CN110554492B - 运行具有结构化照明的光学显微镜的方法及光学*** - Google Patents

Abstract

本发明涉及运行具有结构化照明的光学显微镜的方法及光学***。用于运行具有结构化照明的光学显微镜的方法包括：借助结构化设备提供照明图案，结构化设备将射入光***成至少三个相干、相应于光的‑1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束。通过如下方式产生照明图案的不同相位，即，利用移相器设定针对分射束的不同的相位变化。针对其中每个照明图案分别采集至少一个显微镜图像，并且随后将显微镜图像换算成高分辨率图像。根据本发明，移相器不仅被设置成用于+1衍射级和‑1衍射级的分射束，而且有至少一个移相器还被设置成用于属于0衍射级的分射束。为了提供不同相位的多个照明图案，利用0衍射级的移相器设定至少两个不同的相位值。

Description

运行具有结构化照明的光学显微镜的方法及光学***

技术领域

本发明在第一方面中涉及用于运行具有结构化照明的光学显微镜的方法。在第二观点中，本发明涉及用于在光学显微镜中进行结构化照明的光学***。

背景技术

在按类属的用于运行具有结构化照明的光学显微镜的方法中，借助结构化设备来提供照明图案。结构化设备将射入的光***为至少三个相干的分射束，它们相应于光的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级。

结构化设备例如可以包括在照明光路的中间图像平面内的光栅(相位衍射光栅)。光在光栅上被衍射，借此尤其出现了-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束。这些分射束在样本平面内进行干涉并且因此产生了结构化的照明。样本平面内的这种照明图案可以是光栅结构，例如是由交替的明暗区域构成的线性结构。在中间图像平面内采集到光栅的具有不同的转动过的光栅矢量的多个样本图像。为此，例如可以转动光栅或依次照亮不同取向的光栅。此外，采集到具有照明调制的不同的相位的多个显微镜图像。为了进行相位变化，例如光栅可以在中间图像平面内移动，或者图平面平行的晃动板在中间图像附近翻转。

替选地，结构化设备也可以包括波导片来代替光栅。波导片被称为光子集成电路(英文：Photonic Integrated Circuit，PIC)并且包括基底，其内形成有光导通道。这些光导通道通常不是空腔的，而是在材料方面与基底区别开。波导片包括至少一个针对光的输入端，在其上将射入的光传输并且在波导片内被***为至少三个路径区段(光导通道)，这些路径区段通向至少三个输出端。因此可以由所射入的光束形成三个相干的分射束，它们可以在输出端逸出并且在样本平面内进行干涉。至少三个输出端及其所属的路径区段相应于光的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级，也就是说，这些输出端可以如下这样地布置，即，使它们在照明光路的光瞳平面内形成点图案，该点图案正好相应于通过布置在中间图像平面内的光栅在光瞳平面内产生的点图案。替选地，输出端不需要在该点图案方面进行布置；替代地，也可以如下这样地进行从输出端经由例如光纤维的光传输，即，使得在光瞳平面内产生所述点图案。零衍射级在此在照明光的横截面内位于+1衍射级和-1衍射级之间，并且尤其可以与+1衍射级和与-1衍射级都具有相同的空间上的间距。

在按类属的方法中，依次产生相位不同的多个照明图案。为此，利用移相器设定针对分射束的不同的相位变化。现在相对其中每个照明图案分别采集至少一个显微镜图像，并且将显微镜图像换算成高分辨率图像。

经由波导片的不同的输入端可以产生不同定向的照明图案，其中，分别经由移相器设定照明图案的不同相位。

经计算的高分辨率图像应当理解为由多个显微镜图像算得的图像。因为其包含来自所有显微镜图像的信息，所以其被称为高分辨率的，其中，不应将其理解为图像分辨率的规格。

以相应方式，按类属的用于结构化照明的光学***具有结构化设备，其将射入的光***为至少三个相干的分射束，它们相应于光的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级。结构化设备尤其可以具有波导片，其包括至少一个具有随后的光导路径的输入端，光导通路被分为至少三个路径区段，它们通向波导片的至少三个输出端。其中两个外部输出端及其所属的路径区段简称为“光的(相应)+1衍射级和-1衍射级”。这是为了说明，从外部输出端逸出的光束可以相应于在光栅上衍射的光的+1衍射级和-1衍射级。分别位于两个外部输出端之间的中间的输出端及其所属的路径区段基于该输出端的中间布置而相应地被称为0衍射级。波导片还分别在每个路径区段上包括移相器用于在路径区段内的光的相移。

按类属的用于结构化照明的方法和光学***由申请人在DE 10 2017 109 645.0已说明。具有波导片的类似光学***还由申请人在WO2014/060270A2中说明。

困难在于，稳定地、精确地和高效地设定足够大的相位变化。尤其在布置在波导片上的移相器的情况下，这些要求很难满足。在例如热移相器的情况下，必须可以在波导片的路径区段上设定足够大的温度差。即使这成功进行，但仍存在的问题是，也许显著的温度变化将导致期望的变量发生不稳定的相位变化。在其它移相器，例如压电式的移相器的情况下也出现困难，尤其是在材料应力(通过相对强烈的压电式伸展和压缩形成)和在此也许出现的滞后中，其中，即使当驱控被复位至原始值时，材料仍部分地保持变形。

此外在US2013/0335819A1中说明了一种用于提供结构化照明的另外的光学***。随后进一步阐述不同之处。

发明内容

本发明的任务是说明提供针对光学显微镜的结构化照明的方法和光学***，其中，可以用简单方式并特别高效地更改照明图案的相位。

该任务通过本发明的方法以及通过本发明的光学***解决。根据本发明的光学***和根据本发明的方法的有利变型方案还将在以下说明中阐述。

本发明提出一种用于运行具有结构化照明的光学显微镜的方法，该方法包括：

-借助结构化设备提供照明图案，结构化设备将射入的光***为至少三个相干的、相应于光的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束，

-其中，通过如下方式产生照明图案的不同相位，即，利用移相器设定针对分射束的不同的相位值，并且

-针对其中每个照明图案分别采集至少一个显微镜图像，并且将显微镜图像换算成高分辨率图像，

其中，

-移相器不仅被设置成用于+1衍射级和-1衍射级的分射束，而且有至少一个移相器还被设置成用于0衍射级的分射束，

-为了提供不同相位的多个照明图案，利用属于0衍射级的至少一个移相器设定至少两个不同的相位值，并且将借此采集到的显微镜图像换算成高分辨率图像。

本发明还提出一种用于在光学显微镜中进行结构化照明的光学***，该光学***具有：

结构化设备，该结构化设备将射入的光***成至少三个相干的相应于光的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束，

多个移相器，所述多个移相器被设立成用于使分射束的相位发生变化，以便设定照明图案的不同相位，

其中，

光学***还包括控制单元，控制单元被设立成用于不仅利用属于-1衍射级和+1衍射级的移相器设定不同的相位变化，而且还利用属于0衍射级的一个或多个移相器设定至少两个不同的相位值，并且将在此采集到的显微镜图像换算成高分辨率图像。

本发明的难点在于，如何设定在样本平面内干涉成照明图案的不同的分射束的相位变化。将光***为相干的分射束的结构化设备可以以原则上任意方式设计。光栅例如可以用作为结构化设备。在光栅上，光以多个衍射级被衍射，其中，这些分射束可以在光瞳平面中或其区域中在空间上被彼此分开并且在那里可以被彼此无关地调制。在当前，光的衍射级或相应于衍射级的光束被看作为分射束。当结构化设备代替衍射用的元件地包含有至少一个分光器(英文：Splitter)，其将射入的光***为多个分射束，则存在后一种情况。这些分射束可以如下这样地传输，即，使这些分射束按照其级在光瞳平面内产生图案，这些分射束正好相应于光栅(其布置在中间图像平面内)的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束。结构化设备例如可以包含可如前述设计的波导片。在波导片中可以集成至少一个分流器，在其之后，分射束经由波导片内的各自的路径区段被传输。具有波导片的光学***提供了特别紧凑的结构形式，其具有少量部件或者说少量彼此可相对运动的部件。然而也可以无波导片地使用分流器，其中，分射束然后通过例如光纤维和/或反射镜以期望的照明点图案进行传输。也可以将相位调制器作为结构化设备使用，如其在申请人的尚未公开申请DE102018110072、DE 102018110083、DE 102018110109和DE 102018110117所述那样。在这些相位调制器中，相位在光束的横截面上像素式移动。这例如可以利用液晶矩阵或利用举升式反射镜矩阵。由此，在光瞳平面区域内存在空间上彼此分开的分射束，它们可以利用移相器彼此无关地被调制。视结构化设备的类型而定地也可以出现更高衍射级的分射束，其中，可以设置的是，这些分射束被隐没并且仅仅传输相应于-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束至样本平面。

为了更易于理解，在以下阐述中往往示例性提到波导片。其被理解为，该本发明变型方案也可以通过如下方式修改，即，可以构造无波导片的结构化设备，例如具有光栅、上述相位调制器或分流器和光纤维。

为了更好理解本发明的效果，首先提供对照明图案的数学上的描述。借助波导片或设计方式不同的结构化设备产生多个分射束，它们在样本平面内彼此干涉并因此形成照明图案。分射束因而相应于-1衍射级、0衍射级和+1衍射级，当光栅在中间图像平面内被照亮时，则出现这些分射束。从此推导出，照明图案由第一级调制对比度和第二级调制对比度来描述，其中，第二级调制对比度说明了，周期性的强度波动(余弦函数)以比第一级调制对比度双倍高的频率在空间上变化。第二级调制对比度的相位通过在+1衍射级的分射束上设定的相位值Φ₁并通过在-1衍射级的分射束上设定的相位值Φ_-1来确定。第一级调制对比度的相位不仅通过相位值Φ₁和Φ_-1确定，而且也可以通过在0衍射级的分射束上设定的相位值Φ₀确定。为了照明图案移相，根据本发明也应用相位值Φ₀的特定的变化。由此Φ₁和Φ_-1只需要稍微变化。因而移相器在本发明中与传统方法相比仅需要设定更小的相位变化。尽管如此仍达到与在非根据本发明的情况下相同的照明图案的相位变化，在非根据本发明的情况中，Φ₁和Φ_-1非常明显地变化，而Φ₀对于所有测量而言保持恒定。

针对数学上的描述，首先限定相对0衍射级、+1衍射级和-1衍射级的三个分射束的电场强度矢量E₀、E₁和E₂。在正文中取消了矢量箭头。在以下描述中，脚注2始终用于-1衍射级：

在此，i是虚数的i；k₁、k₂、k₀是波值矢量(空间上的频率)，r是空间矢量，Φ₁、Φ₂和Φ₀是相位，e_p,y是针对所有分射束的在y方向上的电场的单位矢量，e_p,z,x,1、e_p,z,x,2和e_p,z,x,0是针对三个分射束的在x-z平面中的电场的单位矢量；e^iδ1、e^iδ2和e^iδ0说明了在x-z平面内的电场相对于y方向上的电场的相移，a、b、c、d是幅值/常数，而conj.comp.(共轭复数)表示各自的全部前述表达的复共轭。通过与共轭复数的加和以及与1/2相乘缩小了虚数部分，而仅保留各自的电场的实数部分。波值矢量k₁、k₂、k₀在图1中被详细示出。利用图1简单明示了针对波值矢量k₁、k₂、k₀适用的是：

在此，e_x、e_y和e_z是x、y、z方向上的单位矢量，

是波值矢量相对x轴线的角度，λ是介质中的光波长度。波值矢量相对于y轴的角度θ为90°(参见图1)，其中：

电场强度I与三个分射束的电场强度E₀、E₁、E₂的之和的二次幂是成比例的，其中，通过与复共轭E₀*、E₁*、E₂*相乘形成二次幂：

二次幂项E₀ ²、E₁ ²、E₂ ²是常数：

利用这些常数，上述电场强度I表达式可以变形为：

如果现在应用根据图1的波值矢量k的表示，则由此得到：

因此，照明强度I包括两个经加和的调制项(余弦函数)。第一行中的调制项

被称为第二级的调制项，这是因为其具有另一调制项(即，第一级调制项)的双倍的空间上的频率，另一调制项在第二行中并且包括

为了采集结构照明的具有不同相位的多个显微镜图像，上述波表达式的相位必须变化。因而对于第二级调制对比度来说，相差(Φ₁–Φ₂)必须变化。对于第一级调制对比度来说应当考虑，在此将两个余弦函数相乘：

由此，可以不仅通过Φ₁和Φ₂的变化来实现相移，而且Φ₀也可以变化，以实现强度图案的相位变化。

通过Φ₀的适当变化，使得Φ₁和Φ₂的变化不必比当Φ₀对于所有图像采集来说具有相同值时那么大。

该认知在本发明中得到应用。

在上述类型的方法中，根据本发明的移相器不仅分别被设置成用于+1衍射级和-1衍射级的分射束。而且也存在针对0衍射级的分射束的各至少一个移相器。为了提供不同相位的多个照明图案，利用0衍射级的移相器设定针对Φ₀的至少两个不同相位值。

上述类型的光学***根据本发明包括控制单元，其被设立成用于不仅利用+1衍射级和-1衍射级的移相器设定不同的相位变化。而且也利用属于0衍射级的一个或多个移相器设定至少两个不同相位值，尤其是正好两个彼此以π间隔的相位值。

有利地，由于应用了不同相位值Φ₀，使得Φ₁和Φ₂的变化仅需更小。

即使在作为结构化设备地没有无波导片且使用集成的移相器的已知的***中，Φ₀也并不像本发明中那样被调设。例如US2013/0335819A1描述了一种用于结构化照明的构造，其中，产生了相应于光的-1衍射级、0衍射级和1衍射级的三个分射束。作为移相器在此应用可转动的透明的薄板。相应于-1衍射级和1级衍射的分射束根据US2013/0335819A1的图7A通过移相器来相移。相反，针对0衍射级则与本发明相比未作描述，这些相位如下这样地变化，即，针对-1衍射级和1衍射级的较小相位变化就足以将样本平面内的照明强度图案如期望那样进行相移。根据本发明，采集用于计算成其高分辨率图像的显微镜图像，这些显微镜图像具有针对0衍射级的分射束的至少两个不同相位值。在前述现有技术中，顶多提到的是，针对这些分射束可以存在多个移相器，而没有提到，在用于创建高分辨率图像的测量序列中(也就是说在针对唯一图像的测量序列中并且不是例如在相对不同高分辨率图像的不同的测量序列中)利用针对0衍射级的移相器设定两个或更多个不同的设定。

在本发明变型方案中，可以采集如下显微镜图像，其中，利用0衍射级的移相器设定两个不同相位值Φ₀，它们以π区别开。如由上述针对第一级调制对比度的表达式可见，Φ₀以π变化导致的是，表达式

的符号发生变化，这是因为众所周知地余弦函数通过以π移动来获得相同数值，而却得到另一符号。如果应当针对第一级调制对比度推移整个相位区域，则在Φ₀是恒定的情况下在

中的相位表达式(Φ₁–Φ₂)/2在2π的范围内变化；而在Φ₀以π变化的情况下发生的符号变换导致的是，相位表达式(Φ₁–Φ₂)/2仅需要在1π范围内变化来覆盖整个相位区域。

现在针对属于0衍射级的移相器的以π区别开的两个相位值Φ₀的每个(也就是说为针对Φ₀的两个值)分别利用属于+1衍射级和-1衍射级的移相器设定多个不同相位变化(或者说相位值/相位设定)，也就是不同的Φ₁、Φ₂对，其中，分别采集显微镜图像。例如可以采集具有相同Φ₀和不同Φ₁、Φ₂对的两个或更多个显微镜图像，并且附加地，采集具有以π变化的Φ₀和不同Φ₁、Φ₂对的两个或更多个显微镜图像。

原则上如下任意元件都可以用作为移相器，这些元件被设立成用于可变地改变射入的光的相位。例如，可以将可运动/可转动的透明的薄片布置在不同分射束的光路内。移相器也可以集成在波导片内。在此情况下，移相器设置在属于-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束的各自的路径部分上。也可以在一个路径区段上相继布置多个移相器，以便能更好地产生足够大的相位变化。尤其是在集成到波导片中的情况下，可以应用热移相器、压电移相器、光电移相器或声光移相器。热移相器改变所属的路径区段的温度。与温度有关地使光程长度变化，从而使相位移动。在压电式的移相器中，通过施加电压，使所属的路径区段的材料伸展或收缩，借此同样可以更改光程长度。在光电移相器中，可以经由在波导片上与路径部分相邻布置的电极来施加电压，其在所属的路径区段内产生电场。由此，使路径区段中的折射指数，从而使经过路径区段的光承受相位变化。声光移相器可以在所属的路径区段中产生声波，通过其改变光波的光程长度。

为了提供不同照明图案，属于+1衍射级和-1衍射级的两个移相器可以从工作点出发在相反方向上进行调设。因此，在热移相器中，从例如工作点起，即从200℃起，加热属于+1衍射级的路径区段，而冷却属于-1衍射级的路径区段。由此使Φ₁和Φ₂在相反方向上变化。因为第一级调制对比度的相位和第二级调制对比度的相位与差(Φ₁–Φ₂)有关，所以可以通过这种反方向的变化实现高效的相位调设，而两个值Φ₁和Φ₂中的任一个不必过度明显变化。

属于+1衍射级和-1衍射级的移相器也可以从工作点出发如下这样地在相反方向上进行调设，即，使针对属于+1衍射级和-1衍射级的Φ₁和Φ₂的两个产生的相位变化具有相同数值然而却具有不同符号，即尤其是适用的是Φ₁＝–Φ₂，或ΔΦ₁＝-ΔΦ₂，其中，ΔΦ₁和ΔΦ₂说明了从相对其采集显微镜图像的相位值Φ₁和Φ₂出发的相位变化。由此不仅避免了在Φ₁和Φ₂不同数值变化时两个数值的其中一个必须相对明显变化以便覆盖整个相位区域的问题。相反Φ₁＝–Φ₂也带来重要的优点，即，在第一级调制对比度的表达式

中的部分(–Φ₁–Φ₂)/2始终是恒定的或者为零，即尤其可以适用的是

并且因而该余弦项仅通过Φ₀变化；该表达式的其余的参数组合观察保持恒定，与此同时设定不同相位并采集显微镜图像。如果现在将Φ₀有选择地设定到以π区别开的两个值中的一个上，则这使该表达式的符号变化，其中，Φ₁和Φ₂仅在第一级调制对比度的表达式的第一余弦项：

中起重要作用。

在该表达式上可以清楚看到，当附加地Φ₀以π变化时，相位(Φ₁–Φ₂)/2不必大于1π地变化，以便覆盖整个相位区域。

因此，在本发明变型方案中设置的是，为了提供不同照明图案，属于+1衍射级和-1衍射级的移相器在如下区间内进行调设，该区间至多包括第一级调制对比度的为π的相位变化(Φ₁–Φ₂)/2、尤其是0≤(Φ₁–Φ₂)/2≤π；为了提供大于π的第一级调制对比度的相位变化，附加地利用属于0衍射级的移相器来改变相位变化Φ₀、尤其是Φ₀以π改变。

因而可以采集由其算出高分辨率图像的全部的显微镜图像，与此同时，产生不同的照明图案，针对这些照明图案如下这样地调设属于+1衍射级和-1衍射级的移相器，即，始终适用0π≤(Φ₁–Φ_-1)/2≤1π。如前述，Φ_-1和Φ₂同义地被用于属于-1衍射级的路径区段上的相位变化。为了提供第一级调制对比度的相应于1π至2π的区间的相位变化，现在Φ₁和Φ_-1例如不如下这样地变化，即，适用1π≤(Φ₁–Φ_-1)/2≤2π。而是，使属于0衍射级的相位值Φ₀以π改变，而属于+1衍射级和-1衍射级的移相器还如下这样地调设，即，始终适用0π≤(Φ₁–Φ_-1)/2≤1π。

通过Φ₀的滨化足够实现属于+1衍射级和-1衍射级的移相器的设定之间的最大差，也就是说

-两个热移相器之间的最大温度差，

-两个压电或光电移相器之间的最大电压差，或

-两个声光移相器之间的最大频率差异，

最多是如下这样大的，即，在最大差情况下仍满足(Φ₁–Φ_-1)/2≤1π。

以下结合表格显见，怎样根据本发明的实施方案设定相位变化，以便能够实现在整个相位区域上的相移，并且尽管如此Φ₁和Φ_-1仍不明显变化。在该示例中，通过五个步距覆盖整个2π的相位区域，也就是说，通过相位步距：0·2π/5，然后是1·2π/5，然后是2·2π/5，然后是3·2π/5，最后是4·2π/5。

在这些步距中，应当调设出第一级调制对比度的相位。根据上述公式，对于第二级调制对比度来说，相位双倍那么强地变化(即以(Φ₁–Φ_-1)代替(Φ₁–Φ_-1)/2)，从而如下地针对第二级调制对比度说明经过4π的相位步距。

在此，如上述地，Φ₁和Φ₂可以再次沿相反方向且数值相等地变化，即，根据Φ₁＝–Φ₂。

如所说明地，针对第一级调制对比度的以1.2·π进行的相位变化，例如表达式

并不是以1.2·π变化，而是仅以0.2·π变化。然而，为此同时Φ₀以π变化。在此必须强调的是，Φ₀和表达式

在不同项下起作用并且不是简单地作为总和起作用(参见上述的属于第一级调制对比度的公式)。可以将任意相位变化在整个相位区域2π上设定作为Φ₀以π相位阶跃的结果，而不必为此由移相器设定极端的变化。尤其可以设置的是，Φ₀针对所有采集的显微镜图像仅在正好两个值之间进行调设，它们以π区别开。

因而根据上表，针对位于1π和2π之间的第一级调制对比度借助Φ₀相位变化设定相位变化，而

不以多于1π来变化。

上述表格的教导可以针对任意数量的n个步距来代替5个步距来概括。在此，针对第一级调制对比度的相位区域2π，或针对第二级调制对比度的相位区域4π在具有尤其相同的间距的n个步距中设定。

可以采集到具有以π区别开的0衍射级的两个(尤其是正好两个)不同相位值Φ₀的换算成高分辨率图像的显微镜图像。此外也可以适当选择Φ₀的绝对值。因此，通过Φ₀确定了z平面，在其中，照明图案具有最大调制对比度，也就是说，该图案的最亮和最暗区域之间具有最大的亮度差异。因此，调制对比度与z具有相关性，其受Φ₀的影响。采集显微镜图像的Φ₀的两个绝对值现在可以如下选择，即，使照明图案的与z相关的调制对比度在探测平面内具有最大值。在此，探测平面被认为是锐化地成像到探测器/摄像头上的平面。一般性地，可以应用Φ₀绝对值，其中，调制对比度至少不具有最小值；Φ₀绝对值也是适用的，其中，与z相关的调制对比度与其最小值相比更接近其最大值。

虽然所述变型方案探讨了三个衍射级，但这些数量不应被解释为上限。也可以存在其它路径区段，它们相应于其它的例如-2衍射级和+2衍射级。所作出的陈述也适用于这些情况。如果应用其它衍射级，则理想的数量值例如可以与在此说明的值不同，其中，仍然通过所说明的值实现了优点。

对-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束的描述涉及针对特定的定向的照明图案的相位变化。为了计算高分辨率图像，也采集其它定向的照明图案。在此，同样设定所描述的不同相位变化。属于0衍射级的分射束/路径区段的相位变化的陈述因此涉及同一定向的照明图案，并且以类似方式也针对其它照明图案定向来执行。

本发明还涉及具有光学***的光学显微镜，其如上述设计。所述方法变型方案也被看作为根据本发明的光学***的变型方案。在此，尤其是光学***的控制单元可以被设立成用于如下这样地驱控移相器，即，达到属于方法变型方案所述的结果。在另外的实施例中，所说明的数量值可以有偏差；尤其是可以实现与所说明的值有最多10％或20％的偏差，由此至少部分获得本发明的所述优点。

附图说明

以下将参考示意图来描述本发明的另外的特征：

图1示出三个分射束的波值矢量示意图，它们应当相应于0衍射级、+1衍射级和-1衍射级并且相互干涉；

图2示意性示出根据本发明的具有光学***的光学显微镜的实施方式；

图3示意性示出根据图2的光学***的实施方式；

图4示意性示出根据图2或3的光学***的部分的示例性的设计方案；并且

图5示意性示出分射束在根据本发明的光学显微镜的波导片上或其之后的定位和偏振方向。

相同组件在所有附图中设有相同的附图标记。

具体实施方式

图2示意性地示出了根据本发明的光学显微镜1的实施方式，其包括根据本发明的光学***95。

显微镜1包括光源4，其发送出光5，该光可以经由输入选择设备8传导至光学***95的波导片90的不同的输入端。波导片90或由波导片90和输入选择设备8的组合是结构化设备91，通过该结构化设备，使离开波导片90的光适用于具有结构化照明的显微镜(SIM)。

输入选择设备8在此通过具有一个或多个可转动的反射镜或其它可转动的光偏转的元件的扫描仪8形成。然而，在以下描述中该扫描仪8也可以用其它尤其是以声光方式工作的可变的射束换向装置来替代。

光源4可以如图2中所说明地包括多个激光。在光源4与扫描仪8之间可以可选地应用具有多个半透明的反射镜阶梯6，以便将所有激光的光路集中成共同的光路。此外，可选地还可以设置可声光设定的滤光器(AOTF)7和透镜23或散光器23。

取决于扫描仪8的偏转方向地可以选出波导片90的不同的输入端。图2示出了作为可选设计方案的多个光纤维11.1、11.2和11.3，其将光从扫描仪8导向波导片90的不同输入端。

波导片90的每个输入端通向多个输出端，这些输出端布置成点图案。经由输入端进入的光因而成点图案地离开波导片90。点图案由相干的光线束构成，它们可以在样本平面20内干涉成照明图案。因为波导片90的每个输入端都与不同的输出端相连，所以能够在不同的点图案之间进行切换。

波导片90的输出端可以布置在光瞳平面内。因而点图案在光瞳平面内导致样本平面20内的例如条带的结构化的强度图案。

离开波导片90的结构化的光15经由不同的光学元件导向样本平面20，这些光学元件除了其它组件之外还可以包括光学元件18，例如管镜或缩放***18和物镜19。

如图2中所示，显微镜1也可以包括可运动的导流板27，其布置在扫描仪8与波导片90之间。取决于导流板27的定位地，光要么传导至波导片90要么绕过波导片90直接传导至样本平面20。

导流板27可以包括两个反射表面9和16，它们彼此刚性相连。反射表面9将光从扫描仪8反射至其中一个光纤维11.1、11.2、11.3。反射表面16将光15从波导片90的输出端反射至光学元件18和物镜19。

来自样本的光利用探测器或相机28来探测。例如可以应用(二向色性)分光器24，以便将来自样本的光传导至探测器/相机28(并非至波导片90)。另外的探测器22可以被设置成用于激光扫描过程，在该激光扫描过程中，导流板27如下这样地布置，即，使光5不经由波导片90传播。在探测器22和相机28之前可以可选地分别应用透镜和滤光器26。

控制单元21可以被设立成用于控制波导片90的稍后将详细描述的移相器。

参考图3进一步描述示例性的波导片90的设计。波导片90包括基底70，其例如可以是石英玻璃。在基底70内部形成路径，它们具有与基底70不同的折射指数。由此可以实现光沿这些路径传导。波导片90包括多个输入端31、41、51，它们分别与以下被称为光导路径32、42、52的路径相连。光纤维11.1、11.2、11.3可以可选地应用，以便将光传导至不同输入端31、41、51。

每个光导路径32、42、52导向各自的分光器(英文：Splitter)33、43、53，分光器将光导路径32、42、52***为多个部分，它们被称为路径区段34～36、44～46、54～56。每个路径区段通向各自的输出端37～39、47～49、57～59，在那里光离开波导片90。

在所示示例中，提供第一、第二和第三输入端31、41、51。与第一输出端31相连的输出端37至39形成第一点图案。相应地，第二输入端41的输出端47至49和第三输入端51的输出端57至59形成第二或第三点图案。

波导片90限定了平面P，该平面可以布置在光瞳平面内或与其平行布置。换而言之，光导路径32、42、52的(主)方向展开成平面P，该平面可以平行于光瞳平面并且可以布置在光瞳平面的区域内或光瞳平面内。所有输出端37～39、47～49、57～59因而布置在该区域内或光瞳平面内。

光瞳平面内的点图案在空间上相应于光栅的不同的衍射级的光射束，该光栅传统地布置在中间图像平面内。衍射级尤其包括零级衍射(其为中间的辐射部分)，+1衍射级和-1衍射级，它们可以与0衍射级保持相同间距。在光瞳平面内，这些0衍射级、+1衍射级和-1衍射级可以形成三个大约沿一条线布置的点。

具有所属的输出端48的中间的路径区段45相应于0衍射级，其中，输出端48可以位于光学显微镜的光轴区域上或其内。具有所属的输出端47、49的两个外部路径区段44、46相应于+1衍射级和-1衍射级。0衍射级、+1衍射级和-1衍射级的光分量在样本平面内进行干涉并且在那里形成照明图案。为了计算高分辨率图像，依次采集具有不同照明图案的多个样本图像。在此，一方面通过如下方式产生不同定向的照明图案，即，依次照亮不同的输入端31、41、51。此外利用特定的输入端的每个照明来采集多个显微镜图像，它们在照明图案相位方面有差异。

为了更改照明图案的相位，在属于0衍射级、+1衍射级和-1衍射级的路径区段44、45、46上应用移相器144、145、146，以便更改在这些路径区段44、45、46内的光程长度。移相器144、145、146集成在波导片90内并且例如可以是热电移相器、压电移相器、声光或光电移相器。热电移相器例如改变所属的路径区段的温度并由此改变光程长度。以此方式，移相器145改变0衍射级的光的相位值Φ₀；移相器144改变-1衍射级的光的相位值Φ_-1(或者也称为Φ₂)；移相器146设定+1衍射级的光的相位值Φ₁的变化。在此，将如下光例如简称为“+1衍射级的光”，该光经过如下路径区段，该路径区段的输出端如下这样布置或使该光从其输出端如下这样地传输，即，使其在样本平面中进行干涉时相应于中间图像平面内的光栅(在此未应用)的+1衍射级。

如前详述地，0衍射级、+1衍射级和-1衍射级的干涉用的分射束产生了照明图案，其强度以第一级调制对比度和第二级调制对比度振荡。为了更改照明图案的相位，必须更改第一和第二级调制对比度的相位。针对与

成比例的第一级调制对比度地，这方面通过如下方式进行，即，移相器144～146更改相位Φ₀、Φ₁和Φ₂。

相位Φ₁和Φ₂从工作点出发朝不同方向变化。在热电移相器中，例如从初始温度出发(其高于环境温度并且尤其是针对两个路径区段44、46可以是相等的)，加温其中一个路径区段44、46，并且其中另一路径区段44、46较少或不加热，从而其温度下降。优选地，两个路径区段44、46的温度如下这样地变化，即，使Φ₁和Φ₂正好以相同的量变化或者等值。根据在Φ₁和Φ₂之间是否还存在恒定的相位差并且是否以等式进行考虑还是不考虑地，因而可以如下这样地驱控移相器144、146，即，始终满足Φ₁＝–Φ₂或Φ₁＝–Φ₂+const.，其中，const.表示常数，其针对采集显微镜图像的不同相位设定是恒定的。

从上述第一级调制对比度的表达式针对+1衍射级和-1衍射级的相位根据Φ₁＝–Φ₂来变化的情况并且当Φ₀不变(这不是本发明的部分)时能看到的是：

-在第二余弦项中的相位表达式

针对不同的相位设定是恒定的并因而无助于相移，

-在第一余弦项中的相位表达式

必须在2π的范围上变化，借此相移覆盖整个周期。

为了使

覆盖2π范围，Φ₁和Φ₂必须分别以2π变化，即尤其是采用0π至2π范围内的值。为此缺点是需要较大的温度变化。

与此相反，在本发明实施方式中，Φ₁和Φ₂仅分别以1π(或更小)变化，借此使

覆盖π范围。为了仍然可以实现在整个相位范围内的变化，Φ₀可以以π进行调设。由此使在上面的表达式中后面的余弦项的参数以π变化，借此使该余弦项的符号+/-发生变化。

通过符号变换，使得

的变化相应于1π至2π的范围。有利地，因而根据本发明地可以进行在强度调制的整个相位区域上的相位变化，其中，Φ₁和Φ₂只需相对较小地变化，并且因而在路径区段44和46上只需要适度的温度变化。

路径区段44～46及其所属的移相器144～146的上述描述同样适用于具有相应的移相器134～136和154～156的其余路径区段34～36和54～56。

代替集成到波导片内的所述移相器地，也可以在光路内在波导片后方布置单独的移相器，例如是透明的晃动板，它们视翻转角度而定地为经过的光提供不同长度的光程长度。

高分辨率图像现在可以从显微镜图像算得，其中，相对每个照亮的波导片输入端的n个不同相位设定来分别采集显微镜图像。因此，利用三个输入端采集到3n个显微镜图像，并且换算成高分辨率图像。针对所有这些相位设定优选如下这样地驱控移相器，即，使Φ₁和Φ₂分别设定到多个在分别具有1π的区间宽度的区间中的不同的值(或者如下这样地驱控，即，使(Φ₁–Φ₂)/2被调设到多个在具有1π的宽度的区间的值)，并且附加地，使Φ₀设定到彼此以π间隔开的两个值。有利地因此移相器只需在相对较小的区间上进行调设。

对于干涉图案内的特别好的对比度来说，输出端47至49的相对的光强度是重要的。第一级调制对比度提供z调制，并且因此导致轴向的分辨率提高(也就是在z方向上/沿光轴)。第二级调制对比度提供横向的分辨率提高。分配器43优选如下这样地设计，即，使在中间输出端48内的强度与在其余输出端47、49时相比更低。例如，在中间输出端48内的强度可以是在到达分配器43的光强度的2％和25％之间。其余光强度以相同部分被分布在两个其余输出端47、49上。这些描述又同样也适用于其余路径区段和输出端。

输出端37～39、47～49和57～59的组在由此产生的点图案的级方面有差异。每个输入端31、41、51与中央的输出端38、48、58相连，这些中央的输出端并排地在中央的区域内形成，中央的区域可以相应于显微镜的光轴。中央的输出端38、48、58之间的间距相对于布置在围绕该中心区的呈圆形的带上的其余输出端37、39、47、49、57、59更小。因为中间的输出端38、48、58可以仅仅是并排布置并且无法在精确的同一定位上，所以其余输出端37、39、47、49、57、59尤其不精确布置在圆圈上，而是布置在呈圆形的带上，其中，输出端37和39相对输出端38具有相同间距，并且同样地，输出端47和49相对输出端48具有相同间距，输出端57和59相对输出端58具有相同间距。

彼此相对转动的不同的点图案相应于样本平面内的彼此相对转动的结构化的强度图案。

除了所示路径区段之外，输入端的光也可以分布到另外的路径区段上。这些路径区段的输出端可以如下这样地布置，即，使它们相应于另外的衍射级，或者也形成其它图案。

波导片90的所有输出端可以布置在共同平面P内，该平面位于光瞳平面上或其内。这通过光从波导片90以一角度相对于光导路径32、42、52的方向耦出来实现。该角度可以是不同于0的任意值，尤其地，该角度可以相对平面P为大约90°或者更一般地在20°和90°之间。

这将进一步参考图4来阐述，其示出了图3的波导片90的示意性的细节。图4是波导片90的横截面视图，以此，该视图垂直于图3的视图。

图4示出了经过基底70通向输出端37的路径区段34。为了使光转向和耦出，在基底70内设置有凹陷部72，其形成表面71或接口71，其与路径区段34邻接。因而来自路径区段34的光在接口71上例如通过完全内部反射而变向，然后经过波导片90并且在与凹陷部72和接口71对置的一侧离开该波导片。接口71上的反射角度大约是90°。图4以虚线示出扩展的光束，其中，扩展的光束的中央的虚线95说明了光的输出方向75。该输出方向相对波导片的平面成(约)90°。从接口71反射的光离开波导片90的区域被称为输出端37。这一区域可以是基底70与包围用的介质(典型的是空气)之间的接口。

如果表面71是空气与基底/各自的路径区段之间的接口，则渐逝的光场将侵入空气中。对于典型应用的光波长来说，该渐逝的场例如可以为约100nm。基于与空气粒子的交互作用，使得该渐逝的场导致对表面71的损坏。为了避免这些缺点，可以给表面71进行涂覆(例如涂覆金属或进行双色涂覆)，进而避免渐逝的场与空气的交互作用。替选地可以设置有具有遮盖部的凹陷部72，并且填充以诸如氩气的保护气体。于是，表面71接触的是不与渐逝的场发生交互作用的保护气体。

在完全内部反射的情况下也可以在表面71上使用反射镜。

在接口71上反射之后，光束发生扩展并因而以与其中的光束在接口71离开波导片90的情况下相比更大的横截面离开波导片90，而不会提前横贯基底。通过该更大横截面，使得峰值强度在该横截面上降低。该降低的峰值强度确保，在光离开波导的表面37上不会出现损坏。因而有利地无需另外的元件(例如光纤维上应用的端盖)，以便使光从波导片90耦出。取而代之，光可以简单地从基底70逸出，而无需另外的元件。

附加的光学元件，例如微透镜或半波板，可以直接安装在输出端上(也就是在基底的使反射光逸出的地方)。当光在接口/反射镜71的一侧上离开波导片时，则微透镜或其它组件的这种高效布置方案和固定方式是无法实现的。

每个分光器的效率与进入的光的偏振有关。该光优选沿进行分配(通过图3的箭头示出)的方向线性偏振。然而，SIM需要优选垂直于该定向的偏振。因而有利的是，光的偏振在分配器后方转动。

这方面详细地参考图5阐述，其在左侧部分示出了三个点图案。第一点图案包括光瞳平面内的光点81、82、83，它们相应于输出端37至39。第二点图案包括光点84至86，它们相应于输出端47至49。最后第三点图案包括光点87至89，它们相应于输出端57至59。每个光点81至89的偏振方向用箭头标出。

两个半波板可以用于使偏振方向始终以90°转动。这种半波板25在图2中在波导片90与样本平面20之间示出。半波板25优选直接布置在波导片90的输出端上。以此方式，使得板25的更小横截面就足够了。第一半波板前后的光点/光斑81～89的偏振方向在图5的中间区域中用箭头示出。该中间的区域也示出了第一半波板的快速的轴线96的定向。应当注意的是，仅两个半波板的轴线之间的角度是重要的，而不是其绝对的取向。图5的右侧部分示出了第二半波板前后的光斑81～89的偏振方向。也说明了第二半波板的快速的轴线97。如图5的右侧部分所示地，每个光点的偏振方向转动了90°并且现在垂直于将相同点图案的点81～83彼此相连的线。

参考图3地，基底的表面也可以在每个输出端37上设有结构物，该结构物起到半波板作用，由此替代了两个半波板的其中一个。

利用包括波导片的所述光学***可以在其定向和相位方面有差异的不同照明图案之间快速变换。在此，光学***可以节约空间地且具有少量可运动的组件地设计。通过相应于0衍射级的光导路径上的有利的相位变化，可以特别高效地提供不同相位的照明图案。附图中所示的实施例也可以如下这样地调制，即，使结构化设备无波导片地设计。例如可以代替波导片地使用分流器和光纤维，利用它们产生了附图示例所述的同一点图案。也可以使用光栅或相位调制器代替波导片，以便产生多个相干的的分射束。针对传导直至样本平面的每个分射束，可以存在至少一种自己的移相器，从而使所有分射束可以彼此无关地相移。通过针对其不存在移相器的光栅产生的分射束优选被遮隐，之后其到达样本平面。

附图标记列表

1                        光学显微镜

4                        光源

5                        光

6                        用于组合射束路径的反射镜阶梯

7                        AOTF

8                        扫描仪

9、16                     可运动的导流板的反射表面

10                       二向色性分光器

11.1、11.2、11.3           光纤维

15                       离开波导片的结构化的光

18                       缩放***

19                       物镜

20                       样本平面

21                       控制单元

22                       探测器

23                       透镜

24                       二向色性分光器

25                       具有半波板的输出端偏振单元

26                       滤光器

27                       可运动的导流板

28                       相机

31、41、51                 波导片的输入端

32、42、52                 光导路径

33、43、53                 波导片内形成的分配器

34，35，36；44、45、46；

54、55、56                 波导片的路径区段

37、38、39；47、48、49；

57、58、59                 波导片的输出端

70                       波导片的基底

71                       用于使来自波导片的光偏转的接口

72                       波导片的基底内的凹陷部

75                       光从输出端逸出的方向

81至89                   光瞳平面内的光点

90                       波导片

91                       结构化设备

95                       光学***

96、97                    半波板的快速的轴线

134、135、136              路径区段34、35、36的移相器

144、145、146              路径区段44、45、46的移相器

154、155、156              路径区段54、55、56的移相器

P                        通过波导片限定的平面

Claims (15)

1.用于运行具有结构化照明的光学显微镜的方法，所述方法包括：

-借助结构化设备(91)提供照明图案，所述结构化设备将射入的光***为至少三个相干的、相应于光的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束，

-其中，通过如下方式产生所述照明图案的不同相位，即，利用移相器(134、136、144、146、154、156)设定针对所述分射束的不同的相位值，并且

-针对其中每个所述照明图案分别采集至少一个显微镜图像，并且将所述显微镜图像换算成高分辨率图像，

其特征在于，

-移相器(134、136、144、146、154、156)不仅被设置成用于+1衍射级和-1衍射级的分射束，而且有至少一个移相器(135、145、155)还被设置成用于0衍射级的分射束，

-为了提供不同相位的多个照明图案，利用属于0衍射级的所述至少一个移相器(135、145、155)设定至少两个不同的相位值(Φ₀)，并且将借此采集到的显微镜图像换算成所述高分辨率图像。

2.根据权利要求1所述的方法，

其中，利用属于0衍射级的移相器(145)设定两个不同的以π区别开的相位值(Φ₀)，并且分别采集至少一个显微镜图像，将所述至少一个显微镜图像换算成所述高分辨率图像。

3.根据权利要求2所述的方法，

其中，针对属于0衍射级的移相器(145)的以π区别开的两个相位值(Φ₀)中的每个相位值分别利用属于-1衍射级和+1衍射级的移相器(144、146)设定多个不同的相位值(Φ₁、Φ₂)，并且针对每个设定的相位值分别采集至少一个显微镜图像，将所述至少一个显微镜图像换算成所述高分辨率图像。

4.根据权利要求1所述的方法，

其中，为了提供不同的照明图案，属于-1衍射级和+1衍射级的两个移相器(144、146)从工作点出发在相反方向上进行调设。

5.根据权利要求4所述的方法，

其中，属于-1衍射级和+1衍射级的移相器(144、146)从工作点出发在相反方向上进行调设，从而使属于-1衍射级和+1衍射级的所产生的两个相位值(Φ₁、Φ₂)以同一数值但以不同符号进行变化。

6.根据权利要求1所述的方法，

其中，为了提供不同的照明图案，将属于-1衍射级和+1衍射级的移相器(144、146)在如下区间中进行调设：所述区间最多包括第一级调制对比度的为π的相位变化，并且

其中，为了提供第一级调制对比度的、相应于大于π的相位变化的相位变化，附加地利用属于0衍射级的移相器(145)设定相位值(Φ₀)的变化。

7.根据权利要求1所述的方法，

其中，为了提供不同的照明图案，对属于-1衍射级和+1衍射级的移相器(144、146)进行调设，使得始终适用的是：

0π≤(Φ₁–Φ_-1)/2≤1π，

其中，(Φ₁–Φ_-1)/2说明了第一级调制对比度的相位值，Φ₁说明了属于1衍射级的相位值，并且Φ_-1说明了属于-1衍射级的相位值，

其中，为了提供第一级调制对比度的位于1π至2π的区间内的相位变化，属于0衍射级的相位值(Φ₀)以π改变，并且属于-1衍射级和+1衍射级的移相器(144、146)与之前一样进行调设，使得始终适用的是：

0π≤(Φ₁–Φ_-1)/2≤1π。

8.根据权利要求1所述的方法，

其中，所述结构化设备(91)包括波导片(90)，在所述波导片内将射入的光***到至少三个路径区段(34～36、44～46、54～56)上，所述至少三个路径区段通向至少三个输出端(37～39、47～49、57～59)，其中，所述至少三个输出端(37～39、47～49、57～59)及其所属的路径区段(34～36、44～46、54～56)相应于光的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级。

9.根据权利要求8所述的方法，

其中，所述移相器(134～136、144～146、154～156)在所述波导片(90)上设置在属于-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的路径区段(34～36、44～46、54～56)上。

10.根据权利要求9所述的方法，

其中，将热移相器、压电移相器、光电移相器或者声光移相器用作移相器(134～136、144～146、154～156)。

11.根据权利要求10所述的方法，

其中，属于+1衍射级和-1衍射级的移相器(134、136；144、146；154、156)的设定之间的最大差，也就是：

-两个热移相器之间的最大温度差，或

-两个压电移相器或光电移相器的设定之间的最大电压差，或

-两个声光移相器的设定之间的最大频率差异，

至多是使得在所述最大差的情况下(Φ₁–Φ_-1)/2≤1π仍适用那么大，其中，Φ₁–Φ_-1说明了在所述最大差的情况下实现的属于-1衍射级和+1衍射级的相位变化之间的差。

12.根据权利要求1所述的方法，

其中，采集具有属于0衍射级的两个不同相位值(Φ₀)的、被换算成高分辨率图像的显微镜图像，所述两个不同相位值以π区别开并且其绝对值被选择成使所述照明图案的与z相关的调制对比度在探测平面内具有最大值，所述探测平面锐化地成像到探测器上，其中，z说明了光的传播方向。

13.用于在光学显微镜中进行结构化照明的光学***，所述光学***具有：

结构化设备(91)，所述结构化设备将射入的光***成至少三个相干的相应于光的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级的分射束，

多个移相器(144～146)，所述多个移相器被设立成用于使所述分射束的相位发生变化，以便设定照明图案的不同相位，

其特征在于，

所述光学***包括控制单元(21)，所述控制单元被设立成用于不仅利用属于-1衍射级和+1衍射级的移相器(134、136、144、146、154、156)设定不同的相位变化，而且还利用属于0衍射级的一个或多个移相器(135、145、155)设定至少两个不同的相位值，并且将在此采集到的显微镜图像换算成高分辨率图像。

14.根据权利要求13所述的光学***，

其中，所述结构化设备(91)包括波导片(90)，在所述波导片内将射入的光***到至少三个路径区段(34～36、44～46、54～56)上，所述至少三个路径区段通向至少三个输出端(37～39、47～49、57～59)，其中，所述至少三个输出端(37～39、47～49、57～59)及其所属的路径区段(34～36、44～46、54～56)相应于光的-1衍射级、0衍射级和+1衍射级。

15.光学显微镜，所述光学显微镜具有根据权利要求13所述的光学***。

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