，以得到pAd∆F6(Kan)。保留在这个质粒中的E2、E4和VAI腺病毒基因，连同存在于HEK293细胞中的E1，对AAV载体生产是必要的。
实施例2 -制备过程
细胞在Corning 10层Cell Stacks (CS-10)和HS-36中培养，并且所有的开放操作在ISO 5级环境中的二级生物安全柜(class II biosafety cabinets)中执行。可能的话，纯化过程在封闭***中执行，然而，柱色谱操作不视为完全的封闭***。为使这个风险最小化，一次性使用流路径被用作GE ReadyMate柱色谱生产平台的部分。柱色谱纯化后，产物用最终制剂缓冲液(1x PBS (200 mM NaCl) 0.001% Pluronic F68、5%甘油)渗滤并经无菌过滤得到BDS，其于≤ -60℃冷冻。BDS测试后，将BDS解冻、合并，并在必要时用无菌最终制剂缓冲液稀释并在它们的填充套件(Fill Suite)中以SAFC填充。在GTP101的两种载体成分被分别制备的情况下，在填充前将各成分以1:1的比例混合。
制备过程的概观在图2中给出。
A. 细胞接种：HEK 293细胞表达用于高-滴度rAAV生产所需的E1a和E1b基因产物。HEK293细胞是附着的和高度可转染的，在DNA质粒转染时产生高-滴度的rAAV。使用CorningT-形烧瓶和CS-10，将细胞扩增至5x109-5x1010细胞，其将允许生成充分的细胞质量以供接种20份HS-36，用于每BDS批次载体生产。细胞将在由Dulbecco’s改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)组成的，补充有10% γ辐照的、源自NewZealand的胎牛血清(FBS)的培养基中培养。细胞是锚固依赖性的，并且细胞解离将使用TrypLE Select，一种非-动物细胞解离试剂实现。细胞接种使用无菌的、一次性使用的生物处理袋和管道装置完成。细胞将维持在37℃ (± 1℃)、5% (± 0.5%) CO2气氛中。
B. 瞬时转染：生长(DMEM培养基 + 10% FBS) 3天后，HS-36细胞培养基将用新鲜的、无血清DMEM培养基替换并用3种生产质粒，使用优化的基于PEI的转染方法转染。用于生产过程的所有质粒将由Aldevron Inc. 在其GMP-Source™质量***和基础设施下，利用cGMP生产的最显著的特征：可追溯性、文件控制和材料隔离来生产。
足够的DNA质粒转染复合物将在BSC中制备以转染20份HS-36 (每BDS批次)。最初，制备含有3.0 mg pAAV.CB7.CI.FI6.RBG.KanR或pAAV.CB7.CI.CR8033.RBG.KanR载体基因组质粒、60mg pAdDeltaF6(Kan)、30mg pAAV2.rh10.KanR AAV辅助质粒和GMP级PEI(PEIPro, PolyPlus Transfection SA)的DNA/PEI混合物。在其中采用混合载体基因组质粒转染的备选的情况下，将使用各1.5mg的两个顺式质粒。充分混合后，允许溶液于室温下静置25 min，然后加入到无血清的培养基中以猝灭反应，然后加入到HS-36中。转染混合物在HS-36的所有36层之间平衡，细胞于37℃ (±2℃)在5% (± 0.5%) CO2气氛中培养5天。
C. 细胞培养基收获：使用一次性生物处理袋，通过将培养基无菌地排出单元，从每个HS-36收获转染细胞和培养基。收获培养基后，约80升体积用MgCl2补充至最终浓度2mM (全能核酸酶的辅因子)，并将全能核酸酶(Cat#: 1.016797.0001, Merck Group)加入至最终浓度25单位/ml。产物(在一次性生物处理袋中)将于37℃培养器中培养2hr，以提供足够的时间用于因为转染程序导致的收获物中存在的残留细胞和质粒DNA的酶促消化。这个步骤被执行以使残留的DNA在最终载体FDP中的量最少。培养期后，将NaCl加入至最终浓度500 mM，以帮助在过滤和下游切向流过滤期间回收产物(见以下步骤4和5)。
D. 澄清：细胞和细胞碎片将使用深度滤囊(1.2 µm/0.22 um)从产物除去，所述深度滤囊与通过蠕动泵驱动的无菌的、封闭管道***和袋组件串联连接。澄清确保下游滤器和色谱柱将被保护以免积垢，而生物负荷减少过滤确保在滤器串结束时，在上游生产过程中潜在引入的任何生物负荷将在下游纯化之前除去。培养基将通过Sartorius SartoguardPES囊式滤器(1.2/0.22 µm) (Sartorius Stedim Biotech Inc.)。
E. 大规模切向流过滤：澄清产物的体积减少(10-倍)将使用由Spectrum Labs生产的一个定制的无菌、封闭的生物处理管道***、袋和膜套件，使用切向流过滤(TFF)获得。TFF的原理是溶液在平行于合适孔隙率(100 kDa)的膜的压力下流动。压力差驱使更小尺寸的分子通过膜并有效进入废物流，同时留下大于膜孔的分子。通过再循环溶液，平行流扫过膜表面以防止膜孔积垢。通过选择适宜的膜孔大小和表面面积，液体样本可快速减少体积，同时保留和浓集所需分子。在TFF应用中的渗滤包括以液体通过膜并达到废物流相同的速率，加入新鲜缓冲液至再循环样本中。随着渗滤体积的增加，从再循环样本除去的小分子的量增加。这导致澄清产物的适度纯化，但也获得与随后的亲和柱色谱步骤相容的缓冲液交换。因此，100 kDa，PES膜(Spectrum Labs)被用于浓缩液，其随后用由20 mM Tris pH 7.5和400 mM NaCl组成的4体积缓冲液渗滤。渗滤产物将于4℃贮存过夜，然后用1.2 µm/0.22um深度滤囊进一步澄清以除去任何沉淀的材料。
F. 亲和色谱：渗滤产物将被施加于Capture SelectTM Poros- AAV2/9亲和树脂(Life Technologies)，其有效地捕获AAV2/9血清型。在这些离子条件下，显著百分比的残留的细胞DNA和蛋白流通过柱，同时AAV颗粒被有效地捕获。施加后，洗涤柱以除去另外的进料杂质，接着是低pH步骤洗脱(400 mM NaCl、20 mM柠檬酸钠; pH 2.5)，其通过收集到1/10体积的中和缓冲液(Bis Tris Propane, 200 mM, pH 10.2)中立即中和。
G. 阴离子交换色谱：为获得包含空AAV颗粒的过程中杂质的进一步减少，Poros-AAV2/9洗脱池被稀释50-倍(20 mM Bis Tris Propane、0.001% Pluronic F68; pH 10.2)，以减少离子强度，以能够结合于CIMultus Q整体基质(BIA Separations)。在低-盐洗涤后，使用60 CV NaCl线性盐梯度10-180 mM NaCl洗脱载体产物。这种浅盐梯度有效地分离无载体基因组的衣壳颗粒(空颗粒)与含有载体基因组的颗粒(完整颗粒)，并导致制剂在很大程度上避免了空衣壳。级分被收集到含有1/100体积的0.1% Pluronic F68和1/27体积的BisTris pH 6.3的管中，以最大限度地分别减少与管的非-特异性结合和暴露于高pH的时长。峰纯度和得量的洗脱级分通过qPCR鉴定，合并并于4℃贮存直至使用TFF最终配制。AEX库qPCR滴度数据将被用来估算靶标最终体积，以获得用于最终制剂的2x1013 GC/ ml的滴度(步骤紧接于下面)。
H. 最终制剂和无菌过滤得到BDS：TFF将被用来在合并的AEX部分与100 kDa膜(Spectrum Labs, Inc.)上获得最终制剂。这个将用4体积的制剂缓冲液(1x PBS (200 mMNaCl) 0.001% Pluronic F68、5%甘油)通过渗滤获得，并浓缩至计算的体积以获得靶标浓度。渗滤后，产品将通过0.22 um滤器(Millipore, Billerica, MA)最终过滤得到BDS。样本将被移去以供BDS测试(描述于以下部分)。过滤的纯化的原液(Purified Bulk)将在无菌聚丙烯管中贮存并在隔离地方于≤-60℃冷冻直至用于最终填充的释放。
I. 最终填充：融化冷冻的BDS (并在需要时合并)并填充到West Pharmaceutical的“Ready-to-Use” (预先灭菌)的2 ml玻璃小瓶和13 mm塞，以填充体积≥0.6ml至≤2.0ml每小瓶密封。填充操作将依据由技术人员和SAFC的工艺鉴定试验支持的标准填充操作进行。在最终填充完成时，处理填充套件的所有操作员在他们离开BSC时，将在其无菌手套上用RODAC板监测(以检测可见的颗粒)。BSC表面也将在填充结束时监测活的生物体。SAFC QC将检查小瓶的外观、颗粒、体积和完整性。分别标记的小瓶将被标记以包括方案编号、产品名称、批号、分配号并贮存于标记的盒中。将标记的小瓶转移至隔离区≤-60℃直至释放。
J.ddPCR GC滴度：定量PCR (qPCR)基因组拷贝(GC)滴定的准确性和可靠性对于AAV质量控制和载体剂量是最重要的。基因组滴度将通过基于微滴式数字PCR的新qPCR技术测量[Lock, M., et al., Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digitalPCR. Hum Gene Ther Methods, 2014. 25 (2): p. 115-25]，其得到无可比拟的准确性和再现性。DNA检测将使用序列特异性引物和靶向FI6和CR8033编码区的荧光标记的探针完成，以允许FDP中的成分基因组的定量。此外，靶向RBG polyA区的引物和探针将被用来测定FDP的总基因组含量。许多标准、验证样本和对照(对于背景和DNA污染)已被引入该测定中。测定将通过建立和定义测定参数包括灵敏性、检测限度、质量鉴定范围及内部和批间分析的精确度来限定。使用新开发的生产过程生产的内部AAV2/9参考批次将被建立并用来执行质量研究。注意，发明人的先前的经验提示，通过微滴式数字PCR获得的滴度一般为通过发明人标准pPCR技术获得的滴度的2-倍。一旦这个测定滴度的新方法是合格的，描述于部分6和8中的用于初步研究的所有先前的试验物品将被再-测定且剂量将被调整。这个可影响用于非临床和临床研究的实际质量，虽然期望是差异不大于2-倍。
L. 感染滴度：感染单位(IU)测定被用来测定GTP101载体在RC32细胞(rep2表达HeLa细胞)中的高效的吸收和复制。96-孔终点格式板已经类似于先前公布的那样使用。简言之，RC32细胞被系列稀释的GTP101 BDS和统一稀释Ad5 (每个稀释的rAAV有12个复制)共同感染。感染后72小时，细胞溶解，执行qPCR以检测rAAV载体的超过输入的扩增。终点稀释TCID50计算(Spearman-Karber)被执行以测定复制的滴度(表示为IU/ml)。因为“感染性”值取决于与细胞接触的颗粒、受体结合、内在化、转移至核和基因组复制，它们受测定几何学和在所用细胞系中适宜的受体和结合后途径的存在的影响。受体和结合后途径通常并不维持在无限增殖化细胞系中，因而感染性测定滴度不是存在的“感染”颗粒数目的绝对量度。然而，衣壳包裹的GC与“感染单位”的比例(描述为GC/IU比例)可被用作批与批之间产品一致性的量度。
M. 宿主细胞(人) DNA
qPCR测定将被用来检测BDS中残留的人293 DNA。掺入“非-相关DNA”后，总DNA(非-相关的载体和残留的基因组)从~1 ml产物中提取。宿主细胞DNA使用靶向18S rDNA基因的qPCR定量。检测的DNA的量基于掺入的非-相关DNA的回收率被归一化。
N. 宿主细胞(人)蛋白
ELISA将在BDS样本上执行以测量污染宿主HEK293细胞蛋白的水平。CygnusTechnologies HEK 293宿主细胞蛋白第二代ELISA试剂盒被使用。样本和预先稀释的HEK293 HCP标准品被加入到用亲和纯化的抗-HEK 293 HCP捕获抗体预先包被的微量滴定孔中，连同加入过氧化物酶缀合的单克隆抗-HEK 293 HCP检测抗体。培养后，洗涤各孔以除去未结合的反应物，并加入TMB，过氧化物酶底物。显色后，使用硫酸溶液终止反应。生成的有色产物的吸光度将使用微孔板读出仪测量，而每个样本中的HEK 293 HCP的量从标准曲线计算。
O. 具有复制能力的AAV (rcAAV)
作为BDS测试计划的部分，将对GTP101 FDP的样本分析具有复制能力的AAV2/9(rcAAV)的存在，其可有效地在生产过程中产生。已开发由基于细胞的扩增和传代组成的3代测定，接着通过实时qPCR (cap 9靶标)检测rcAAV DNA。基于细胞的成分由测试样本和野生型人腺病毒5型(Ad5)稀释液与HEK293细胞(P1)的接种单层组成。1010 DRP的载体产品将是测试的最大量的产品。由于腺病毒的存在，具有复制能力的AAV将在细胞培养中扩增。两天后，细胞溶胞产物生成和Ad5经热灭活。然后澄清的溶胞产物被通入第二轮细胞(P2)以使灵敏性最大化(再次存在Ad5)。两天后，细胞溶胞产物生成和Ad5经热灭活。然后澄清的溶胞产物被通入第三轮细胞(P3)以使灵敏性最大化(再次存在Ad5)。2天后，细胞被溶解而释放DNA，其然后经历qPCR以检测AAV2/9 cap序列。AAV2/9 cap序列以Ad5依赖性方式的扩增表示rcAAV存在。使用含有AAV2 rep和AAV2/9cap基因的AAV2/9代用品阳性对照使得要测定的测定检测限度(LOD)(0.1, 1 10和100 IU)成为可能并使用系列稀释的GTP101载体(1x1010、1x109、1x108、1x107 DRP)，存在于测试样本中的rcAAV的大约水平可被定量。
P. 体外生物效能
为使qPCR GC滴度与基因表达相关，体外生物测定将通过用已知多重性的GC/每细胞转导HEK293细胞，并在转导后72小时，使用对两个mAbs特异性的抗-独特型ELISA，测量分泌的FI6和CR8033表达来执行。比较高活性临床前和tox载体制剂将能够解释产品活性。
Q. 总蛋白、衣壳蛋白和蛋白纯度测定
首先使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)测定，针对牛血清白蛋白(BSA)蛋白标准曲线，对载体样本的总蛋白定量。测定通过混合相等部分的样本与在试剂盒中提供的Micro-BCA试剂进行。相同程序应用于BSA标准品的稀释。混合物于60℃温育并于562 nm测量吸光度。标准曲线使用4-参数拟合，从已知的浓度的标准吸光度生成。未知的样本依据4-参数回归定量。
为提供AAV纯度的半-定量测定，然后对样本在SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶上分离的基因组滴度和5x109 GC归一化。然后凝胶用SYPRO Ruby染料染色。任何杂质带通过比较25、50和100 ng蛋白每道的共同-电泳的BSA标准定量。这些量代表1%、2%和4%的总AAV蛋白样本。除了3个AAV特异性蛋白VP1、VP2和VP3外，出现的染色带被认为是蛋白杂质。所有杂质带与参考蛋白比较，并报告杂质质量百分比以及大约的分子量。SDS–PAGE凝胶也将用来定量VP1、VP2和VP3蛋白并测定它们的比例。
R. BSA蛋白
这个用于释放试验的测定使用从Bethyl Laboratories获得的牛白蛋白ELISA试剂盒执行。该试剂盒是夹心ELISA。存在于测试样本中的BSA由已在微量滴定孔表面上预先吸附的抗-牛白蛋白抗体捕获。样本结合后，洗脱掉未结合的蛋白和分子，并将生物素化的检测抗体加入到孔中以结合捕获的白蛋白。然后加入链霉抗生物素-缀合的辣根过氧化物酶(SA-HRP)以催化与发色底物TMB (3,3’,5,5’-四甲基对二氨基联苯)的比色反应。比色反应产生蓝色产物，其在反应通过加入稀释的硫酸终止时转变成黄色。黄色产物在450 nm处的吸光度与存在于样本中的白蛋白被分析物的量成比例，并可生成4-参数标准曲线。然后测试样本中的白蛋白浓度可通过内插它们的吸光度，从与样本平行生成的标准曲线定量。乘以样本稀释度后，原始样本中的白蛋白浓度可最后计算。
S. 全能核酸酶内切核酸酶
全能核酸酶被用于生产过程以降解核酸，促进载体纯化，因此代表过程杂质。为释放测试，一种商品ELISA被用来测量残留的全能核酸酶的浓度。由于全能核酸酶的量很可能是痕量(如果存在的话)，用包含浓度< 1 ng/ml的范围的标准品执行ELISA是必要的。
T.GC与IU的比例
GC/IU比例是产物浓度的量度。qPCR滴度(GC/ml)除以“感染单元测定(IU/ml)，得到计算的GC/IU比例。
U. 渗透压、pH和外观测试
这些释放试验的测定通过BREL，使用经冰点降低的渗透压的试验方案执行。产品的外观通过目视检查透明度、颜色和异物颗粒的缺乏/存在来测定。针对白色和黑色背景检查产品。FDP的pH使用带有温度补偿的校准的pH微电极测定。
实施例3：GTP101的各个成分的评价
A. 保护针对流感A的致死攻击需要的AAV2/9.CB7.FI6的最小有效剂量(MED)的测定
将AAV2/9.CB7.FI6以从1x107至1x1010 GC/小鼠的剂量范围，经鼻内递送(IN)给6周龄雌性BALB/c小鼠，并用适应H1N1 (PR8) 14天后的小鼠的5LD50经IN攻击。如图3A-3B中所示的，对小鼠中的AAV2/9.CB7.FI6的MED (定义为用5LD50的PR8攻击的100%遭攻击的小鼠存活需要的剂量)被发现是1x109 GC/小鼠(用半数对数减少的剂量(3x108 GC/小鼠)确认具有部分保护作用)。
在第14天，未遭受攻击的3只小鼠/每处理组被处死以评价FI6在气道表面，即支气管肺泡灌洗液(BALF)和鼻灌洗液(NLF)中表达的水平。如图4A和4B中所示的，在肺(BALF)或鼻(NLF)表面测量的FI6 Ab的量与AAV2/9载体剂量相关。由于小鼠气道表面液体(ASL)层的小体积(其被估计为1µl)，在NLF中分泌的抗体量难以准确测定。
病毒载量(噬斑形成单位；PFU)在用PR8 (图5)攻击后6天评价并发现对于用1x1010GC的AAV2/9.CB7.FI6处理的小鼠，其肺清除了PR8且病毒载量的显著减少在用3x109 GC和也用1x109 GC的AAV2/9.CB7.FI6处理的小鼠中观察到。这样的两种剂量被发现对流感攻击有保护作用。
B. AAV2/9-预防针对吸入的流感的起效
当需要快的反应时间处理流感爆发时，快速起效的效果是有益的。同样，AAV2/9.CB7.FI6 IN递送和用5LD50 PR8攻击之间的时间间隔对于确定如何可快速获得保护作用是不同的。载体处理和攻击之间的最短时间间隔是8小时。预先给予疫苗并在8小时后攻击的小鼠失去一些体重，但在攻击时恢复和幸存(图6A和6B)。
C. 保护针对流感的致死攻击需要的AAV2/9.CB7.CR8033的MED的测定
在同时进行的研究中，评价AAV2/9表达抗流感Ab CR8033对保护对抗流感B攻击的有效性。6周龄雌性BALB/c小鼠被给予剂量范围从1x107至1x1010 GC/小鼠的AAV2/9.CB7.CR8033并用适应B/Lee/40的小鼠的5LD50经IN攻击。14天后发明人同样发现MED是1x109 GC/小鼠(图7A和7B)。当它们被IN给予3x108 GC/小鼠的半数对数减少的剂量时，用B/Lee/40病毒攻击后没有小鼠存活。
D. 在IN递送给小鼠后的AAV2/9载体传播
本文描述的AAV-介导的预防策略的一个重要的安全方面是将载体-介导的转导靶向呼吸道表面的终末分化的细胞。AAV2/9载体在PR8攻击后幸存的小鼠中有效的体内广泛传播被测定。给予小鼠不同剂量的AAV2/9.CB7.FI6并在攻击后对小鼠进行尸体剖检，收集组织(肺、肝、脾、卵巢、脑、心)以评价载体的生物分布。对于载体剂量1x109-1x1010 GC/小鼠，所有小鼠(每组5只)幸存于攻击。在所有剂量中，最高定量的载体基因组被发现于肺(例如在最高剂量的载体时，肺/肝AAV2/9基因组的比率是1783)。对于1x1010 GC/小鼠的较高剂量，在脾、脑和心中未观察到GG/二倍体基因组。极低水平的AAV2/9载体在肝和卵巢中检测到，并且如所期望的，在肝中观察到大量的AAV2/9基因组拷贝。在用3x109 GC处理的小鼠中，肝、卵巢和脾中未检测出AAV2/9，而低水平的衣壳在脑和心中观察到。如所期望的，载体基因组在肺中减少。用1x109 GC处理的小鼠中，载体基因组，虽然减少了很多，仅在肺中观察到。对于3x108 GC/小鼠处理组的幸存者，未检测出AAV2/9基因组拷贝的水平(低于检测限度，LD)。
载体基因组/二倍体基因组的存在
Figure DEST_PATH_IMAGE003
实施例4：混合两种AAV对于抗流感A和流感B的保护效果
混合两种不同的AAV制剂对预防针对流感A和流感B的影响被评价。小鼠被IN给予1x109 GC与AAV2/9.CB7.FI6和1x109 GC AAV2/9.CB7.CR8033的混合物并用5LD50的或者PR8或者B/Lee/40病毒攻击。应有干预或受体结合竞争，然后当与由给予单次保护的AAV2/9载体赋予的保护作用比较时，保护效果将显著降低。
在第一种情况下，1x109 GC AAV2/9.CB7.FI6和1x109 GC AAV2/9.CB7.CR8033的混合物被评价对针对用PR8攻击的保护作用，并与1x109 GC AAV2/9.CB7.FI6单独递送时赋予的对抗PR8的保护作用比较。如图8所显示的，未观察到干预。
然后评价1x109 GC与AAV2/9.CB7.FI6和1x109 GC AAV2/9.CB7.CR8033的混合物对针对用B/Lee/40 (流感B)攻击的保护作用，并与1x109 GC AAV2/9.CB7.CR8033单独递送时赋予的对抗流感B的保护作用比较。如在图9中所证实的，不存在干预作用。
实施例5：有效的载体再-给予和对抗用流感A攻击的保护作用
AAV2/9载体递送***的一个重要的特征是它可超过一次给药。为了模拟预先存在对抗AAV2/9衣壳的免疫力的情景，发明人以从1x109至1x1011 GC/小鼠的剂量范围经IN递送表达与流感转基因产品不相关的AAV2/9载体。28天后，血清-循环AAV2/9-特异性中和抗体(NAb)的水平被评价(图10)。如所期望的，AAV2/9 NAb在血清中的水平与经IN递送的AAV2/9的剂量成正比。
然后给予AAV2/9预-免疫小鼠1x1011 GC的AAV2/9.CB7.FI6。如果针对AAV2/9衣壳的NAb有效预防AAV2/9再-给予，则预-免疫小鼠将死于PR8攻击。尽管达到1:5,120血清稀释的高水平的血清-循环AAV2/9 NAb，AAV2/9.CB7.FI6被有效地再给予并导致对抗用PR8的5LD50攻击的全面保护作用。
实施例6：短暂感染对AAV2/9-介导的FI6预防对抗PR8的效率的影响
IN给予AAV2/9.CB7.FI6后，患者可经历空气传染而非流感的短暂感染，例如鼻病毒或RSV的可能性存在。作为感染的结果，衬在鼻和肺气道表面的呼吸道细胞亚群将受到损害和损失。作为病毒感染后损害的结果而转变的阳性-转导的细胞对AAV2/9.CB7.FI6-介导的预防对抗流感的效果的影响被评价。简言之，1x1010 GC的AAV2/9.CB7.FI6经IN递送给6周龄雌性BALB/c小鼠。为诱导对上皮细胞的损害，两周后，一个组用1x106 pfu的RSV攻击，而另一组用PBS经IN处理。4周后，所有小鼠用5LD50的PR8经IN攻击并监测体重损失和存活率。在短暂感染的事件中，对AAV2/9-介导的预防的效果没有影响。
实施例7：试验毒性和表达研究
A 一种过渡的非-GLP研究将在有免疫能力的CD-1小鼠中进行以评价安全性、动力学，和免疫应答。远交系CD-1小鼠被期望以类似于人(由于其遗传异质性)的方式对GTP101 (AAV2/9.CB7.FI6和AAV2/9.CB7.CR8033载体; GTP101研究产品(IP))产生响应。这个过渡的研究是必要的，因为大量的先前工作使用各种近交系毒株进行。由转基因产品直接引起的毒性不能在CD-1小鼠中评价，而是改为将在如本文件别处描述的免疫低下的近交系小鼠中评价。
为在小鼠中模拟IP经由IMAD在人鼻气道中的沉积，发明人将其中载体被递送以靶向小鼠鼻气道的体积液体减少。先前，发明人进行了研究。其中减少体积至20 µl限制了对鼻气道的表达[Limberis, M.P., et al., Sci Transl Med, 2013. 5(187): p.187ra72]。在小鼠中，这可被进一步限制至5 µl每鼻孔。这样的小体积将仍允许在小鼠中测试在非临床研究中建议的GTP101的最大剂量。
3个剂量组，每个剂量每个时间点10只动物(5只雄性和5只雌性)，对照(PBS)，3.2x1010、3.2x1011，和3.2x1012 GC/kg (IP) (见下表)。0天IP给予，10天达到峰值表达，而60天是回收期。安全性评价包括体重、临床观察、处死时的血清化学和血液学、全尸剖检、器官重量和在每个处死时的组织贮存，仅在选择的组织的组织病理学–肺、脑、肝、肾、心(高剂量和对照)。如果在最高剂量组观察到异常，则仅进行中等和低剂量组的组织病理学。两个转基因的表达将在处死时，在鼻灌洗液(NLF)、BALF和血清中，通过夹心ELISA评价。免疫学研究将通过ELISA (转基因和衣壳)和脾中评价的T-细胞应答水平评价抗-药物抗体(ADA)的水平。
有免疫能力的CD1小鼠中的非-GLP试验毒理学研究
Figure DEST_PATH_IMAGE005
B. 免疫缺陷小鼠中的毒理学研究
这个毒理学研究作为对人建议的最大剂量进行，其在RAG-1 KO小鼠和用于先前研究的中等剂量组中为大约3.2x1011 GC/kg。组的大小将是每一时间点，每个性别10只动物，在第10和60天处死。IP将给予至多10 µl每鼻孔的体积。
免疫缺陷小鼠的非临床毒理学研究
Figure DEST_PATH_IMAGE007
一个剂量组，20只动物每剂量每时间点(10只雄性和10只雌性)，剂量3.2x1011 GC每只小鼠(IP)。0天IP给予，10天-峰表达，和60天-回收期。安全性评价包括体重、临床观察、处死时的血清化学和血液学、全尸剖检、器官重量和在每个处死时的组织贮存，仅在选择的组织的组织病理学(在表8.8中列出)。如果在最高剂量组观察到异常，则仅进行低剂量组的组织病理学。两个转基因的表达将通过ELISA，在NLF和BALF二者中评价。
C. 非人灵长类动物中的毒性和生物分布研究
这个研究将使用用于人试验的相同装置和体积(当依据总身体质量归一化时)，以代表比将递送至人体试验的最高剂量高10-倍的剂量进行。在人体试验中的最高剂量将是经由2 x 0.2 ml每鼻孔给予的3.2x1011 GC/kg (对于75 kg人总计2.4x1013 GC)。NHPs将接受3.2x1012 GC/kg (对于4 kg猕猴1.28x1013 GC)，其是可用IMAD装置以提供给人的体积给予的最高剂量，所述剂量是作为2 x 0.2 ml每鼻孔给予的2.4x1013 GC。
毒性和生物分布研究将在恒河猴中进行。6只雄性和6只雌性，总共12只恒河猴将被用于这个研究。将评价3个时间点，幼稚动物将在IP给予前0天处死，10天相当于峰表达，而60天相当于长期恢复期。
在每个时间点处死两只雄性和两只雌性动物。毒性将通过评价CBC/chem小组评价。
实施例8：鼻内递送装置评价
在下一组研究中，与LMA® MAD Nasal™鼻内粘膜雾化装置(IMAD)连接的表达抗流感A和B抗体(分别为FI6和CR8033)的AAV9有效保护小鼠对抗用大流行或季节性流感攻击的能力被评价。首先，确定了以5x1010 GC/KG (或1x109 GC)剂量/每只小鼠鼻内递送(i.n.)的AAV9.FI6和AAV9.CR8033载体的等摩尔组合，有效保护小鼠分别对抗流感A (适应H1N1的小鼠，PR8)或流感B (适应B/Lee/40的小鼠)的致死攻击(图11A、11D、11G和12A、12D)。在AAV9进展到临床的努力中，评价了载体与IMAD的相容性对于体积和载体效能的损失。对于这些研究，0.5 mL载体悬浮液通过IMAD被浸入以评价载体溶液的物理损失并评价装置对载体效能的影响。如图12G指明的，当载体溶液通过IMAD处理时，观察到起始体积的4-6.6%的体液损失。发明人也评价了3个不同的载体制剂的载体相容性：PBS-pH 6.8、PBS-pH 7.2或PBS-pH 7.4。各组小鼠经i.n.给予AAV9.FI6和AAV9.CR8033各5x1010 GC/KG (或1x109 GC)的混合物以及AAV9.FI6和AAV9.CR8033各5x1010 GC/KG (或1x109 GC)的混合物(其通过IMAD处理)。7天后，小鼠用5LD50的PR8或B/Lee/40攻击(图11A、11D、11G和12A、12D)。当载体混合物通过IMAD处理时，未观察到保护对抗流感A或B的有效性的差异(深灰色正方形)。另外地，当用3个制剂的每一个配制的载体通过IMAD处理时，IMAD的使用与3个不同的制剂相容且未观察到有效性的减少。仅给予载体的小鼠幸存于攻击。在实验结束(21天)时，处死小鼠并收获支气管肺泡灌洗液(BALF)以评价抗体表达。也收集肺以评价在尸检时存在的载体基因组的量。当载体作为液体或作为按照IMAD处理的液体递送时，在气道表面的抗体表达中未观察到差异(图11B、11E、11H和12B、12E)。而且，在肺中的AAV9载体基因组的数目中未观察到显著差异。
接着，这个方法被移用至猕猴的鼻，一种与为靶向组织的人鼻更密切相关的模型。在这个模型中，当AAV9载体经由IMAD递送与传统的直接液体递送比较时，转基因在鼻灌洗液(NLF)中的表达起效的动力学和表达的稳定性被评价。对抗人抗体FI6或CR8033的免疫应答将具有惊讶的实验和结果的解释。同样，在这些研究中，一种自抗原(恒河猴α-胎蛋白，rhAFP)被用作报道基因转基因。恒河猴α胎蛋白 (rhAFP)的表达在此通过加(+)符号的存在注释，因为粘膜表面抗体的量的精确定量受到NLF的精确采样约束。在研究结束时，也检查载体生物分布。总之，在两种递送方法之间未观察到基因表达或AAV9载体生物分布的动力学和概况的显著差异。
总之，当载体经由IMAD (一种易于使用的(easy-to-use)将转导定位于流感感染的位点，鼻粘膜的装置)递送时，针对流感A和B的AAV-介导的预防作用是安全且有效的。
实施例9：起始阶段1试验设计
阶段1试验的目的是评价初步安全性和耐受性，以了解IP在健康志愿者中的药代动力学，并选择用于进一步开发的剂量水平。试验将是开放标记的、具有基于临床前数据的剂量水平的剂量-递升试验。研究将招募至多5组人，每组4名受试者。受试者将在处理前4-12周被筛选并将计划随访6个月。
每个志愿者将使用批准的IMAD，经由0.2 ml每鼻孔的两次连续的应用进入每个鼻孔，接受一个0.8 ml剂量的IP (IN)。至多28 (24)名志愿者将被招募到5组中。1-4组将接受增加剂量水平的IP，最后一组(第5组)扩大至8名志愿者(最佳剂量水平) (由第1-4组的安全性和药代动力学参数限定)。
健康成人志愿者中的起始阶段1研究设计
Figure 515148DEST_PATH_IMAGE008
A. 靶向群体入选/排斥标准
具有身体质量指数19-30 kg/m2和体重50-100 kg的任何性别的健康18-45岁成人将被招收以评价GTP101的安全性、免疫学和药代动力学参数。
入选标准
•男性或女性年龄18-45岁
•能够提供参与的书面知情同意书
•健康，如通过医学史、身体检查、生命体征，和临床安全性实验室检查@基线测定的
•非-习惯性抽烟(习惯性抽烟是在一周基础上抽烟超过4包香烟或其它烟草产品的人)并同意在参与期间不使用烟草产品
•雌性应满足以下标准之一：
•绝经后至少一年；
•手术消毒；
•在IP给予前30天使用口服、可植入的、经皮或可注射避孕药和直至疫苗接种后60天；
•从通过28天研究筛查的时间起愿意禁止***或采用另一种由调查人批准的可靠的避孕形式(例如***(IUD)、女用避孕套、带杀***剂的隔膜、子宫颈帽、***或不育***使用避孕套)。
•潜在的育龄女性在IP给予之前24小时内必须具有尿妊娠测试阴性
•研究需要的理解，对所需研究期表达的有效性
排除标准
•季节性枯草热或季节性过敏性鼻炎或常年过敏性鼻炎或慢性或鼻或鼻窦病症的明显史
•在给予IP之前需要处理多至1年的哮喘史
•患有异常鼻结构包括鼻中隔偏曲和鼻息肉、慢性鼻窦炎、哮喘，或COPD的患者
•目前使用鼻内类固醇
•如通过调查人评价的，存在严重的未控制的医学或精神病(急性或慢性)。这包括，但不限于新的医学或手术处理机构，或在筛选的3个月内和在攻击之前0天再次确认的对于未控制的症状或药物毒性的显著剂量改变。
•对于HIV-1或HIV-2，或HBsAg或HCV抗体的阳性血清学。
•癌，或在3年内治疗过癌，排除基底细胞癌或鳞状细胞癌，其是被允许的。
•可与受损的免疫应答相关的免疫抑制或任何医学病症的存在，包括但不限于，糖尿病。
•目前接受(或接受史)，在先前3-月期间，可不利地影响免疫***的任何药物或其它治疗，例如过敏注射、免疫球蛋白、干扰素、免疫调节剂、细胞毒药物或已知频繁与重要的主要器官毒性相关的其它药物，或***皮质类固醇(口服或注射)。局部皮质类固醇将是允许的。
•在研究前一年有吸毒史或化学药物成瘾
•在给予IP之前30天内接受任何试验用药品或非注册药物或目前入选的任何实验药物研究或打算在随后的研究期内入选这样的研究。
•在IP给予之前6个月接受血或血液制品或在研究期间计划给予。
•在IP给予之前72小时内患有急性疾病，定义为伴有或没有发热的中度或严重疾病的存在(如由调查人通过医疗史和身体检查所确定的)，或存在发热，口温>38℃。
•孕妇和/或哺乳期妇女。
•对AAV2/9的血清抗体>1:80。
•按调查人意见，可能干扰初次研究目的和评价的任何病症。
B. 剂量水平测定
基于临床前效果数据选择初始剂量水平，并将基于非临床安全性评价，用由AAV的聚集特性限制的最高剂量改进。剂量范围将为从3.0x1012至2.4x1013 GC/剂量，以4 x 0.2ml每鼻孔经由IMAD给予。这些剂量当对于总体重调节时，基本上低于给予猴、小鼠和雪貂的那些。在这些物种中以IP或在结构上类似于用于临床试验计划的IP的AAV2/9的版本的任何剂量进行的任何非临床研究中中未观察到显著毒性。
C. 剂量给予和持续时间
每个剂量组将经由IMAD接受(IP) 0.4 ml/每鼻孔(IP)。受试者将逐个给药。在相同剂量组内的处理间隔将通过非临床研究确定，但为了表达的目的将是1周。一旦一组中的所有受试者已通过14天的研究，将评述初步安全性数据。如果未鉴定出安全性问题，将开始增加剂量至下一个剂量。在第4组人完成和最高剂量的初步安全性被证实后，第5也即最后一组人将被招收以供扩大至总共8名受试者(即，4名另外的受试者)，其所用最佳剂量将是最大耐受剂量或可给予的最高剂量。
给予患者的产品将是两个AAV2/9载体的混合物，其已在填充/完成时间合并。IP给予将以两个连续的进入每个鼻孔的0.2 ml剂量(即，IP总共为0.8 ml)发生。IP将使用由Teleflex Medical (Teleflex.com)生产的商业上认可的装置给予。该装置被称为LMA MADNASAL™ (鼻内粘膜雾化装置)。如何最好地使用递送(IP)至鼻粘膜的装置的细节在该公司的程序指导中提供。基本上，受试者被置于斜倚位置并使装置的尖端置于每个鼻道的孔口(一次一个)，此后IP经由注射器，通过喷雾器推动液体递送。
最大耐受剂量(MTD)将被定义为受试者表现出剂量-限制毒性(DLT)的剂量以下的剂量，限定为在两个受试者中涉及3级的任何治疗或一个涉及4级事件的治疗。
该申请含有序列和序列表，其通过引用结合到本文中。2016年4月15日提交的美国临时专利申请号62/323,348和2015年5月13日提交的美国临时申请号62/161,192也通过引用结合到本文中。所有的出版物、专利，和在本申请引用的专利申请，通过引用以其整体结合到本文中，如同各个独立的出版物或专利申请特别地和单独地指明通过引用结合到本文中的程度一样。虽然前述发明为了清楚理解的目的，已通过说明和示例的方式进行了某些详细的描述，显而易见的是，本领域普通技术人员根据本发明的讲述，可另外进行某些改变和修饰，而不背离所附权利要求书的精神或范围。
表
(序列表自由文本)
以下信息提供含有在数字标识符<223>下的自由文本的序列。
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Claims (23)

1.一种可用于递送两种抗流感抗体构建体的组合用于针对流感感染进行被动免疫的组合物，所述组合物包含：
(i) 具有AAV9衣壳(rAAV9)和具有载体基因组的第一非复制重组腺相关伴随病毒，所述载体基因组包含：(a) AAV反向末端重复序列(ITR)，(b) 增强子，(c) 启动子，(d) 内含子，(e) 5’ UTR，(f) 编码可操作地连接于FI6v3可变重链的前导肽的核酸序列，(g) 编码FI6v3可变重链的核酸序列，(h) 编码人CH1结构域和人IgG1 Fc链(CH2-3)的核酸序列，(i)编码弗林蛋白酶识别位点的核酸序列，(j) F2A接头，(k) 编码可操作地连接于免疫球蛋白轻链的前导肽的核酸序列，(l) 编码免疫球蛋白轻链的核酸序列，(m) 多腺苷酸化信号，和(n) AAV反向末端重复序列；
(ii) 第二非复制rAAV9，其中第二rAAV9具有AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含：(a) AAV反向末端重复序列(ITR)，(b) 增强子，(c) 启动子，(d) 内含子，(e) 5’UTR，(f) 编码可操作地连接于CR8033重链的前导肽的核酸序列，(g) 编码CR8033可变重链的核酸序列，(h) 编码人CH1结构域和人IgG1 Fc链(CH2-3)的核酸序列，(i) 编码弗林蛋白酶识别位点的核酸序列，(j) F2A接头，(k) 编码可操作地连接于免疫球蛋白轻链的前导肽的核酸序列，(l) 编码轻链的核酸序列，(m) 多腺苷酸化信号，和(n) AAV反向末端重复序列；
和含水液体悬浮基质。
2.依据权利要求1的组合物，其中对于(i)的载体基因组选自：SEQ ID NO: 1、14、15和16。
3.依据权利要求1的组合物，其中对于(ii)的载体基因组包含SEQ ID NO: 8。
4.依据权利要求1的组合物，其中对于(i)和/或(ii)的启动子独立地选自鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、类人猿病毒40 (SV40)的早期和晚期启动子、U6启动子、金属硫蛋白启动子、EFlα启动子、遍在蛋白启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、腺苷脱氨酶启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸甘油变位酶启动子、β-肌动蛋白启动子、UbB启动子、UbC启动子、莫洛尼氏白血病病毒和其它逆病毒的长末端重复序列(LTR)、或单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。
5.依据权利要求4的组合物，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白(CB)启动子。
6.依据权利要求1的组合物，其中来自(i)和(ii)的rAAV9的总浓度是1x1011-6x1013基因组拷贝(GC)/mL，其中GC使用微滴式数字PCR (ddPCR)测定。
7.依据权利要求1的组合物，其中(i)的rAAV9与(ii)的rAAV9的比例是约1:1。
8.依据权利要求1的组合物，其中(i)和/或(ii)中的轻链来自与重链源异源的免疫球蛋白源。
9.依据权利要求1的组合物，其中(i)和(ii)中的轻链来自相同的来源。
10.依据权利要求1的组合物，其中可变轻链是没有限定的特异性的种系抗体序列。
11.依据权利要求10的组合物，其中轻链是κ链。
12.依据权利要求11的组合物，其中所述轻链是人κ链种系IGKV4-1*101。
13.依据权利要求1的组合物，其中(i)或(ii)的5’UTR独立地选自人c-myc 5’UTR。
14.依据权利要求1的组合物，其中(i)的前导肽对免疫球蛋白是异源性的，并且其中所述前导肽是彼此不同的。
15.依据权利要求1的组合物，其中(ii)的前导肽对免疫球蛋白是异源性的，并且其中所述前导肽是彼此不同的。
16.依据权利要求14或15的组合物，其中所述前导肽是IL-2信号肽。
17.依据权利要求1的组合物，其中组合物被配制用于鼻内、肌内或静脉内给予。
18.依据权利要求1-15的任一项的组合物在制备用于针对流感来免疫人类患者的药物中的用途。
19.依据权利要求1-15和17的任一项的组合物，其中所述组合物经配制用于以1x1012-3x1013基因组拷贝的量给予患者。
20.依据权利要求18的用途，其中患者被给予1x1010-3x1013 GC的量的剂量。
21.依据权利要求18的用途，或依据权利要求16的组合物，其中组合物经肌内、静脉内或在单个鼻孔中经鼻内给予，任选地经鼻内给予每个鼻孔。
22.依据权利要求18的用途，或依据权利要求19的组合物，其中以每鼻孔0.4 mL或0.2mL的两次连续施用给予患者。
23.一种产品，其包括包含依据权利要求1-17的任一项的组合物、任选的稀释剂和用于给药的说明书的容器。
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