CN110531065B - 一种基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片 - Google Patents
一种基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110531065B CN110531065B CN201810516452.3A CN201810516452A CN110531065B CN 110531065 B CN110531065 B CN 110531065B CN 201810516452 A CN201810516452 A CN 201810516452A CN 110531065 B CN110531065 B CN 110531065B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- microspheres
- hydrogel
- whole blood
- microsphere
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0887—Laminated structure
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/12—Specific details about materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片。该芯片中,所用水凝胶为由聚乙二醇二丙烯酸酯、光引发剂和免疫微球交联而得。该微流控芯片,包括位于上层的孵育通道和位于下层的血浆分离检测通道和位于上下层之间的滤膜;所述孵育通道两端开口,分别为样品进样口和样品出样口;所述全血分离检测通道一端开口;所述全血分离检测通道中填充有聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶体系。该发明可以有效简化血液检验的步骤、实现社区医疗和家居保健中的微创即时检验,有助于居民健康状态的实时监测和疾病的早期预警与诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物领域,涉及一种基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片。
背景技术
即时检验(Point-of-care Testing,POCT)是指在采样后立即进行样品的快速检验分析,省去实验室化验的复杂处理程序和高昂的专业设备的一种检验方法,可以实现检验手段的临床化、社区化、家用化和个性化1。基于微流控芯片(Microfluidic Chips)的检测技术可以在微米尺度的流道和反应室内实现化学分析或生物检验,具备小型化、便携化、操作简便、样品用量少、检测灵敏度高等优点,极大程度地满足了即时检验的要求2。然而,目前的微流控芯片检测技术大都需要额外的血液样品预处理步骤3,4。在血液检测中,往往使用血清或血浆样品,避免因为溶血产生血红蛋白和乳铁蛋白而干扰检测效果5,6,而常规的血液分离技术需要使用台式的离心机,不利于临床采用后即时检验6,7。为此,有人开发了基于微流控芯片的血液分离技术,使血液分离设备具备更好的便携性和易操作性8,具备与检测芯片整合的潜能。然而,已报道的血液分离芯片均应用于毫升级别血液样品的分离,需要结合专业的静脉采血,不能很好地结合社区医疗和家居保健中常用的指尖采血等微创的采血方式,因此限制了检测的便捷性。为此,如果能够研发一种能同时从微量全血中分离血浆并检测血浆中生物分子的微流控芯片,真正实现微量血液样品预处理和检测的一体化,将对即时检验的社区化和家居化有着不可估量的推动作用,因此具有研发的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片。
本发明提供的水凝胶,为由亲水高分子材料和免疫微球组成;
所述亲水高分子材料呈现三维网状结构,其中包裹所述免疫微球。
上述水凝胶中,所述免疫微球在三维网状结构中均匀分布;
所述水凝胶具体可为由亲水高分子材料、光引发剂和免疫微球交联而得。
所述亲水高分子材料为聚乙二醇二丙烯酸酯;所述光引发剂为2-羟基-2-对甲基苯丙酮(2-Hydroxy-2-Methylpropiophenone,Darocur 1173)、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(4-(2-hydroxyethoxy)phenyl-(2-hydroxy-2-propyl)ketone,Irgacure2959)或2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(2,2′-dimethoxy-2-phenyl-acetophenone,Irgacure651);
所述免疫微球为抗体修饰的微球a、微球b或微球c中任意一种;所述微球a为聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、三氧化二铁微球、甲基丙烯酸环氧丙酯微球、氨基聚苯乙烯微球或脲醛树脂微球;所述微球b为羧基修饰的所述微球a;所述微球c为羟基修饰的所述微球a;抗体修饰的方法为各种常规方法。所述抗体具体可为各种捕获抗体,如IGF-1蛋白检测试剂盒(Human IGF-I DuoSet ELISA kit)中的捕获抗体;
所述免疫微球的直径为1.0-10μm;
所述聚乙二醇二丙烯酸酯、光引发剂和免疫微球的体积比为196:1-10:20-200;
所述交联为光交联;
所述光交联的具体条件如下:紫外曝光1-30秒,具体为5秒。
另外,本发明还要求保护聚乙二醇二丙烯酸酯或所述聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶体系在全血分离和/或检测血浆蛋白质成分或在制备全血分离和/或检测的产品中的应用;
所述聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶体系中包裹有免疫微球。
上述应用中,所述全血分离和/或检测的产品为芯片;具体为微流控芯片;更具体为全血分离和检测一体化微流控芯片。
本发明还要求保护一种微流控芯片,该微流控芯片包括位于上层的孵育通道和位于下层的血浆分离检测通道和位于上下层之间的滤膜;
所述孵育通道两端开口,分别为样品进样口和样品出样口;
所述全血分离检测通道一端开口;该开口可位于所述孵育通道一端开口外侧;
所述全血分离检测通道中填充有所述聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶体系。
上述微流控芯片中,所述滤膜的孔径为0.1-2.5μm,具体为1μm;
所述滤膜为聚碳酸酯滤膜、硅烷化修饰的聚碳酸酯滤膜或聚矾多孔滤膜。
所述硅烷化修饰为各种常规方法,如可按照包括如下步骤的方法进行:先将所述聚碳酸酯膜进行活化,再用硅烷化试剂进行修饰而得;
具体的,所述活化为等离子体处理或氧等离子体处理;所述氧等离子处理步骤中,时间为60-300秒,具体为90秒;
所述硅烷化试剂为APTES的水溶液;所述APTES的水溶液的质量百分浓度为0.2-30%;具体为5%;所述修饰步骤中,温度为60-90℃;具体为80℃;时间为10-30分钟;具体为20分钟。
本发明还要求保护一种用于全血分离和检测的试剂盒,包括前述本发明提供的所述微流控芯片和封闭液。
上述试剂盒中,所述封闭液由Tween-20和PBS缓冲液组成;所述mL Tween-20和PBS的体积比具体为50:1000。封闭液的作用是封闭所述免疫微球上的非特异性位点。
另外,上述本发明提供的微流控芯片或所述试剂盒在全血分离和检测中的应用,也属于本发明的保护范围。
所述分离和检测步骤中,包括:将待测血浆样品注入所述孵育通道后孵育5分钟-30分钟,具体为10分钟。
本发明基于聚乙二醇二丙烯酸酯(Poly(Ethylene Glycol)Diacrylate,PEGDA)水凝胶提供了一种微量全血分离和血浆检测一体化芯片,其中血浆分离和检测体系由包裹了免疫微球的PEGDA水凝胶组成,可以通过毛细作用从全血样本中吸附血浆并检测生物分子。所用水凝胶体系是由亲水高分子材料通过网状交联方式形成的多孔三维结构,可以通过毛细作用吸附水溶液,因此具备分离和吸附血浆样本的能力。该体系内均匀包裹的免疫微球结合了生物探针,可以达到检测血浆样本中生物分子的目的。由于该体系的比表面积远远大于传统检测体系,分子扩散距离较短,将大大加快血浆分离和检测的速度。该发明有望制备一种微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片,该技术的应用可以有效简化血液检验的步骤、实现社区医疗和家居保健中的微创即时检验,有助于居民健康状态的实时监测和疾病的早期预警与诊断。从全血中分离出血浆后,剩余的血细胞还可以被收集用于细胞成分检测,从而可以提高血液样品的利用率。此外,该微流控芯片可以和智能手机联用,构建手机程序读取样品检测结果,大大提高检测的便携性。
附图说明
图1为PEGDA水凝胶芯片结构示意图(a)剖面图(b)平面图(c)实物图。
图2为微球-水凝胶体系(a)光聚合形成水凝胶微柱(b)牢固包裹微球的水凝胶。
图3为PEGDA水凝胶微柱吸附血浆的全过程。
图4为PEGDA水凝胶微柱吸附血浆速度趋势。
图5为水凝胶微流控芯片分离血液实验过程示意图。
图6为水凝胶微流控芯片分离血液实验结果(a)溶血血浆样品处理结果(b)全血样品处理结果(c)PBS缓冲液处理结果。
图7为芯片检测结果图像(a)空白对照(b)2ng/mL IGF-1标准品(c)8ng/mLIGF-1标准样品(d)稀释5倍全血样品。
图8为芯片检测结果灰度直方图。
图9为芯片检测结果标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述,但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1、基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测微流控芯片的制备
1.1实验材料
1.1.1实验试剂:
1)聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)预聚物及其引发剂,购于美国Dow Corning公司;
2)负性光刻胶SU-8 2050及其显影剂,购于美国Micro Chem公司;
3)聚碳酸酯薄膜(Polycarbonate membrane,孔径1μm),购于美国MerckMillipore公司;
4)IGF-1蛋白检测试剂盒(Human IGF-I DuoSet ELISA kit)购于美国R&D公司。
5)TMB显色试剂盒,购于上海生工生物工程股份有限公司。
6)3-(三氯甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(3-(Trichlorosilyl)propylmethacrylate,TMB),购于美国Fluka Chemicals公司。
7)石蜡油(Paraffin),购于美国Acros公司。
8)氨丙基三乙氧基硅烷(3-(Aminopropyl)Triethoxysilane,APTES),聚苯乙烯微球(Latex beads,polystyrene,直径1.0-1.9μm,w/v 5%),购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
9)聚乙二醇二丙烯酸酯(Poly(Ethylene Glycol)Diacrylate,PEGDA,700MW),2-羟基-2-对甲基苯丙酮(2-Hydroxy-2-Methylpropiophenone,HMPP),三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷(Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane),购于美国Sigma公司。
10)磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4,8g NaCl,0.2g KCl,1.15g Na2HPO4,0.2gKH2PO4,1000mL双蒸水),碳酸盐缓冲液(CBS,0.4134g Na2CO3,0.5130g NaHCO3,50mL双蒸水),清洗缓冲液(0.5mL Tween-20,1000mL PBS),封闭液(50mLTween-20,1000mL PBS)均为实验室配制。
1.1.2实验样本:全血样品通过小鼠眼眶静脉采血法获取,每次取1mL,加入200μL肝素钠抗凝;血浆样品:新鲜采集的全血样品在室温静置2小时,然后在1500转/分钟的转速下离心10分钟,获取200μL的上清液;溶血后的血浆样品:全血样品4℃静置1天,然后在1500转/分钟的转速下离心10分钟,获取200μL的上清液。
1.2实验仪器:KG-2A紫外光刻机购于中国上海学泽光学机械有限公司,PDC-32G等离子体清洗机购于美国Harrick Plasma公司,DB-3型数显控温电热板购于江苏金坛市环宇科学仪器厂,KW-4A型台式匀胶机购于中国昆山力电精密机械有限公,DMI40000型倒置显微镜购于德国Leica公司,离心机购于美国Beckman coulter公司,超高速离心机购于美国Beckman coulter公司,Epoch酶标仪购于美国BioTek公司。
1.3实验方法
1.3.1基于PEGDA水凝胶的微流控芯片的制备
主要分四步完成:
第一步:软刻蚀法和浇铸法制备PMDS微流道基片:
清洗硅片。将硅片交替浸泡在无水乙醇和双蒸水中超声洗涤3次。
烘片。采用电热板95℃烘片1小时。
甩胶。设置匀胶机转速依次为500转/分钟匀胶12秒和1000转/分钟匀胶60秒。
前烘。95℃10分钟;
在胶面覆盖芯片通道掩膜版,光刻机下紫外曝光6次,每次持续曝光10秒,中间各间隔5秒;
后烘。95℃烘10分钟;
显影。显影液和异丙醇交替冲洗未凝固的凝胶2次。
表面硅烷化处理。将模具与10μL三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷放置于干燥器中,抽真空处理8小时,在模具表面修饰疏水薄层。
准备PDMS预聚物。PDMS预聚物及其引发剂以10:1的比例混合均匀。
浇铸。PDMS预聚物和引发剂混合物均匀倒在模具上。
去除气泡。模具水平放置于干燥器中,抽真空处理15分钟,若还有小气泡则用氮气气流将其吹走。
烘片。70℃烘3小时。
打孔。将PDMS微流道基片从模具上取出,用2mm孔径的打孔器在合适的位置打孔,预留进样口和出样口。
第二步:键合聚碳酸酯滤膜和PDMS基片:
准备5%APTES水溶液。准确量取40μL APTES加入760μL去离子水,充分混匀。
预热。将5%APTES水溶液置于80℃水浴加热。
准备滤膜。用刀片将聚碳酸酯滤膜裁成合适大小。
滤膜表面活化。滤膜双面各用氧等离子体处理聚碳酸酯滤膜90秒。
表面硅烷化修饰。立即将滤膜浸入提前准备好的80℃的5%APTES水溶液,水浴处理20分钟。
干燥。用无尘纸将聚碳酸酯膜表面液体吸干,然后将滤膜保存在通风橱中过夜,挥发表面剩余的水。
键合滤膜和第一层基片。将聚碳酸酯滤膜和一层PDMS基片待键合面朝上放进等离子机,氧等离子体处理90秒后立即键合。
键合第二层基片。将键合了滤膜的PDMS基片和另一层基片共同放进等离子机,待键合面朝上,氧等离子体处理90秒后立即键合。
烘片。60℃烘片3小时。
第三步:准备免疫微球:
离心获取微球沉淀。取200μL微球悬浮液,平均分装在两只离心管中,20000xg离心1分钟,去上清。
微球表面活化。各加500μL碳酸盐缓冲液重悬微球,充分吹打混匀,然后20000xg离心1分钟,去上清。重复本步骤共三次。
孵育捕获抗体。各加100μL IGF-1试剂盒中的捕获抗体溶液(1μg/mL),重悬微球,在摇床上以5转/分钟的转速孵育1小时,然后4℃孵育过夜,获得结合了捕获抗体探针的免疫微球。
清洗免疫微球。20000xg离心1分钟,去上清,然后各加0.5mL PBS缓冲液重悬微球,充分吹打以清洗未结合的捕获抗体。重复本步骤共三次。
封闭。20000xg离心1分钟,去上清,然后各加200μL的封闭液,静置45分钟,封闭微球上的非特异性位点;
第四步:制备免疫微球-PEGDA水凝胶:
制备光交联预聚物。向294mL PEGDA单体中加入6mL HMPP光引发剂,充分混匀。
制备微球-光交联预聚物混合液。取封闭了45分钟的免疫微球悬浮液各200μL,在20000xg离心1分钟,去上清,然后向两份微球沉淀中各加入100μL预聚物,充分混匀。
曝光聚合水凝胶。取2μL微球-光交联预聚物混合液注入芯片下层的血浆分离和检测室,使用光刻机紫外曝光5s;在上层通道中注入2μL封闭液,孵育1小时,即得到本发明提供的微流控芯片。
实施例2、微流控芯片中PEGDA水凝胶性质鉴定
水凝胶固定微球能力测定
实验方法:
吸取10μL配置好的微球-光交联预聚物混合液,滴在载玻片上。
在荧光倒置显微镜下,使用显微镜的紫外激发光曝光处理15s,使接受曝光的部分形成水凝胶微柱,拍照记录。
使用50μL PBS缓冲液冲洗载玻片上的样品3次,在显微镜下观察结果并拍照记录。
实验结果:
图2显示水凝胶微柱可以牢固包裹聚苯乙烯微球,使之不被溶液冲走。实验结果表明,本研究条件下的PEGDA水凝胶能够作为微球的固定载体,建立免疫微球-水凝胶检测体系。
水凝胶吸附血浆速率测定
实验方法:
PDMS微流道表面修饰。在PDMS微流道中通入提前配好的1%TPM石蜡油溶液,充分混匀,静置10分钟使通道表面修饰上烯烃基团,使之能与PEGDA水凝胶微柱紧密结合,然后向通道快速注射大量酒精冲洗残留的TPM和石蜡油,之后使用氮气吹干通道并使用电热板90℃烘20分钟。
制备水凝胶微柱阵列。将微球-水凝胶预聚物混合液通入经过1%TPM修饰的微流道中,覆盖微柱阵列掩膜版,使用光刻机进行紫外曝光20秒。
采集水凝胶吸附血浆全过程图像。注入2μL新鲜采取的小鼠血浆使之充满微流道,在倒置显微镜下静置1小时,观察每隔30秒拍照取样。
测量各个时间段内血浆进入水凝胶的距离。使用倒置显微镜配套软件的标注工具,测量和标注血浆进入微柱的总距离。
分析和计算。计算水凝胶吸附血浆平均速度。
实验结果:
图3显示微柱吸附血浆的全过程。图4显示微柱吸附血浆的趋势是初期高速,中后期保存稳定低速。根据表1数据计算得出,水凝胶厚度为22μm时,平均速度约为0.76μm/s;之后平均速度约为0.06μm/s,仅为前者8%左右。通过计算得出,本研究使用的水凝胶体系(厚度50μm)吸附血浆需用时约10分钟。
表1、水凝胶微柱吸附血浆实验数据
实施例3、微流控芯片吸附蛋白溶液能力鉴定
实验方法:
使用全血样品作为实验组,以溶血血浆样品作为阳性对照、PBS缓冲液作为阴性对照,分别在微流控芯片中注入2μL样品和缓冲液,静置10分钟。
拆卸芯片,用尖头镊子取出微垫,放置在事先制备好的干净盖玻片上,在白色背景前观察。
实验结果:
图5显示水凝胶芯片从全血中吸附血浆的全过程:首先在下层通道注入免疫微球-PEGDA水凝胶预聚物混合液,紫外曝光形成水凝胶;然后在上层通道注入全血;血浆浸润滤膜后接触到水凝胶,被毛细作用吸附。图6表明水凝胶可以吸附带有血红白的血浆,呈现红色(图6(a));无法吸附血细胞,呈现透明(图6(b)),与PBS缓冲液处理的结果一致(图6(c))。实验结果表明,该水凝胶微垫芯片具备过滤全血、吸附血浆的能力。
实施例4、微流控芯片用于全血分离和血浆蛋白质成分的检测实验
实验方法:
按照前文所述方法准备孵育了IGF-1捕获抗体的免疫微球-PEGDA水凝胶微流控芯片,在封闭液封闭1小时后可以用于IGF-1蛋白质检测。
吸去稀释缓冲液,分别加入2μL的封闭液、2ng/mL标准样品和8ng/mL标准样品作为标准曲线,以及2μL稀释5倍的新鲜小鼠全血作为实验样品,在室温下孵育10分钟。
吸去样品,用50μL清洗缓冲液分别冲洗3次。
加入2μL检测抗体(1μg/mL),室温下静置孵育10分钟
吸去检测抗体,用50μL清洗缓冲液分别冲洗3次。
加入2μL标记辣根过氧化物酶的链霉亲和素,避光孵育10分钟。
吸去溶液,用50μL清洗缓冲液冲洗3次。
加入2μL TMB底物,避光孵育15分钟。
使用智能手机拍摄芯片通道的照片,然后用电脑Photoshop转换为灰度图像,同时调节对比度和亮度,然后裁剪大小相同的检测区域。
使用Python语言的Opency、Numpy和Matplotlib程序包建立灰度直方图,并求得各检测区域的平均灰度值。
实验结果:
图7显示检测结果的照片(图7(a)-(d))。图8显示四个检测区域的灰度直方图,可以看出血液样品在标准曲线范围内。图9显示芯片检测结果的标准曲线。根据回归曲线方程计算得出稀释5倍的血样中IGF-1浓度为6.52ng/mL,证明该芯片能够检测全血样品中的蛋白分子,检测极限可达2ng/mL。
Claims (9)
1.一种微流控芯片,包括位于上层的孵育通道和位于下层的全血分离检测通道和位于上下层之间的滤膜;
所述孵育通道两端开口,分别为样品进样口和样品出样口;
所述全血分离检测通道一端开口;
所述全血分离检测通道中填充有水凝胶;
所述水凝胶为由亲水高分子材料和免疫微球组成;
所述亲水高分子材料呈现三维网状结构,其中包裹所述免疫微球;
所述亲水高分子材料为聚乙二醇二丙烯酸酯;
所述免疫微球为抗体修饰的微球a、微球b或微球c中任意一种;所述微球a为聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、三氧化二铁微球、甲基丙烯酸环氧丙酯微球、氨基聚苯乙烯微球或脲醛树脂微球;所述微球b为羧基修饰的所述微球a;所述微球c为羟基修饰的所述微球a;
所述滤膜的孔径为0.1-2.5μm;
所述水凝胶为由亲水高分子材料、光引发剂和免疫微球交联而得;
所述光引发剂为2-羟基-2-对甲基苯丙酮、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮或2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮;
所述聚乙二醇二丙烯酸酯、光引发剂和免疫微球的体积比为196:1-10:20-200;
所述交联为光交联。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于:所述免疫微球的直径为1.0-10μm。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片,其特征在于:所述光交联的条件如下:紫外曝光1-30秒或5秒。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的微流控芯片,其特征在于:所述微流控芯片为全血分离和检测微流控芯片。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的微流控芯片,其特征在于:所述滤膜的孔径为1μm;
所述滤膜为聚碳酸酯滤膜、聚矾多孔滤膜或硅烷化修饰的聚碳酸酯滤膜。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的微流控芯片在制备用于全血分离和/或检测的试剂盒中的应用。
7.一种用于全血分离和检测的试剂盒,包括权利要求1-5中任一项所述微流控芯片和封闭液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于:所述封闭液由Tween-20和PBS缓冲液组成。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于:所述Tween-20和PBS的体积比为50:1000。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810516452.3A CN110531065B (zh) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | 一种基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810516452.3A CN110531065B (zh) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | 一种基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110531065A CN110531065A (zh) | 2019-12-03 |
CN110531065B true CN110531065B (zh) | 2022-08-30 |
Family
ID=68657394
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810516452.3A Active CN110531065B (zh) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | 一种基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110531065B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113607609B (zh) * | 2021-06-01 | 2022-08-16 | 武汉大学 | 基于指压式微流控平台的智能手机成像分析***及其应用 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102171234A (zh) * | 2008-08-05 | 2011-08-31 | 康奈尔大学 | 光交联核酸水凝胶 |
CN102380335A (zh) * | 2011-09-15 | 2012-03-21 | 东南大学 | 核壳型水凝胶胶体晶体微球及其制备方法和用途 |
CN103278643A (zh) * | 2013-05-16 | 2013-09-04 | 中国科学院上海微***与信息技术研究所 | 一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法 |
CN103575882A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-02-12 | 司珂 | 全血的标记免疫分析方法和即时检测*** |
CN105158459A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-12-16 | 南京师范大学 | 一种水凝胶二氧化硅光子晶体微球化学发光法高灵敏度、低背景检测伏马毒素b1的方法 |
CN106124493A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-11-16 | 东南大学 | 分子印迹水凝胶光子晶体微球的制备方法及其应用 |
CN106807461A (zh) * | 2017-01-10 | 2017-06-09 | 北京华科泰生物技术有限公司 | 一种用于荧光免疫检测的微流控芯片及其制备方法 |
CN107096581A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-08-29 | 中国科学院电子学研究所 | 微流控纸芯片及应用其的检测*** |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160018360A1 (en) * | 2014-07-15 | 2016-01-21 | Jun Yang | Microfluidic device for detecting nucleic acids and associated methods |
WO2016172143A1 (en) * | 2015-04-21 | 2016-10-27 | Tufts University | Fabrication of macroporous monodisperse hydrogel microspheres |
-
2018
- 2018-05-25 CN CN201810516452.3A patent/CN110531065B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102171234A (zh) * | 2008-08-05 | 2011-08-31 | 康奈尔大学 | 光交联核酸水凝胶 |
CN102380335A (zh) * | 2011-09-15 | 2012-03-21 | 东南大学 | 核壳型水凝胶胶体晶体微球及其制备方法和用途 |
CN103278643A (zh) * | 2013-05-16 | 2013-09-04 | 中国科学院上海微***与信息技术研究所 | 一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法 |
CN103575882A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-02-12 | 司珂 | 全血的标记免疫分析方法和即时检测*** |
CN105158459A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-12-16 | 南京师范大学 | 一种水凝胶二氧化硅光子晶体微球化学发光法高灵敏度、低背景检测伏马毒素b1的方法 |
CN106124493A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-11-16 | 东南大学 | 分子印迹水凝胶光子晶体微球的制备方法及其应用 |
CN106807461A (zh) * | 2017-01-10 | 2017-06-09 | 北京华科泰生物技术有限公司 | 一种用于荧光免疫检测的微流控芯片及其制备方法 |
CN107096581A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-08-29 | 中国科学院电子学研究所 | 微流控纸芯片及应用其的检测*** |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110531065A (zh) | 2019-12-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006058280A (ja) | 分析チップ | |
WO2004036194A1 (ja) | 分析チップおよび分析装置 | |
CN111650370B (zh) | 新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法及检测装置 | |
JPH07503063A (ja) | 生体分子検定施行法及び当該方法に使用する固相担体 | |
JPS62156561A (ja) | 微量化学試験の材料及び方法 | |
JP4972295B2 (ja) | 免疫分析方法及びバイオチップ | |
JP2007071711A (ja) | 分析チップ | |
JP2011027421A (ja) | 分析チップおよび検体の分析方法 | |
CN108080043B (zh) | 真空负压进样的多通道微流控芯片装置及制备方法与应用 | |
KR20110057416A (ko) | 생체분자 검출용 미세유동 구조물 및 이를 포함하는 미세유동 장치 | |
CN108051588A (zh) | 用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法 | |
JP2007101221A (ja) | 超高速で生体分子反応を測定する方法 | |
CN110531065B (zh) | 一种基于水凝胶的微量全血分离和血浆检测一体化微流控芯片 | |
CN106153891A9 (zh) | 三维生物标志物检测装置、制备方法及检测生物标志物的方法 | |
US11850588B2 (en) | Microfluidic device for detection of analytes | |
Roh et al. | Phosphorylcholine-based encoded hydrogel microparticles with enhanced fouling resistance for multiplex immunoassays | |
JP6687937B2 (ja) | 分析用基板の製造方法 | |
TWI470224B (zh) | 檢測系統及檢測方法 | |
Zhu et al. | PEG-based autonomous capillary system with integrated microbead array for immunoassay | |
Yoon et al. | Lab-on-a-chip biosensors | |
Guan et al. | Non-invasive detection of bladder cancer via microfluidic immunoassay of the protein biomarker NMP22 | |
Li et al. | Versatile microfluidic complement fixation test for disease biomarker detection | |
Taitt et al. | Antimicrobial peptide arrays for detection of inactivated biothreat agents | |
CN116851047A (zh) | 微流控生物芯片、磁珠和套件 | |
Shriver-Lake et al. | Immobilization of biomolecules onto silica and silica-based surfaces for use in planar array biosensors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |