CN109781923B - 一种酱油中多种氨基酸和糖同时快速测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种酱油中多种氨基酸和糖同时快速测定的方法。本发明利用Dionex ICS5000+型多功能双***离子色谱仪，采用积分脉冲安培检测和多级梯度淋洗相结合的方法，通过对流速、柱温、流动相配比、溶液pH值、放置时间等实验影响因素进行分析研究，建立了酱油中26种氨基酸和糖同时测定的方法，确保了26种氨基酸和糖的有效分离，实现了酱油中26种氨基酸和糖一次性快速测定，可以用于评定酱油质量等级和营养价值、提高检测工作效率、提升生产监管水平，并且为建立酱油的“指纹特征”真伪辨别方法奠定基础，对整个调味品行业均具有重要的现实意义和实际应用价值。

Description

一种酱油中多种氨基酸和糖同时快速测定的方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种酱油中多种氨基酸和糖同时快速测定的方法。

背景技术

酱油是中国传统的调味品，已有三千多年的酿造历史，是人们日常饮食生活中的必需品。它是用大豆、小麦、麸皮等酿造而成，色泽红润、酱香独特、滋味鲜美，有助于促进食欲。

在酱油酿造发酵过程中，原料中蛋白质会水解产生丰富的氨基酸。氨基酸是人体所需的一种重要的生命物质，是组成蛋白质的基础物质，是生命延续过程必须摄取的成分。酱油的鲜味和营养价值取决于氨基酸态氮(氨基酸)含量的高低，氨基酸含量越高，酱油的等级越高，鲜味越足，品质越好。我国酱油国家标准规定，酱油等级依据氨基酸态氮含量分为特级(≥0.8g/100mL)、一级(≥0.7g/100mL)、二级(≥0.55g/100mL)、三级(≥0.4g/100mL)，低于0.4g/100mL含量的酱油为不合格产品。因此，很多酱油企业都在不断提高配制和研发技术，提高产品中氨基酸的含量。

在酱油生产酿造过程中，原料中淀粉经过曲霉淀粉酶水解会产生葡萄糖、麦芽糖等糖类。同时，为了掩盖酱油的咸味、苦味、涩味等味道，改进酱油的口感，一般会在酱油中添加白砂糖或三氯蔗糖等，所以酱油中糖类主要有葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、三氯蔗糖等。其中，三氯蔗糖又称蔗糖素，是一种人工合成的功能性甜味剂，过量食用可能会使人体产生不适反应，我国食品安全标准中规定酱油中三氯蔗糖最大使用限量是0.25g/kg，其他糖含量过高，也会对心脑血管病人、糖尿病人、老年人等身体产生不利影响。

目前，有媒体报道一些不法商贩利用砂糖、粗盐、味精、肌苷酸等配制假冒伪劣的“化学酱油”，这些酱油存在氨基酸含量不足、糖类超标、含有化学致癌物等严重问题。但是，目前仍无有效的方法，进行辨别酿造酱油和劣质配制酱油。因此，急需要进行酱油中多种类、多组分同时快速检测技术研发，为建立酱油真伪辨别方法奠定基础。

目前，氨基酸检测方法主要有液相色谱法、毛细管电泳法等，多数采用柱前或柱后衍生前处理方法，存在操作过程复杂、衍生副产物及干扰物多等不足；糖类检测方法主要有比色法、气相色谱法、液相色谱-示差检测法等，这些方法存在定量不够准确或前处理耗费太高等问题。当前氨基酸和糖类测定方法存在的共性技术问题是前处理步骤繁琐、一次性测定组分数量少、不能对氨基酸和糖类同时测定。而积分脉冲安培检测-离子色谱法，是一种将阴离子交换(AE)和积分脉冲安培法检测(IPAD)两种原理相结合的新型色谱分析方法，它利用在特定电极上、特定电压下发生氧化还原反应的分析物具有专一性，其他类化合物不能被检测到这一机理，可以一次性同时测定两大类组分氨基酸和糖类，不受其他类组分干扰，而且具有简便、快速、准确等技术优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酱油中多种氨基酸和糖同时快速测定的方法，实现酱油中多种氨基酸和糖同时快速分离测定，可用于评定酱油质量等级和营养价值、提高检测工作效率、提升生产监管水平，产生重要的经济效益和社会效益。

本发明利用ICS5000+型多功能双***离子色谱仪，采用积分脉冲安培检测(IPAD)和多级梯度淋洗(MGE)相结合的方法，通过对流速、柱温、流动相配比、溶液pH值、放置时间等实验影响因素进行深入分析研究，探索出了实现26种组分分离测定的最佳实验条件，建立了酱油中26种氨基酸和糖同时测定的方法。

本发明所述的一种酱油中多种氨基酸和糖同时快速测定的方法，包括以下步骤：

(1)离子色谱条件：

离子色谱仪：Dionex ICS 5000+型；色谱柱：Dionex AminoPac PA-10(2×250mm)，保护柱：Dionex AminoPac PA-10(2×50mm)；积分安培检测方式；工作电极：Gold(Au)-AAA；参比电极：pH电极；电位波形：Glod，pH-Ag-AgCl RE，AAA；流动相：多级梯度淋洗液，流动相A为225mmol/LNaOH溶液，流动相B为去离子水，流动相C为1.00mol/L NaAc溶液；流速：0.25mL/min；柱温：35℃；进样量：25μL；

(2)标准混合储备液和标准混合工作液的配置

分别依次称取氨基酸和糖的标准品配置成标准品溶液，使用时根据需要将标准品溶液配置成标准混合储备液和标准混合工作液；

(3)校准曲线绘制

将标准混合工作溶液按照色谱分析条件上机检测，以待测组分质量浓度为横坐标，以待测组分峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，外标法定量；

(4)待检样品前处理

准确取酱油待检样品0.100g，加入去离子水约150mL，摇匀静置15min，调节稀释液pH值至5.2～6.7，全部转移至200mL容量瓶中，采用去离子水定容至刻度，摇匀、静置15min，取10.0mL溶液，先过0.22μm水相滤膜，再过已经预活化的RP柱，弃去前面3mL，收集后面清液，等待检测；

RP柱的预活化过程为RP柱依次过5ml甲醇、10ml去离子水，静置20min。

(5)待检样品检测

将步骤(4)获得的清液进行上机检测，测定待检样品中氨基酸和糖的含量。

标准混合储备液和标准混合工作液的配置更为具体的过程为：依次称取26种氨基酸和糖的标准品0.1000g，分别定容至100mL容量瓶中，所配制的26种组分质量浓度均为1000μg/mL，使用时取一定量标准溶液用去离子水配成标准混合储备液。然后采用去离子水逐级稀释成一定浓度的标准混合工作液，4℃避光冷藏保存，现配现用。

本发明采用的仪器和试剂为：离子色谱仪(美国Thermo Fisher公司，ICS 5000+)，配备电化学检测器，配备自动进样器(AS-AP)；超纯水仪(美国Millipore公司，Milli-Q)；高速离心机(德国Hettich，Rotina380R)；电子天平(梅特勒公司，ML802/02)；实验用水：去离子水(电阻率18.2MΩ.cm)；20种氨基酸标准品(>98.0％，上海安谱科学仪器有限公司)，葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、D-乳糖、蔗糖、三氯蔗糖标准品(>99.0％，Dr.Ehrenstorfer)；氢氧化钠溶液(50％w/w，Fisher Chemical)；醋酸钠(>99.9％，Thermo Scientific)；盐酸(优级纯，四川西陇科学有限公司)。

本发明中，从提高分离度、缩短检测时间、保持色谱***稳定性角度考虑，选择0.25mL/min流速下进行实验。

一般淋洗梯度条件难以实现26种氨基酸和糖组分的有效分离，为提高检测灵敏度和分离度，发明人先后根据不同淋洗时间段、不同淋洗浓度、不同淋洗斜率进行了50多次实验对比研究，最终根据分离效果和基线稳定性确定了多级梯度淋洗条件。

另外，根据氨基酸和糖的特点，本发明选择下述的积分脉冲安培检测电位波形，进行实验测定。

温度是影响柱效、灵敏度、选择性和稳定性的重要因素。发明人经过多次试验，综合考虑分离度、灵敏度、保留时间、***稳定性、色谱柱使用寿命等各种实验影响因素，选择在35℃下进行26种氨基酸和糖同时分析测定。

为了验证溶液pH值对26种氨基酸和糖检测含量的影响，移取相同量的标准储备液，调节溶液酸碱性配成不同pH值(2.0-13.0)的同一理论浓度的标准溶液，进行上机检测。综合考虑26种组分结构、特性、等电点、解离常数等影响因素，发明人选择26种组分含量均稳定的pH值(5.2-6.7)条件下，即在弱酸性条件下，进行26种组分含量的分析测定。

在一次偶然的试验中，发明人发现一个放置在色谱小瓶中处理完毕的样品，第二天再重新测定时，其待测组分含量出现了大幅降低。因此，抽取一份酱油进行了前处理完毕后放置时间分别为0h、8h、16h、24h、30h、32h、36h的测定实验，发现从24h开始，由于所处理酱油待检样品受环境温度和内部组分之间相互作用等原因，酱油待检样品中待测组分含量开始逐步降低，因此，为确保组分定量准确，样品处理完毕后，应在16h内上机检测完毕。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、采用脉冲安培检测(IPAD)和多级梯度淋洗(MGE)相结合的方法，通过对各种实验影响因素进行深入分析研究，探索出了26种组分同时分离测定的最佳实验条件，建立了酱油中26种氨基酸和糖同时测定的方法，实现了酱油中多种氨基酸和糖组分同时分离测定的技术创新。

2、研究了pH值对组分测定的直接影响，结合氨基酸的等电点和解离常数等，分析了pH值对不同组分的影响程度，找出了适于26种组分测定最佳pH条件。

3、研究了色谱柱温度对26种组分测定的重要影响，发现温度对各种组分保留时间、灵敏度、分离度以及整个***压力均有显著的影响，经过分析对比，找出了适于26种氨基酸和糖同时测定的最佳柱温条件。

4、发现并研究了放置时间对26种组分测定的重要影响，为了确保26种待测组分测定结果稳定、准确，酱油处理完毕样品应在放置16h内上机测定。

5、一次性同时测定酱油中含有的26种氨基酸和糖，解决了以往采用多种传统方法(比色法、气相色谱法、液相色谱法等)分别进行多种氨基酸和糖类组分测定时耗费大量人力物力的问题，大幅提高了检测工作效率。

6、可为酱油的生产加工、质量控制、检验监管提供一种高效的技术方法，而且还可以对市场上各种质量等级的酱油进行多种氨基酸和糖含量筛查，建立酱油质量分析的大数据库，为将来建立酱油“指纹特征”辨别方法奠定基础。

7、所创检测方法的前处理方式简便快速、稳定准确、绿色环保，具有很高的经济价值和社会价值。因此，本发明对促进调味品行业检测技术进步和提高产品质量监管水平具有重要的现实意义。

附图说明

图1为标准混合工作溶液的离子色谱图，其中，1.精氨酸；2.海藻糖；3.赖氨酸；4.谷氨酰胺；5.天冬酰胺；6.葡萄糖；7.丙氨酸；8.苏氨酸；9.甘氨酸；10.缬氨酸；11.蔗糖；12.丝氨酸；13.脯氨酸；14.D-乳糖；15.异亮氨酸；16.亮氨酸；17.蛋氨酸；18.麦芽糖；19.组氨酸；20.苯丙氨酸；21.谷氨酸；22.天冬氨酸；23.半胱氨酸；24.三氯蔗糖；25.酪氨酸；26.色氨酸；

图2为柱温对组分测定的影响；

图3为溶液pH值对9种组分测定的影响；

图4为放置时间对组分测定的影响；

图5是酱油实际样品测定的离子色谱图。

具体实施方式

实施例1色谱条件的确定

(1)流速的选择

先后考察了0.20mL/min、0.25mL/min、0.275mL/min、0.30mL/min流速条件下的组分分离情况，0.20mL/min时，初始压力为1750psi，在50min左右时达到了最高压力2050psi，因流速较低，压力较小，峰宽增大，峰灵敏度下降，整体分离度不高。0.30mL/min流速时，虽然总出峰时间减少，但色谱***初始压力已高达2790psi，在35min左右时***压力超过了仪器压力上限3000psi，***自动报警停泵。0.25mL/min流速时和0.275mL/min流速时，总体来说组分分离效果均不错，但是0.25mL/min流速时初始压力为2150psi，最高压力2450psi，0.275mL/min流速时初始压力2570psi，最高压力2850psi，接近压力上限，压力过大易造成色谱柱塌陷，从而影响色谱柱使用寿命，也易造成色谱***漏液，影响整个检测***运行的稳定性。综上分析，从提高分离度、缩短检测时间、保持色谱***稳定性等角度考虑，选择0.25mL/min流速下进行实验。

(2)梯度淋洗条件的选择

一般淋洗梯度条件难以实现26种氨基酸和糖组分的有效分离，为提高检测灵敏度和色谱峰分离度，先后根据不同淋洗时间段、不同淋洗浓度、不同淋洗斜率进行了30多次实验对比研究，最终根据分离效果和基线稳定性确定了表1中多级梯度淋洗条件。从表1中可以看出，色谱分离梯度淋洗时间被分成5段(0-11.5min、11.5-17min、17-23.5min、23.5-40min、40-50min)，初始淋洗浓度是整个多级梯度淋洗条件的基础，因此在0-11.5min采用45mmol/L氢氧化钠淋洗液，恰好能够实现前13种弱保留组分有效分离。在11.5-17min时间段，选择了斜率为9.09mmol/(L.min)梯度淋洗液，氢氧化钠溶液浓度逐步增至90mmol/L，此时组分14至组分17恰能有效分离；在17-23.5min时间段，开始以6.15mmol/(L.min)的斜率使用强淋洗液醋酸钠溶液，为中等保留组分的有效分离和后面强保留组分的快速洗脱做准备。在23.5-40min时间段，选取氢氧化钠溶液、醋酸钠溶液、去离子水配比为(24:40:36)的淋洗液进行洗脱，能够确保组分18-25这8种待测物完全分离。在40-50min时间段，为加速洗脱强保留组分色氨酸，同时确保其灵敏度，选择了氢氧化钠溶液、醋酸钠溶液配比(50：50)浓度的洗脱液，图1是本发明所述26种氨基酸和糖的标准混合工作溶液色谱图。另外，根据氨基酸和糖的特点，选择表2中积分脉冲安培检测电位波形，进行实验测定。

表1离子色谱多级梯度淋洗条件

表2积分脉冲安培检测电位波形

(3)柱温的选择

温度是影响柱效、灵敏度、选择性和稳定性的重要因素。柱温的改变，直接影响分离效果和分析速率。柱温的升高，会在一定程度上提高色谱柱内离子交换速率，有利于提高柱效，缩短分析时间，但降低了分离选择性，不利于组分间的分离。从提高分析速率角度考虑，一般会选择较高的柱温，而从提高分离效果角度上考虑，应该选用较低的柱温。本文先后考察了26℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃六个温度对多组分分离效果的影响，详见图2。

从总体上来看，在同一实验测定条件下，在研究温度范围内，组分1-5和组分18-25，几乎不受温度的影响，保留时间和色谱峰的灵敏度没有明显的变化；中间时间段出峰的组分10-17受温度影响最为明显。

从分离度角度上来看，在六种温度条件下，28℃和35℃时26种组分峰全部检出，26℃时出峰组分最少，仅有23种组分检出。26℃时，组分6、7(葡萄糖和丙氨酸)重叠在一起，图中标为6号；组分12、13(丝氨酸和脯氨酸)重叠在一起，图中标为10号；组分14、15(D-乳糖和异亮氨酸)重叠在一起，图中标为12号；28℃时，虽然26种组分全部出峰，但是其实组分6和7几乎完全重叠；30℃和32℃时，蔗糖与组分12、13(丝氨酸和脯氨酸)重叠，所以只有25种组分出峰；38℃时，组分10、11(蔗糖和缬氨酸)叠加在一起，组分16、17(亮氨酸和蛋氨酸)完全重叠，这是因为，随着温度升高，组分16保留时间逐步增大，而组分17保留时间几乎保持不变，二者在38℃时发生重叠。

从保留时间和灵敏度来看，七种组分受温度的影响最为明显，依次是6(葡萄糖)、组分10(缬氨酸)、组分11(蔗糖)、组分14(D-乳糖)、组分15(异亮氨酸)、组分16(亮氨酸)、组分26(色氨酸)。其中组分11、15、16、26，随着温度的升高，保留时间逐步减小，4种组分受温度影响最大的组分是蔗糖，温度从26℃增至38℃，保留时间由12min逐步减小至10min左右，其单标测定证实，26℃图中是峰11，28℃图中是峰13，30℃和32℃图中分别与11、12重叠，35℃图中是峰11，38℃图中是峰10，显然温度的升高，导致其在混合组分中出峰时间和顺序均发生了明显改变，由此可见蔗糖受温度影响之大。组分14(D-乳糖)出峰时间从15.5min缩小至13.5min，组分26(色氨酸)出峰时间从50min缩小至44min，同时色氨酸灵敏度在不断增大。与多数组分受温度的影响规律不同，组分10(缬氨酸)、组分15(异亮氨酸)、组分16(亮氨酸)，随着温度的升高，保留时间却在逐步增大，出峰后移；其中缬氨酸属于支链氨基酸，是人体必需的8种氨基酸和生糖氨基酸，其受温度的影响规律，可能与其支链结构和自身性能有重要的关联。

从***压力来看，随着温度的升高，色谱柱内填料活性更高，***初始压力逐步降低，由26℃时的2460psi逐步降至38℃时的1918psi；当淋洗液是50％氢氧化钠溶液和50％醋酸钠溶液时，***压力最大，26℃和28℃时，最大压力分别为2908和2716psi，接近压力上限3000psi，而35℃和38℃时，***最大压力为2327和2228psi，此时压力适中。压力太大不利于***稳定性和色谱柱使用寿命，从提高***稳定性角度，选择较高温度更为合适。

因此，综合考虑分离度、灵敏度、保留时间、***稳定性、色谱柱寿命等各种实验影响因素，35℃是26种氨基酸和糖同时测定的最佳温度。

(4)pH值对测定的影响

为了验证溶液pH值对26种氨基酸和糖测定含量的影响，移取相同量的标准储备液，调节溶液酸碱性配成不同pH值(2.0-13.0)的同一理论浓度的标准溶液，进行上机检测。实验结果表明，苏氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、海藻糖、蔗糖等组分几乎不受pH值的影响，在酸性和碱性条件下，测定含量均比较稳定；而谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、葡萄糖、乳糖、麦芽糖这9种组分测定含量受溶液pH值的影响较大。从图3中可以看出，谷氨酸、丝氨酸是受pH值影响最大的两种组分，丝氨酸在pH值为2.0时测定含量波动最大，检测值为中性条件下(取pH＝6.7时测定含量)的140.53％；苯丙酰胺、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸4种组分测定含量在酸性和碱性条件下波动较大，当pH值小于4.0时，测定含量约是中性条件下测定含量的85.35％-128.01％，而当pH值大于10.0时，这4种组分测定含量波动范围在97.62％-126.91％。氨基酸之所以受pH值影响较大，是因为氨基酸是两性电解质，在酸性条件下，氨基(-NH₂)吸收H⁺带正电，在碱性条件下，羧基(-COOH)可以失去H⁺带负电，因此在强酸和强碱溶液中氨基酸离子含量随着其电离程度大小而变化。氨基酸所带的正负电荷数量相等时，即静电荷为零的两性离子状态，此时的pH值称为氨基酸的等电点。除了天冬氨酸等电点为2.85、谷氨酸为3.15、赖氨酸为9.60、精氨酸为10.76外，其他16种氨基酸的等电点在5.05-7.60之间，在等电点附近溶液中氨基酸离子的含量稳定。葡萄糖、乳糖、麦芽糖这三种糖在强酸性条件下，测定含量稍有所降低，但是在强碱性条件下，葡萄糖含量逐步增大，pH值为13.0时，测定含量为中性条件下的121.94％，而乳糖、麦芽糖含量逐步降低，pH值为13.0时，测定含量分别降至中性条件下的36.73％和23.42％，这主要是因为三种糖中均含有游离的醛基，是还原糖，而乳糖和麦芽糖属于二糖，在一定条件下可发生反应转化成一定量的葡萄糖，导致所测定单糖葡萄糖的含量有所增大。综合考虑26种组分结构、特性、等电点、解离常数等各种影响因素，我们选择26种组分测定含量均稳定，pH值在5.2-6.7条件下，即在弱酸性条件下，进行26种组分含量的分析测定。

(5)放置时间对组分测定的影响

在一次偶然的试验中，发明人发现一个放置在色谱小瓶中处理完毕的样品，第二天再重新测定时，其待测组分含量出现了大幅降低。因此，抽取一份酱油按照实验步骤(4)处理完毕后，在20℃恒定的室温条件下，在色谱瓶中放置时间分别为0h、8h、16h、24h、30h、32h、36h，即刻进行上机测定。图4是7个时间点测定的离子色谱叠加图，表3是主要检出组分的测定结果对比。

从图4和表3中可以看出，0h、8h、16h这3个时间点的色谱图几乎完全重叠，所测组分的保留时间和色谱峰面积，几乎一致，这充分说明在16h内该检测方法稳定性高。从24h开始，由于所处理酱油样品受环境温度和内部组分之间相互作用等原因，酱油中待测组分含量开始降低，24h时葡萄糖、脯氨酸含量分别降至0h时的91.28％、87.37％，其他组分也有一定程度地衰减；30h时，脯氨酸、组氨酸、谷氨酸含量降至0h时的52％以下；30h到36h是26种组分含量衰减最快的时间段，从表3中可以看出，36h时多数组分测定含量已降至0h时的20％以下。因此，为确保组分定量准确，样品处理完毕后，应在16h内上机检测完毕。

表3不同放置时间下的组分测定结果

n.a表示未检出，检测含量单位为(μg/g)

实施例2方法学验证

(1)线性范围与检出限

根据权利要求1中步骤(2)来配置26种氨基酸和糖的混合标准工作液，根据步骤(3)进行校准曲线拟合。通过色谱峰信噪比来计算待测组分的检出限(S/N＝3)，在0.05μg/mL～2.5μg/mL浓度范围内，进行了6个不同浓度水平(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.50μg/mL)标准工作液的检测和线性拟合。结果(见表4)表明，26种组分线性相关系数均大于0.997，其中有20种组分相关系数大于0.999，说明该实验条件下，26种组分同时检测时线性相关性良好。26种组分检出限在0.0023～0.1128μg/mL之间，除了谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸外，其他22种组分检出限均小于0.05μg/mL。其中6种糖的线性较好，相关系数全部大于0.999，检出限全部小于0.03μg/mL。

表4测定组分的线性范围、线性方程、相关系数及检出限(S/N＝3)

Y：峰面积(μS.min)，X：组分测定浓度(μg/mL)

(2)回收率与精密度

随机抽取3种酱油样品，依次向3个样品中添加浓度级别水平分别为0.20μg/mL、0.50μg/mL、2.00μg/mL的标准溶液，每个浓度水平进行6次平行测定实验，来验证不同酱油基质测定时方法的回收率和精密度，根据基质浓度、添加浓度和添加后测定浓度计算回收率。表5列出三浓度水平、六次平行检测的平均回收率和RSD数据。

表5测定组分的回收率及精密度(RSD)(n＝6)

从表5中可以看出，在0.20μg/mL添加浓度水平下，精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、三氯蔗糖回收率不高为84.16％～89.50％，但能够满足食品理化检验技术要求。20种氨基酸组分在三基质三浓度水平下的回收率在84.16％～108.53％之间，测定数据RSD在2.68％～7.85％范围内。这充分说明，三种基质、六次平行检测回收率数据结果符合食品理化检测要求，在多组分同时测定时，该测定方法准确性高、精密度好。

实施例3实际样品测定

从市场上随机抽取5种酱油产品(酱油1、酱油2、酱油3、酱油4、酱油5)，按照权利要求1中步骤(1)离子色谱条件和步骤(4)前处理步骤，进行实际样品中26种氨基酸和糖含量的检测分析，图5是酱油样品测定的离子色谱图。

从检出组分数量可以看出，酱油1和酱油2中26种氨基酸和糖全部检出，检出组分种类最多，其次是酱油4检出组分25种，仅有蔗糖未检出；酱油3检出组分24种，未检出蛋氨酸和色氨酸；酱油5仅检出组分18种，检出组分最少。从测定组分含量来看，测定含量较大的依次是精氨酸、葡萄糖、谷氨酸、丙氨酸，三种氨基酸是酱油中常见的主要氨基酸，也是酱油中的主要鲜味物质，葡萄糖是酱油中主要的甜味物质；测定含量较小的组分是蔗糖、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、三氯蔗糖。

通过分析5种酱油样品测定结果，氨基酸测定结果趋势与酱油等级完全符合，1-5号酱油中氨基酸总含量依次降低，5种酱油酱油质量等级依次是，1号特级，2号一级，3号二级，4号三级，5号三级。六种糖测定含量均未超出相关限量要求，同时发明人也发现等级越高的酱油，其含有的海藻糖和蔗糖越多，这是因为等级越高的酱油添加了营养价值较高的白砂糖(主要成分蔗糖)，并且其酿造发酵水平较高，含有较多的“生命之糖”海藻糖。海藻糖、赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蔗糖、丝氨酸、亮氨酸，均能符合质量等级越高组分含量越大的规律，也许经过进一步研究分析，这些组分含量和比例能成为辨别酱油质量高低和是否掺假的重要“指纹特征”。

从酱油样品的离子色谱图中可以看出，检测基线平稳，组分峰形尖锐，受其他物质干扰很小，这充分说明该检测方法稳定性好、准确性高、实用性强，完全满足酱油中26种氨基酸和糖快速定性定量分析。

Claims (1)

1.一种酱油中多种氨基酸和糖同时快速测定的方法，其特征在于，采用脉冲安培检测-离子色谱法对酱油进行检测，包括以下步骤：

(1)离子色谱条件：

离子色谱仪：Dionex ICS 5000+型；色谱柱：Dionex AminoPac PA-10，2×250mm，保护柱：Dionex AminoPac PA-10，2×50mm；积分安培检测方式；工作电极：Gold(Au)-AAA；参比电极：pH电极；电位波形：Gold，pH-Ag-AgCl RE，AAA；流动相：多级梯度淋洗液，流动相A为225mmol/LNaOH溶液，流动相B为去离子水，流动相C为1.00mol/LNaAc溶液；流速：0.25mL/min；柱温：35℃；进样量：25μL；

(2)标准混合储备液和标准混合工作液的配置

分别依次称取氨基酸和糖的标准品配置成标准品溶液，使用时根据需要将标准品溶液配置成标准混合储备液和标准混合工作液；

(3)校准曲线绘制

将标准混合工作溶液按照色谱分析条件上机检测，以待测组分质量浓度为横坐标，以待测组分峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，外标法定量；

(4)待检样品前处理

准确取酱油待检样品0.100g，加入去离子水约150mL，摇匀静置15min，调节稀释液pH值至5.2～6.7，全部转移至200mL容量瓶中，采用去离子水定容至刻度，摇匀、静置15min，取10.0mL溶液，先过0.22μm水相滤膜，再过已经预活化的RP柱，弃去前面3mL，收集后面清液，等待检测；

(5)待检样品检测

将步骤(4)获得的清液进行检测，测定待检样品中氨基酸和糖的含量；

采用多级梯度淋洗液的淋洗程序为：

所述积分安培检测方式积分脉冲安培检测电位波形为：

所述清液应在放置16h内上机测定；

所述的氨基酸为精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸；所述的糖为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、D-乳糖、麦芽糖、三氯蔗糖。

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