CN109957025A - 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109957025A
CN109957025A CN201711423229.6A CN201711423229A CN109957025A CN 109957025 A CN109957025 A CN 109957025A CN 201711423229 A CN201711423229 A CN 201711423229A CN 109957025 A CN109957025 A CN 109957025A
Authority
CN
China
Prior art keywords
targeting
cell
chain antibody
antigen receptor
chimeric antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201711423229.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张宏玲
龙丽梅
钟春颖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd filed Critical Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201711423229.6A priority Critical patent/CN109957025A/zh
Publication of CN109957025A publication Critical patent/CN109957025A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

本发明提供了一种靶向DR5的单链抗体，所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种包括所述靶向DR5的单链抗体的嵌合抗原受体T细胞，所述靶向DR5的嵌合抗原受体可以专一性的靶向DR5，促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，更好的维持细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向DR5的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向DR5的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
癌症已成为威胁人类生命的元凶，发病率成上升趋势，人们从寻找诱导引起肿瘤细胞凋亡或者克服肿瘤细胞对凋亡耐受的角度入手，发现了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，是能够诱导细胞凋亡的肿瘤坏死因子超家族成员。死亡受体5(death receptor5；DR5)属肿瘤坏死因子受体超家族成员(TN FRSF10B)，其胞质区含死亡结构域，主要分布于肿瘤细胞。TRAIL与细胞表面DR5结合，可诱导细胞凋亡。DR5在肝癌等多种实体瘤细胞中广泛表达，而在普通细胞中表达很微弱的细胞表面抗原。
免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其***具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)为当前过继性细胞回输治疗技术最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫***，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到清除恶性肿瘤细胞的目的而受到广泛的关注和研究。目前还未有靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备和研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种靶向DR5的单链抗体，以及包括所述靶向DR5的单链抗体的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向DR5的嵌合抗原受体可以专一性的靶向DR5，促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，更好的维持嵌合抗原受体T细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种靶向DR5的单链抗体，所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
可选的，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
可选的，所述靶向DR5的单链抗体编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。
本发明第一方面提供的所述靶向DR5的单链抗体能够与DR5蛋白发生特异性结合，对肿瘤细胞特别是表达DR5的实体瘤细胞具有较强的亲和活性。
第二方面，本发明提供了一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5，所述CAR-DR5包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。
其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
本发明中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向DR5的单链抗体与肿瘤上的DR5结合。可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:7具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:6。
本发明中，所述跨膜区用于固定所述靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5。可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选的，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:9具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:8。
本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。
可选的，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的CD27信号区和CD3ζ信号区。相应地，所述胞内信号区的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的CD27信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因。
可选的，所述CD27信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD27信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD27信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:10。
可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。
可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:13具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:12。
可选的，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。此时，如SEQ ID NO：12的氨基酸序列所示的CD3ζ信号区作为所述T细胞的抗原特异性信号(即，第一信号)，如SEQ ID NO：10的氨基酸序列所示的CD27信号区作为所述T细胞的共刺激信号，在它们的共同作用下，T细胞在识别抗原后被完全活化。特别地，选用如SEQ ID NO：10的CD27信号区作为共刺激信号，可以更好地提升后续T细胞的扩增能力、杀伤活力。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:4具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:3。
进一步地，所述CAR-CD22的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
本发明第二方面提供的所述靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5，该受体可供所述T细胞专一性地靶向表达DR5的肿瘤细胞，在CAR-DR5与DR5结合后，所述T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎不会造成损伤。
第三方面，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包括如第二方面所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的CAR-DR5的编码基因。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。如SEQID NO：5所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列相比，多了连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体CAR-CD22表达到细胞表面。
可选的，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
进一步可选的，所述病毒载体为慢病毒载体。
本发明第三方面提供的所述重组病毒载体可以用于靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备，有利于促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的重组病毒载体。
所述宿主细胞用于组装如第三方面所述的重组病毒载体，使其具有感染性。
可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。
进一步可选的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
第五方面，本发明提供了一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
(1)提供靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向DR5的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向DR5的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-DR5的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-DR5重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-DR5重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞；
(5)分离并获得靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞。
上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向DR5的单链抗体的编码基因的5’端相连，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区的编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。
在本发明中所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-DR5表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。
可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
可选的，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:15具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:14。
所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第二方面部分所述，这里不再赘述。
可选地，所述CAR-DR5的编码基因序列如SEQ ID NO：5所示。如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列相比，多了所述连接肽的编码基因，但在所述嵌合抗原受体CAR-DR5表达到细胞表面时，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的所述嵌合抗原受体CAR-DR5的氨基酸序列中并未带有如SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列。
所述CAR-DR5的编码基因***到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-DR5的编码基因***到pWPXLD载体时，所述CAR-DR5的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。
可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体***都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒***(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒***(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒***(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒***的慢病毒包装***在使用。
可选的，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。
可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。
进一步可选的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的靶向DR5的单链抗体、如第二方面所述的或如第五方面所述的制备方法制得的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体或如第四方面所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶向DR5的单链抗体、如第二方面所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体、如第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
本发明的有益效果：
本发明提供的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞可以专一性的靶向DR5，促进T细胞在患者体内的扩增，能够高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，同时DR5在肿瘤细胞中广泛表达，而在普通细胞中表达很微弱，因此靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞可以特异性的结合肿瘤细胞，对肿瘤细胞产生杀伤效果，对正常细胞不会造成损伤。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-DR5重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一
一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的基因序列
分别制备信号肽、靶向DR5的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD27信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：15所示，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：2所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：7所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：9所示，所述CD27信号区的编码基因如SEQ ID NO：11所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：13所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向DR5的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD27信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因，所述CAR-DR5的编码基因如SEQ ID NO：5所示。
(2)构建pWPXLd-CAR-DR5重组质粒
将CAR-DR5的编码基因***到pWPXLD载体的BamH1和EcoR1酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-DR5的编码基因***到pWPXLD载体时，所述CAR-DR5的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端还可加入有终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-DR5重组质粒，如图1所示为pWPXLd-CAR-DR5重组质粒。
(3)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-DR5重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。
(4)靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 一种靶向DR5的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Cys
145 150 155 160
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Arg Ile Asn Tyr Met Pro Ser Leu
180 185 190
Lys Glu Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 2
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacattgtga tgacacaatc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccggaagaa ctacttggct 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300
ccgttcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 360
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaagtg aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg 420
cagcctggag gatccctgaa actctcctgt gcagcctcag gattcgattt tagtacatgc 480
tggatgaatt gggtccggca ggctccaggg aaaggactag aatggattgg agaaattaat 540
ccagatagta gtaggataaa ttatatgcca tctctaaagg aaaaattcat catctccaga 600
gacaacgcca aaaatacact gtacctgcaa atgagcaaag tgagatctga agacacagcc 660
ctttattact gtgcaagggg aggaactttc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 720
tcagtcaccg tctcctca 738
<210> 3
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Cys
145 150 155 160
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Arg Ile Asn Tyr Met Pro Ser Leu
180 185 190
Lys Glu Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
245 250 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
260 265 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
275 280 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
290 295 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser
325 330 335
Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr
340 345 350
Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
355 360 365
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
370 375 380
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
385 390 395 400
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
405 410 415
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
420 425 430
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
435 440 445
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
450 455 460
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 4
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacattgtga tgacacaatc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccggaagaa ctacttggct 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300
ccgttcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 360
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaagtg aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg 420
cagcctggag gatccctgaa actctcctgt gcagcctcag gattcgattt tagtacatgc 480
tggatgaatt gggtccggca ggctccaggg aaaggactag aatggattgg agaaattaat 540
ccagatagta gtaggataaa ttatatgcca tctctaaagg aaaaattcat catctccaga 600
gacaacgcca aaaatacact gtacctgcaa atgagcaaag tgagatctga agacacagcc 660
ctttattact gtgcaagggg aggaactttc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 720
tcagtcaccg tctcctcaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 780
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 840
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 900
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaggaa atatagatca 960
aacaaaggag aaagtcctgt ggagcctgca gagccttgtc gttacagctg ccccagggag 1020
gaggagggca gcaccatccc catccaggag gattaccgaa aaccggagcc tgcctgctcc 1080
ccccgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag 1140
ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1200
ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac 1260
aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa 1320
cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac 1380
acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcgg 1419
<210> 5
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
gacattgtga tgacacaatc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120
atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccggaagaa ctacttggct 180
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 360
ccgttcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaagtg aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg 480
cagcctggag gatccctgaa actctcctgt gcagcctcag gattcgattt tagtacatgc 540
tggatgaatt gggtccggca ggctccaggg aaaggactag aatggattgg agaaattaat 600
ccagatagta gtaggataaa ttatatgcca tctctaaagg aaaaattcat catctccaga 660
gacaacgcca aaaatacact gtacctgcaa atgagcaaag tgagatctga agacacagcc 720
ctttattact gtgcaagggg aggaactttc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 780
tcagtcaccg tctcctcaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaggaa atatagatca 1020
aacaaaggag aaagtcctgt ggagcctgca gagccttgtc gttacagctg ccccagggag 1080
gaggagggca gcaccatccc catccaggag gattaccgaa aaccggagcc tgcctgctcc 1140
ccccgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag 1200
ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1260
ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac 1320
aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa 1380
cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac 1440
acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcgg 1479
<210> 6
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 7
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 10
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu
1 5 10 15
Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro
20 25 30
Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 11
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggaaatata gatcaaacaa aggagaaagt cctgtggagc ctgcagagcc ttgtcgttac 60
agctgcccca gggaggagga gggcagcacc atccccatcc aggaggatta ccgaaaaccg 120
gagcctgcct gctccccc 138
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 13
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

Claims (10)

1.一种靶向DR5的单链抗体，其特征在于，所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向DR5的单链抗体，其特征在于，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
3.一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5，所述CAR-DR5包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向DR5的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的CD27信号区和CD3ζ信号区。
5.如权利要求4所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
6.如权利要求3或4所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
7.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包括如权利要求3-6任一项所述的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的CAR-DR5的编码基因。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求5或6任一项所述的重组病毒载体。
9.一种靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向DR5的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向DR5的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向DR5的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-DR5的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-DR5重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-DR5重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞；
(5)分离并获得靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞。
10.一种如权利要求1-2任一项所述的靶向DR5的单链抗体、如权利要求3-6任一项所述的或如权利要求9所述的制备方法制得的靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞、或如权利要求7所述的重组病毒载体或如权利要求8所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
CN201711423229.6A 2017-12-25 2017-12-25 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 Withdrawn CN109957025A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711423229.6A CN109957025A (zh) 2017-12-25 2017-12-25 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711423229.6A CN109957025A (zh) 2017-12-25 2017-12-25 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109957025A true CN109957025A (zh) 2019-07-02

Family

ID=67021158

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711423229.6A Withdrawn CN109957025A (zh) 2017-12-25 2017-12-25 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109957025A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957024A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110144325A (zh) * 2018-02-12 2019-08-20 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN112812182A (zh) * 2019-11-15 2021-05-18 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向fgfr4的单链抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006083971A2 (en) * 2005-02-02 2006-08-10 Genentech, Inc. Dr5 antibodies and uses thereof
CN101717775A (zh) * 2009-11-13 2010-06-02 厦门大学 抗人死亡受体5的单链抗体基因
CN106397594A (zh) * 2016-10-25 2017-02-15 中国药科大学 一种全人源的抗人死亡受体5的激动剂单链抗体及应用
CN107074975A (zh) * 2014-08-28 2017-08-18 生物蛋白有限公司 用于修饰的t细胞的条件活性嵌合抗原受体

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006083971A2 (en) * 2005-02-02 2006-08-10 Genentech, Inc. Dr5 antibodies and uses thereof
CN101717775A (zh) * 2009-11-13 2010-06-02 厦门大学 抗人死亡受体5的单链抗体基因
CN107074975A (zh) * 2014-08-28 2017-08-18 生物蛋白有限公司 用于修饰的t细胞的条件活性嵌合抗原受体
CN106397594A (zh) * 2016-10-25 2017-02-15 中国药科大学 一种全人源的抗人死亡受体5的激动剂单链抗体及应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957024A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110144325A (zh) * 2018-02-12 2019-08-20 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN112812182A (zh) * 2019-11-15 2021-05-18 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向fgfr4的单链抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN112812182B (zh) * 2019-11-15 2023-01-06 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向fgfr4的单链抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110144326A (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
CN109836496A (zh) 一种靶向cd317的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109836497A (zh) 一种靶向egfr的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109836495A (zh) 一种靶向cd22的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109957018A (zh) 一种靶向cd22的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526970A (zh) 靶向cd133的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109836493A (zh) 一种靶向cd19的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110144328A (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
CN109957025A (zh) 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110157679A (zh) 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN109957020A (zh) 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109957546A (zh) 一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109957023A (zh) 一种靶向cd22的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526987A (zh) 靶向cd133的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526979A (zh) 靶向fap的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526976A (zh) 一种靶向psma的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110157675A (zh) 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN110157677A (zh) 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN109837303A (zh) 一种敲除pd1的靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110144327A (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
CN110527667A (zh) 一种靶向muc16的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526977A (zh) 一种靶向muc1的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526974A (zh) 一种靶向muc16的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110526988A (zh) 一种靶向muc1的嵌合抗原受体和嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109836500A (zh) 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20190702

WW01 Invention patent application withdrawn after publication