CN110526988A - 一种靶向muc1的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向MUC1的嵌合抗原受体以及靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞，所述靶向MUC1的嵌合抗原受体可以专一性的靶向MUC1，并以CD27信号区作为共刺激信号区，促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，更好的维持细胞的活力和杀伤力。本发明还提供了一种靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向MUC1的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体T细胞及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向MUC1的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
粘蛋白(mucin，MUC)是一种高分子量的糖蛋白，其中MUC1是广泛研究的粘蛋白家族成员之一。研究发现，MUC1在多种肿瘤的表达水平增加，增加程度与肿瘤的恶性程度成正比，而且丧失极性分布，并出现糖基化不完全的情况，从而使得MUC1多肽骨架上的抗原决定簇暴露出来，成为免疫治疗的靶点。同时，MUC1既能被多种MUC1抗体识别，也可被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别和杀伤，且不受MHC限制。因此，MUC1是较为理想的抗肿瘤靶点，成为一种新的肿瘤标记物。
免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其中嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)为当前过继性细胞回输治疗技术最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫***，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到清除恶性肿瘤细胞的目的而受到广泛的关注和研究。因此，结合CAR-T手段，靶向和结合MUC1靶点，作为新的肿瘤治疗药物，对肿瘤的治愈有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种靶向MUC1的嵌合抗原受体以及靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向MUC1的嵌合抗原受体可以专一性的靶向MUC1，并以CD27信号区作为共刺激信号区，促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，更好的维持嵌合抗原受体T细胞的活力和杀伤力。本发明还提供了一种靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种靶向MUC1的嵌合抗原受体，所述靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向MUC1的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向MUC1的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向MUC1的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述CD27信号区的氨基酸序列的氨基端相连，所述CD27信号区的氨基酸序列的羧基端与所述第一信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
在本发明中，所述靶向MUC1的嵌合抗原受体能够与MUC1蛋白发生特异性结合，对表达MUC1的肿瘤细胞，特别是实体瘤细胞具有较强的亲和活性。
可选的，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
可选的，所述靶向MUC1的单链抗体编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:5具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。
在本发明中所述胞外铰链区用于促进所述靶向MUC1的单链抗体与肿瘤上的MUC1结合。
可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:7具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:6。
在本发明中所述跨膜区用于固定所述靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1。
可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:9具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:8。
在本发明中所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD27信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD27信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:10具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:2。
可选的，所述第一信号区包括CD3ζ信号区、FcεRIγ信号区中的至少一种。
进一步可选的，所述第一信号区为CD3ζ信号区。
可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:12具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:11。
在本发明中，CD3ζ信号区为胞内信号传导结构域(第一信号区)，CD27信号区为共刺激结构域(共刺激信号区)，共同作用活化T细胞，特别的，以CD27信号区作为共刺激结构域，可以更好地提升T细胞的活力和杀伤力。
可选的，所述CAR-MUC1的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
可选的，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-MUC1的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:4具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:3。
第二方面，本发明提供了一种靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞，包括如第一方面所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体。
本发明第一方面提供的所述靶向MUC1的嵌合抗原受体以及第二方面提供的靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞，可以专一性地靶向表达MUC1的肿瘤细胞，以CD27信号区作为共刺激信号区，活化T细胞，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性的杀伤肿瘤细胞。
第三方面，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包括如第一方面所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的编码基因。
可选的，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
可选的，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
进一步可选的，所述病毒载体为慢病毒载体。更进一步可选的，所述慢病毒载体包括pWPXLD载体、pLEX-MCS载体、pSico载体和pCgpV载体中的至少一个。具体的，当所述慢病毒载体为pWPXLD载体时，将第二方面所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞的CAR-MUC1的编码基因***pWPXLD载体中的BamHⅠ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点之间。
本发明第三方面提供的所述重组病毒载体可以用于靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞的制备，有利于促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的重组病毒载体。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。
进一步可选的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
本发明第四方面提供的宿主细胞用于提供将如第三方面所述的重组病毒载体进行组装并制备生成相应病毒的场所，由宿主细胞制备的病毒携带有所述CAR-MUC1的遗传信息，具有强侵染性。
第五方面，本发明提供了一种靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
(1)提供靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向MUC1的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列，所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区的编码基因包括如SEQID NO：2所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-MUC1的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-MUC1重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-MUC1重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞。
上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因的5’端相连，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区的编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述CD27信号区的编码基因的5’端相连，所述CD27信号区的编码基因的3’端与所述第一信号区的编码基因的5’端相连。
在本发明中所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-MUC1表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。
可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:13。
所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第一方面部分所述，这里不再赘述。
可选的，所述CAR-MUC1的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
可选的，所述CAR-MUC1的编码基因序列包括如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-MUC1的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:16具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:15。
所述CAR-MUC1的编码基因***到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-MUC1的编码基因***到pWPXLD载体时，所述CAR-MUC1的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。
可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体***都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒***(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒***(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒***(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒***的慢病毒包装***在使用。
可选的，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。
可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。
进一步可选的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、或如第二方面所述的或如第五方面所述的制备方法制得的靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞、或如第三方面所述的重组病毒载体或如第四方面所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用
其中，所述恶性肿瘤包括卵巢癌、肺癌、胰腺癌、***癌、胃癌和结直肠癌中的至少一种，尤其是在制备预防、诊断和治疗卵巢癌的药物中的应用。
所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、如第二方面所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体、如第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的有益效果：
本发明提供的靶向MUC1的嵌合抗原受体可以专一性的靶向MUC1，尤其是产生MUC1的恶性肿瘤细胞，靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞以CD27信号区作为共刺激信号区，促进T细胞在患者体内的扩增，能够高效且特异性的结合肿瘤细胞，对恶性肿瘤细胞产生杀伤效果。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一
一种靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的基因序列
分别制备信号肽、靶向MUC1的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD27信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：14所示，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：5所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：7所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：9所示，所述CD27信号区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：12所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向MUC1的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD27信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的编码基因，所述CAR-MUC1的编码基因如SEQ ID NO：16所示。
(2)构建pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒
将CAR-MUC1的编码基因***到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-MUC1的编码基因***到pWPXLD载体时，所述CAR-MUC1的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端还可加入有终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒，如图1所示为pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒。
(3)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。
(4)靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种靶向MUC1的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu
130 135 140
Val Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Thr Asp Ile Lys
180 185 190
Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser
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Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
210 215 220
Ala Val Tyr Phe Cys Lys Thr Ser Thr Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 2
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu
1 5 10 15
Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro
20 25 30
Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 3
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu
130 135 140
Val Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Thr Asp Ile Lys
180 185 190
Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser
195 200 205
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
210 215 220
Ala Val Tyr Phe Cys Lys Thr Ser Thr Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
260 265 270
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
275 280 285
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
290 295 300
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Lys
305 310 315 320
Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys
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Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln
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Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro Arg Val Lys Phe
355 360 365
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
370 375 380
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
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Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
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Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
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Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
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Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
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Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaactcgtga tgacccagag ccccagctct ctgacagtga cagccggcga gaaagtgacc 60
atgatctgca agtcctccca gagcctgctg aactccggcg accagaagaa ctacctgacc 120
tggtatcagc agaaacccgg ccagcccccc aagctgctga tcttttgggc cagcacccgg 180
gaaagcggcg tgcccgatag attcacaggc agcggctccg gcaccgactt taccctgacc 240
atcagctccg tgcaggccga ggacctggcc gtgtattact gccagaacga ctacagctac 300
cccctgacct tcggagccgg caccaagctg gaactgaagg gaggcggagg atctggcggc 360
ggaggaagtg gcggaggggg atctggggga ggcggaagcc aggtgcagct gcagcagtct 420
gatgccgagc tcgtgaagcc tggcagcagc gtgaagatca gctgcaaggc cagcggctac 480
accttcaccg accacgccat ccactgggtc aagcagaagc ctgagcaggg cctggaatgg 540
atcggccact tcagccccgg caacaccgac atcaagtaca acgacaagtt caagggcaag 600
gccaccctga ccgtggacag aagcagcagc accgcctaca tgcagctgaa cagcctgacc 660
agcgaggaca gcgccgtgta cttctgcaag accagcacct tctttttcga ctactggggc 720
cagggcacaa ccctgacagt gtctagcacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 780
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 840
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aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1380
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<210> 5
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 6
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 7
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 10
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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gagcctgcct gctccccc 138
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
<210> 15
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
20 25 30
Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser
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Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg
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Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
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Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
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Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser
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Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
165 170 175
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln
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Lys Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Phe Ser Pro Gly Asn
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Thr Asp Ile Lys Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
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Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr
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Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Lys Thr Ser Thr Phe Phe Phe
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
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Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
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His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
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Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
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Tyr Cys Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
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Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
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Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
370 375 380
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
385 390 395 400
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
405 410 415
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
420 425 430
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
435 440 445
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
450 455 460
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
465 470 475 480
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 16
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
gaactcgtga tgacccagag ccccagctct ctgacagtga cagccggcga gaaagtgacc 120
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cagggcacaa ccctgacagt gtctagcacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 840
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gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggaaa 1020
tatagatcaa acaaaggaga aagtcctgtg gagcctgcag agccttgtcg ttacagctgc 1080
cccagggagg aggagggcag caccatcccc atccaggagg attaccgaaa accggagcct 1140
gcctgctccc ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1200
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1260
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1320
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1380
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1440
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 1488

Claims (10)

1.一种靶向MUC1的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向MUC1的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向MUC1的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述第一信号区包括CD3ζ信号区。
3.如权利要求2所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CAR-MUC1的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
4.一种靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体。
5.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包括如权利要求1-3任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的编码基因。
6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其特征在于，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求5或6任一项所述的重组病毒载体。
8.一种靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向MUC1的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因包括如SEQID NO：1所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列，所述胞内信号区包括共刺激信号区和第一信号区，所述共刺激信号区包括CD27信号区，所述CD27信号区的编码基因包括如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-MUC1的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-MUC1重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-MUC1重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞。
9.如权利要求8所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、或如权利要求4所述的或如权利要求8-9任一项所述的制备方法制得的靶向MUC1的嵌合抗原受体T细胞、或如权利要求5-6任一项所述的重组病毒载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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