CN109836497A

CN109836497A - 一种靶向egfr的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109836497A
Application number: CN201711197151.0A
Authority: CN
Inventors: 曾滢; 杨忠华
Original assignee: Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Benta Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-25
Filing date: 2017-11-25
Publication date: 2019-06-04

Abstract

本发明提供了一种靶向EGFR的单链抗体，所述靶向EGFR的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向EGFR的单链抗体为人源化单链抗体，本发明还提供了一种包括所述靶向EGFR的单链抗体的嵌合抗原受体T细胞，所述靶向EGFR的嵌合抗原受体可以专一性的靶向EGFR，促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，同时人源化单链抗体制得的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞更好的维持细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了一种靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向EGFR的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向EGFR的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

人上皮生长因子受体(EGFR)是人上皮生长因子的主要受体。在激活后，EGFR会发生同源二聚，或与其他人上皮生长因子受体家族的成员发生异源二聚，从而诱导EGFR细胞内结构的自磷酸化，并激活下游通路例如丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路等，并介导细胞扩增。研究表明EGFR是一个在肺癌等多种实体瘤细胞中表达或异常表达，而在普通细胞中表达很微弱的细胞表面抗原。EGFR与肿瘤细胞的增殖、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。在癌症中，变异的EGFR得到持续性的激活，从而引起细胞无节制的扩增并最终导致癌症。因此，EGFR是一个癌症特异性靶点。

免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其***具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)为当前过继性细胞回输治疗技术最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫***，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到清除恶性肿瘤细胞的目的而受到广泛的关注和研究。目前还未有靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备和研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种靶向EGFR的单链抗体，以及包括所述靶向E GFR的单链抗体的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向EGFR的嵌合抗原受体可以专一性的靶向EGFR，促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，同时人源化单链抗体制得的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞能够更好的维持嵌合抗原受体T细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了一种靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。

第一方面，本发明提供了一种靶向EGFR的单链抗体，所述靶向EGFR的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向EGFR的单链抗体为人源化单链抗体。

可选的，所述靶向EGFR的单链抗体编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

可选的，所述靶向EGFR的单链抗体编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。

本发明第一方面提供的所述靶向EGFR的单链抗体能够与EGFR蛋白发生特异性结合，对肿瘤细胞特别是表达EGFR的实体瘤细胞具有较强的亲和活性。

第二方面，本发明提供了一种靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向E GFR的嵌合抗原受体CAR-EGFR，所述CAR-EGFR包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向EGFR的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向EGFR的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

其中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向EGFR的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。

在本发明中所述胞外铰链区用于促进所述靶向EGFR的单链抗体与肿瘤上的EGFR结合。

可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、C D5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。

进一步可选的，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。

可选的，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

可选的，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID N O:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:7具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:6。

在本发明中所述跨膜区用于固定所述靶向EGFR的嵌合抗原受体CAR-EGF R。

可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。

进一步可选的，所述跨膜区为CD8跨膜区。

可选的，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

可选的，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:9具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:8。

在本发明中所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。

可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、C D27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRS F19L信号区中的一种或多种的组合。

可选的，所述胞内信号区为4-1BB信号区和CD3ζ信号区。

可选的，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

可选的，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

可选的，所述4-1BB信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID N O:10所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:10。

可选的，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。

可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。

可选的，所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:13具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:12。

可选的，所述CAR-EGFR的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

可选的，所述CAR-EGFR的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

可选的，所述CAR-EGFR的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:4具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:3。

本发明第二方面提供的所述靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向EG FR的嵌合抗原受体CAR-EGFR，该受体可供所述T细胞专一性地靶向表达EGFR的肿瘤细胞，在CAR-EGFR与EGFR结合后，所述T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性的杀伤肿瘤细胞。EGFR在肿瘤细胞中广泛表达，而在普通细胞中表达很微弱，因此本发明提供的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞可以特异性的结合肿瘤细胞，对肿瘤细胞产生杀伤效果，对正常细胞不会造成损伤。

第三方面，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包括如第二方面所述的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的CAR-EGFR的编码基因。

可选的，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。

进一步可选的，所述病毒载体为慢病毒载体。

本发明第三方面提供的所述重组病毒载体可以用于靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备，有利于促进T细胞在患者体内的扩增，可以高效且特异性的杀伤肿瘤细胞。

第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的重组病毒载体。

所述宿主细胞用于组装如第三方面所述的重组病毒载体，使其具有感染性。

可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞或COS7细胞等，但不限于此。

进一步可选的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

第五方面，本发明提供了一种靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：

(1)提供靶向EGFR的嵌合抗原受体CAR-EGFR的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向EGFR的单链抗体的编码基因、C D8α铰链区的编码基因、CD8跨膜区的编码基因、4-1BB信号区的编码基因和C D3ζ信号区的编码基因，其中，所述靶向EGFR的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向EGFR的单链抗体的编码基因包括如SEQ IDNO：2所示；

(2)将所述CAR-EGFR的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPX LD-CAR-EGFR重组质粒；

(3)将所述pWPXLD-CAR-EGFR重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞；

(5)分离并获得靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞。

上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向EGFR的单链抗体的编码基因的5’端相连，所述靶向EGFR的单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区的编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。

在本发明中所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-EGFR表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。

可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

可选的，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。

可选的，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQID NO:15具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQID NO:14。

所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第二方面部分所述，这里不再赘述。

可选地，所述CAR-EGFR的编码基因序列如SEQ ID NO：5所示。

所述CAR-EGFR的编码基因***到pWPXLD载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CA R-EGFR的编码基因***到pWPXLD载体时，所述CAR-EGFR的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。

可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。

本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。

重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。

重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。

为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体***都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒***(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒***(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒***(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒***的慢病毒包装***在使用。

可选的，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。

可选的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。

进一步可选的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的靶向EGFR的单链抗体、如第二方面所述的或如第五方面所述的制备方法制得的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体或如第四方面所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶向EGFR的单链抗体、如第二方面所述的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组病毒载体、如第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。

本发明的有益效果：

(1)EGFR在肿瘤细胞中广泛表达，而在普通细胞中表达很微弱，与肿瘤细胞的增殖、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关，因此本发明提供的靶向E GFR的嵌合抗原受体T细胞可以特异性的结合肿瘤细胞，专一性的靶向表达E GFR的肿瘤细胞，促进T细胞在患者体内的扩增，对肿瘤细胞产生杀伤效果，对正常细胞不会造成损伤；

(2)靶向EGFR的单链抗体为人源化单链抗体，制得的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞更好的维持细胞的活力和杀伤力。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-EGFR重组质粒的质粒图谱。

图2为本发明实施例提供的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的阳性率；图2中(a)为阴性对照组，图2中(b)为本发明实施例提供的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的实验组。

图3为本发明实施例提供的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤细胞杀伤效果图。

图4为本发明实施例提供的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞***小鼠的效果图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

实施例一

一种靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备靶向EGFR的嵌合抗原受体CAR-EGFR的基因序列

分别制备信号肽、靶向EGFR的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因如SEQ ID NO：15所示，所述靶向EGFR的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：2所示，所述CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：7所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：9所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQ IDNO：11所示，所述C D3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：13所示。

通过PCR的方法将上述信号肽、靶向EGFR的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到靶向EGFR的嵌合抗原受体CAR-EGFR的编码基因，所述CAR-EGFR的编码基因如SEQ ID NO：5所示，其中所述靶向EGFR的单链抗体为人源化单链抗体。

(2)构建pWPXLd-CAR-EGFR重组质粒

将CAR-EGFR的编码基因***到pWPXLD载体的BamH1和EcoR1酶切位点之间，并在pWPXLD载体EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-EGFR的编码基因***到pWPXLD载体时，所述CAR-EGFR的编码基因的5’端添加起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamH1酶切位点相连，3’端还添加有终止密码子与(如TAA)pWPXLD载体中EcoR1酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-E GFR重组质粒，如图1所示为pWPXLd-CAR-EGFR重组质粒。

(3)重组慢病毒构建

将pWPXLd-CAR-EGFR重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×10⁸个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到重组慢病毒。

(4)靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备

a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离

PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。

b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞

取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选，放入磁铁进行分离；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。

c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞

取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。

培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×10⁶个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中。

效果实施例

为了评估本发明所描述的上述方法制备的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞效果，进行如下效果实施例。

效果实施例一：评估本发明所制备的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的阳性率

将经过本发明方法制备靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞(实验组)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)，使用流式细胞仪检测其阳性率，结果如图2所示，其中图2中(a)为阴性对照组，即未经制备的T细胞，图2中(b)为实验组，即为本发明制得的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞。由图2中(a)与(b)比较可得到，本发明所制备的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的阳性率为46.5％。

效果实施例二：评估靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况

将经过本发明方法制得的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞(实验组)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)的体外肿瘤杀伤效果进行比较，具体的：在体外将效应细胞(靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞或未经制备的T淋巴细胞)与靶细胞(HT1080细胞)数量比为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1比例，在37℃，5％CO₂下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，结果如图3所示。从图3中可看出，经过本发明所述的方法制备的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞肿瘤杀伤力均在20％以上，甚至可达75％，远远高于阴性对照组，因此经本发明方法制备的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞具有强的肿瘤杀伤能力。

效果实施例三：评估靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况

将经过本发明方法制备的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞(实验组)、未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)以及生理盐水(空白对照组)，在小鼠肿瘤模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×10⁶个HT1080细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线，结果如图4所示。从图4可以看出经过本方法制备的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞使得小鼠在培养65天时存活率还高于50％，远远超过阴性对照组和空白对照组。图4的结果表明经过本方法制备的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞能够更好的保护小鼠免于因肿瘤导致的死亡。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳宾德生物技术有限公司

<120> 一种靶向EGFR的单链抗体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser

130 135 140

Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser

145 150 155 160

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys

180 185 190

Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Val Glu Ile Lys

245

<210> 2

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 60

tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 120

ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 180

ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 240

ctgcaatggt cctcattgaa agcctcagat accgcgatgt actactgtgc tttcagagga 300

ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt ccggcggagg cgggtcagga 360

ggtggcggca gcggaggagg agggtccggc ggaggtgggt ccgacgtcgt gatgacccag 420

agccctgaca gcctggcagt gagcctgggc gaaagagcta ccattaactg caaatcgtcg 480

cagagcctgc tggactcgga cggaaaaacg tacctcaatt ggctgcagca aaagcctggc 540

cagccaccga agcgccttat ctcactggtg tcgaagctgg attcgggagt gcccgatcgc 600

ttctccggct cgggatcggg tactgacttc accctcacta tctcctcgct tcaagcagag 660

gacgtggccg tctactactg ctggcaggga acccactttc cgggaacctt cggcggaggg 720

acgaaagtgg agatcaag 738

<210> 3

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser

130 135 140

Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser

145 150 155 160

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys

180 185 190

Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

245 250 255

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

260 265 270

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

275 280 285

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

290 295 300

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

305 310 315 320

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

325 330 335

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

340 345 350

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

355 360 365

Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

370 375 380

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

385 390 395 400

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

405 410 415

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

420 425 430

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

435 440 445

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

450 455 460

Ala Leu Pro Pro Arg

465

<210> 4

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 60

tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 120

ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 180

ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 240

ctgcaatggt cctcattgaa agcctcagat accgcgatgt actactgtgc tttcagagga 300

ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt ccggcggagg cgggtcagga 360

ggtggcggca gcggaggagg agggtccggc ggaggtgggt ccgacgtcgt gatgacccag 420

agccctgaca gcctggcagt gagcctgggc gaaagagcta ccattaactg caaatcgtcg 480

cagagcctgc tggactcgga cggaaaaacg tacctcaatt ggctgcagca aaagcctggc 540

cagccaccga agcgccttat ctcactggtg tcgaagctgg attcgggagt gcccgatcgc 600

ttctccggct cgggatcggg tactgacttc accctcacta tctcctcgct tcaagcagag 660

gacgtggccg tctactactg ctggcaggga acccactttc cgggaacctt cggcggaggg 720

acgaaagtgg agatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 780

atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 840

gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 900

acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 960

aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1020

gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1080

ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1140

ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1200

gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1260

aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1320

aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1380

cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1407

<210> 5

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60

gagattcagc tcgtgcaatc gggagcggaa gtcaagaagc caggagagtc cttgcggatc 120

tcatgcaagg gtagcggctt taacatcgag gattactaca tccactgggt gaggcagatg 180

ccggggaagg gactcgaatg gatgggacgg atcgacccag aaaacgacga aactaagtac 240

ggtccgatct tccaaggcca tgtgactatt agcgccgata cttcaatcaa taccgtgtat 300

ctgcaatggt cctcattgaa agcctcagat accgcgatgt actactgtgc tttcagagga 360

ggggtctact ggggacaggg aactaccgtg actgtctcgt ccggcggagg cgggtcagga 420

ggtggcggca gcggaggagg agggtccggc ggaggtgggt ccgacgtcgt gatgacccag 480

agccctgaca gcctggcagt gagcctgggc gaaagagcta ccattaactg caaatcgtcg 540

cagagcctgc tggactcgga cggaaaaacg tacctcaatt ggctgcagca aaagcctggc 600

cagccaccga agcgccttat ctcactggtg tcgaagctgg attcgggagt gcccgatcgc 660

ttctccggct cgggatcggg tactgacttc accctcacta tctcctcgct tcaagcagag 720

gacgtggccg tctactactg ctggcaggga acccactttc cgggaacctt cggcggaggg 780

acgaaagtgg agatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 840

atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 900

gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960

acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020

aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080

gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140

ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200

ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260

gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320

aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380

aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440

cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1467

<210> 6

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

<210> 7

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60

tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120

gacttcgcct gcgatatc 138

<210> 8

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

1 5 10 15

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

20 25

<210> 9

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tacatttggg cccctctggc tggtacttgc ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact 60

ctttactgta agcgcggt 78

<210> 10

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

1 5 10 15

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

20 25 30

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35

<210> 11

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa 60

gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactg 117

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 13

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60

tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120

cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180

gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240

agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300

tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Ala Arg Pro

20

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60

Claims

1.一种靶向EGFR的单链抗体，其特征在于，所述靶向EGFR的单链抗体包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向EGFR的单链抗体为人源化单链抗体。

2.如权利要求1所述的靶向EGFR的单链抗体，其特征在于，所述靶向EGFR的单链抗体编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.一种靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括靶向EGFR的嵌合抗原受体CAR-EGFR，所述CAR-EGFR包括从氨基端到羧基端顺次连接靶向EGFR的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中所述靶向EGFR的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-EGFR的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

5.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包括如权利要求3或4任一项所述的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的CAR-EGFR的编码基因。

6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其特征在于，所述CAR-EGFR的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求5或6任一项所述的重组病毒载体。

8.一种靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：

(1)提供靶向EGFR的嵌合抗原受体CAR-EGFR的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向EGFR的单链抗体的编码基因、CD8α铰链区的编码基因、CD8跨膜区的编码基因、4-1BB信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因，其中，所述靶向EGFR的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向EGFR的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示；

(2)将所述CAR-EGFR的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-EGFR重组质粒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞；

(5)分离并获得靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞。

9.如权利要求8所述的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

10.一种如权利要求1-2任一项所述的靶向EGFR的单链抗体、如权利要求3-4任一项所述的或如权利要求8-9所述的制备方法制得的靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞、或如权利要求5-6任一项所述的重组病毒载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。