CN110512010B - 一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒及方法，属于分子生物学检测领域。本发明提供的试剂盒包括第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标；另外，本发明通过利用上述试剂盒可以通过大肠杆菌体内转录检测方法或大肠杆菌体外转录检测方法对大肠杆菌rRNA的转录速度以及转录产物的量进行精确的检测，其检测灵敏度可以达到0.5mg；相比于其他RNA转录速率检测方法来说，本发明实施例利用分子信标的检测方法造价低廉，操作简单，可以被广泛的应用。另外，本发明实施例提供的各个分子信标无毒无害，对环境无污染。

Description

一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体是一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒及方法。
背景技术
核糖体在微生物繁殖扩增过程中执行着非常关键的合成蛋白质的功能，核糖体的数量及其生成速度是微生物生长的关键因素。核糖体是由核糖体核糖核酸(RibosomalRibonucleic Acid，rRNA)以及核糖体蛋白所构成的，rRNA的合成速率对微生物体内核糖体的生成速度有很大的影响。所以，控制rRNA的合成速度可以有效地控制微生物的生长速度，其在微生物应用领域有着很广泛的应用前景。
目前，用于检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法有电镜成像法以及放射性同位素原位杂交法等，这些方法的缺点比较明显。比如，电镜成像法使用非常昂贵的电镜对正在转录中的rRNA进行成像，对成像得到的图片进行观察分析模板脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)链上核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)转录酶的位置以及转录产生的RNA产物的长短来对转录速度进行估测；这种方法设备昂贵，操作困难，检测成功率较低。而且检测数据由估测而得到，并不精确。另外，放射性同位素原位杂交法需要使用放射性同位素作为媒介进行试验。放射性同位素对人体以及环境都具有潜在的危害，而且试验后放射性废料处理昂贵，所以该种方法在试验中并不受欢迎。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒，其包括第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标；所述第一分子信标的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示，所述第二分子信标的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示，所述第三分子信标的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示。
本发明实施例还提供了一种采用上述试剂盒检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，所述的方法包括大肠杆菌体内转录检测方法和大肠杆菌体外转录检测方法。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的大肠杆菌体内转录检测方法包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌菌株接菌于LB培养基中进行培养，得到大肠杆菌菌液；
(2)将大肠杆菌菌液培养至对数生长期后，再往大肠杆菌菌液中添加利福平，继续进行培养；
(3)将上述培养的大肠杆菌菌液进行离心处理，得到沉淀的菌体；
(4)将菌体溶解于若干组LB培养基中进行培养，得到若干组新生菌液；
(5)每隔3-8min从其中一组新生菌液中离心分离出一组新生菌体，停止转录反应，并从新生菌体中提取出大肠杆菌的新生rRNA，得到若干组新生rRNA；
(6)依次将若干组新生rRNA分别与第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再进行荧光检测，得到若干组新生rRNA的荧光强度值；
(7)根据若干组新生rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(1)中，大肠杆菌菌株与LB培养基的体积比为1:(90-110)。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(2)中，利福平在大肠杆菌菌液中的质量浓度为30-50μg/mL。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(3)中，离心处理的温度为2-6℃。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的大肠杆菌体外转录检测方法包括以下步骤：
S1、将大肠杆菌rRNA模板与反应液进行混合，得到混合液；然后，将混合液平均分成若干组进行转录反应，得到若干组反应物；
S2、每隔3-8min往其中一组反应物中添加沉淀剂，并将其置于低温条件下进行沉淀处理，停止转录反应，得到若干组转录产物；
S3、分别将若干组转录产物进行离心处理，得到若干组rRNA沉淀颗粒；
S4、依次将若干组rRNA沉淀颗粒分别与第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再进行荧光检测，得到若干组rRNA的荧光强度值；
S5、根据若干组rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤S1中，反应液包括Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷)、KCl、MgCl2、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)、三磷酸鸟苷(Guanosine Triphosphate，GTP)、三磷酸胞苷(Cytidine Triphosphate，CTP)、尿苷三磷酸(Uridine Triphosphate，UTP)、核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)抑制剂和RNA聚合酶全酶；所述的步骤S2中，沉淀剂包括醋酸钠、乙醇和转运核糖核酸(Transfer Ribonucleic Acid，tRNA)。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤S1中，混合液中：大肠杆菌rRNA模板的质量浓度为1-2μg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为30-40μM，KCl的摩尔浓度为140-160μM，MgCl2的摩尔浓度为8-12μM，Triton X-100的质量百分比浓度为0.01％-0.03％，ATP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，GTP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，CTP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，UTP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，RNase抑制剂的酶活力为30-50U/μL，RNA聚合酶全酶的酶活力为1-3U/μL。
本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤S2中，沉淀处理的温度为-25℃～-15℃。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
(1)本发明实施例设计的分子信标基于荧光基团与淬灭基团结合时不发荧光而分开始发射荧光的原理在特殊设计的与核糖体16S RNA起始部分序列互补的寡聚核苷酸两端分别连接FAM荧光基团与Dabcyl淬灭基团构成。当寡聚核苷酸分子信标与新合成的核糖体16S RNA特异性互补结合后处于淬灭状态的FAM荧光集团与Dabcyl被分开，从而使FAM基团激发出荧光。根据激发的荧光强度可以分析得到有多少rRNA完成此序列部位的转录。另外再于核糖体23S RNA的起始与终止部分分别设计分子信标探针，这样三个分子信标可以在rRNA转录起始，中间延伸以及终止部分对转录产物进行标记，精确地检测rRNA的转录速度。
(2)本发明实施例提供的检测方法可以对大肠杆菌rRNA的转录速度以及转录产物的量进行精确的检测，其检测灵敏度可以达到0.5mg；相比于其他RNA转录速率检测方法来说，本发明实施例利用分子信标的检测方法造价低廉，操作简单，可以被广泛的应用。另外，本发明实施例提供的各个分子信标无毒无害，对环境无污染。
附图说明
图1为实施例1提供的第一分子信标的结构示意图。
图2为实施例1提供的第二分子信标的结构示意图。
图3为实施例1提供的第三分子信标的结构示意图。
图4为实施例2检测各个分子信标的溶解曲线图。
图5为激发各分子信标所需要互补寡聚核苷酸的浓度范围曲线。
图6为第一分子信标分别与大肠杆菌16S rRNA和柏格氏鼠疟原虫16S rRNA在40℃，45℃，50℃三种温度条件下进行杂交后产生的荧光强度曲线图。
图7为第一分子信标分别与梯度浓度的大肠杆菌16S rRNA和伯格氏鼠疟原虫16SrRNA的杂交荧光强度曲线图。
图8为第二分子信标分别与梯度浓度的大肠杆菌23S rRNA和嗜热脂肪地芽孢杆菌23S rRNA的杂交荧光强度曲线图。
图9为第三分子信标分别与梯度浓度的大肠杆菌23S rRNA和嗜热脂肪地芽孢杆菌23S rRNA的杂交荧光强度曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
该实施例提供了一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒，其包括第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标；其中，所述第一分子信标的核苷酸序列为：5’-6-FAM-CCGCGCTCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAATTTGCGCGG-Dabcyl-3’(其结构如附图1所述，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示)；所述第二分子信标的核苷酸序列为：5’-6-FAM-CCGCGCATCTCGGTTGATTTCTTTTCCTCGGGCGCGG-Dabcyl-3’(其结构如附图2所述，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示)；所述第三分子信标的核苷酸序列为：5’-6-FAM-CCGCGCGGTTAAGCCTCACGGTTCATTAGTAGCGCGG-Dabcyl-3’(其结构如附图3所述，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo:3所示)。
另外，第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标，实质上均为人工合成的一段长度为30-35bp的独特的单链核苷酸序列，其两侧各连接可以互补的6个间接重复的碱基，中间部分为一段与特定的大肠杆菌rRNA互补的核酸序列，从而形成一个茎环结构。在该茎环结构的5’端连接有一个荧光基团，在另一侧的3’端连接有一个淬灭基团。当茎环结构闭合的时候淬灭基团可以掩盖荧光基团。而当该分子信标与互补的序列相结合，茎环结构被破坏，淬灭基团离开荧光基团，使得荧光可以发散出来。因此，根据荧光检测设备所检测到的荧光强度可以分析得到有多少分子信标与目的序列相结合。
实施例2
该实施例是对上述实施例1提供的各分子信标(第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标)的溶解曲线进行检测，具体的，该实施例采用荧光热循环器来检测分子信标的溶解曲线，设定仪器的吸收值为488nm。跟踪检测分子信标从15℃升高至80℃温度过程中所发射出荧光的信号值。另外，该实施例还提供三组分别与第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标相对应的互补寡聚核苷酸——第一寡聚核苷酸、第二寡聚核苷酸和第三寡聚核苷酸，其中，第一寡聚核苷酸的核苷酸序列为：5’-AAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGA-3’(如序列表SEQ ID No:4所示)，第二寡聚核苷酸的核苷酸序列为：5’-CCGAGGAAAAGAAATCAACCGAGAT-3’(如序列表SEQ ID No:5所示)，第三寡聚核苷酸的核苷酸序列为：5’-TACTAATGAACCGTGAGGCTTAACC-3’(如序列表SEQ ID No:6所示)。将第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标分别与第一寡聚核苷酸、第二寡聚核苷酸和第三寡聚核苷酸进行互补杂交，然后用上方法进行溶解曲线检测，并以只有FAM荧光基团的寡聚核苷酸作为参照曲线，其检测结果如附图4所示(图中，曲线A为第一分子信标的溶解曲线，曲线B为第二分子信标的溶解曲线、曲线C为第三分子信标的溶解曲线、曲线D为第一分子信标+第一寡聚核苷酸的溶解曲线，曲线E为第二分子信标+第二寡聚核苷酸的溶解曲线，曲线F为第三分子信标+第三寡聚核苷酸的溶解曲线，曲线G为参照曲线)。
从图中可以看到，独立的分子信标在温度小于50℃时荧光激发量很小，随着温度提升，分子信标的二级结构受到高温的影响开始变性打开。荧光激发量随之提高。相反，分子信标与其互补的寡聚核苷酸同时存在时，由于分子信标与其互补的寡聚核苷酸目标片段可以互补杂交，荧光集团与淬灭基团分离。使得荧光激发量在温度比较低时就已经开始升高。在45℃时就可以达到最高值。在温度继续升高的过程中分子信标与寡聚核苷酸目标片段的结合也开始变得容易变形，荧光基团被淬灭基团重新包裹荧光激发逐渐回落，直到温度达到65℃以后，分子信标的二级结构受到高温影响，荧光被重新激发出来。
实施例3
该实施例是为了获得激发荧光分子信标所需要互补寡聚核苷酸的浓度范围曲线。具体的，首先分别将浓度为0.15μM的上述实施例1提供的分子信标在95℃下预变性1分钟后，与0-1μM呈梯度增加浓度的上述实施例2提供的互补寡聚核苷酸混合，并置于45℃下培育10分钟，之后使用FLUOstar Omega仪器在捕获值为1000，激发波长为485nm以及发射波长为520nm的条件下读取分子信标混合物的荧光发射数值，其检测结果如附图5所示(图中，曲线H为第一分子信标+第一寡聚核苷酸的浓度范围曲线，曲线I为第二分子信标+第二寡聚核苷酸的浓度范围曲线，曲线J为第三分子信标+第三寡聚核苷酸的浓度范围曲线)。
从图中可以看到，当互补寡聚核苷酸的浓度低于分子信标的浓度时，荧光信号与互补目标片段呈线性增长关系，当互补目标片段的浓度高于3倍分子信标的浓度后荧光信号的增长进入平台期。
实施例4
该实施例是将上述实施例1提供的第一分子信标分别与大肠杆菌16S rRNA和柏格氏鼠疟原虫16S rRNA在三种测试温度条件(40℃，45℃，50℃)下进行杂交实验，其实验结果如附图6所示(图中，K为第一分子信标与大肠杆菌16S rRNA的杂交结果，L为第一分子信标与柏格氏鼠疟原虫16S rRNA的杂交结果)。
从图中可以看到，在三种测试温度条件下分子信标与大肠杆菌16S rRNA可以很好地杂交，并释放出大量荧光信号。而分子信标与柏格氏鼠疟原虫16S rRNA杂交后并没有明显信号释放出来，所以证实第一分子信标可以特异性杂交大肠杆菌16S rRNA。
实施例5
该实施例是将上述实施例1提供的第一分子信标分别与浓度梯度递增的两种rRNA(大肠杆菌16S rRNA和柏格氏鼠疟原虫16S rRNA)进行杂交测试，具体的，第一分子信标的浓度为0.15μM，其测试结果如附图7所述(图中，M为第一分子信标与大肠杆菌16S rRNA的曲线图，N为第一分子信标与柏格氏鼠疟原虫16S rRNA的曲线图)
从图中可以看出，随着大肠杆菌16S rRNA浓度的增加，荧光信号也随之增强。相反，随着柏格氏鼠疟原虫16S rRNA浓度的增加，荧光信号并没有明显的变化。另外，经分析可以得出：大肠杆菌16S rRNA最低检出浓度为0.5-1pM，相当于0.25-0.5μg的全长16SrRNA。
实施例6
该实施例是将上述实施例1提供的第二分子信标分别与浓度梯度递增的两种rRNA(大肠杆菌23S rRNA和嗜热脂肪地芽孢杆菌23S rRNA)进行杂交测试，具体的，第二分子信标的浓度为0.15μM，其测试结果如附图8所述(图中，O为第二分子信标与大肠杆菌23S rRNA的曲线图，P为第二分子信标与嗜热脂肪地芽孢杆菌23S rRNA的曲线图)
从图中可以看出，随着大肠杆菌23S rRNA浓度的增加，荧光信号都随之增强。相反，随着嗜热脂肪地芽孢杆菌23S rRNA浓度的增加，荧光信号都没有明显的变化。另外，经分析可以得出：大肠杆菌23S rRNA最低检出浓度为0.5-1pM，相当于0.25-0.5μg的全长16SrRNA。
实施例7
该实施例是将上述实施例1提供的第三分子信标分别与浓度梯度递增的两种rRNA(大肠杆菌23S rRNA和嗜热脂肪地芽孢杆菌23S rRNA)进行杂交测试，具体的，第二分子信标的浓度为0.15μM，其测试结果如附图9所述(图中，Q为第三分子信标与大肠杆菌23S rRNA的曲线图，R为第三分子信标与嗜热脂肪地芽孢杆菌23S rRNA的曲线图)
从图中可以看出，随着大肠杆菌23S rRNA浓度的增加，荧光信号都随之增强。相反，随着嗜热脂肪地芽孢杆菌23S rRNA浓度的增加，荧光信号都没有明显的变化。另外，经分析可以得出：大肠杆菌23S rRNA最低检出浓度为0.5-1pM，相当于0.25-0.5μg的全长16SrRNA。
实施例8
该实施例还提供了一种采用上述试剂盒检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，所述的方法为大肠杆菌体内转录检测方法，其包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌菌株接菌于无菌LB培养基(市售产品)中进行培养，得到大肠杆菌菌液；其中，大肠杆菌菌株与LB培养基的体积比为1:90，另外，大肠杆菌菌株为37℃过夜培养的大肠杆菌SQ171菌株(获得自耶鲁大学遗传菌种中心Genbank检索编号为CP011324)。该菌株敲除了大肠杆菌全部7个核糖体操纵子基因、并将连接有rrnB操作子基因的pKK3535载体转化进入该菌株，使该菌株只含有rrnB这唯一的核糖体操纵子以便于本实验的顺利进行)。
(2)将大肠杆菌菌液培养至对数生长期OD值为0.7时，往大肠杆菌菌液中添加利福平，继续置于37℃条件下进行培养30min；其中，利福平在大肠杆菌菌液中的质量浓度为30μg/mL。
(3)在2℃的温度条件下，将上述培养的大肠杆菌菌液以4000rpm的转速进行离心处理，去除上层清液，得到沉淀的菌体；
(4)将菌体溶解于若干组新鲜的无菌LB培养基中，并置于37℃条件下进行培养，得到若干组新生菌液；
(5)每隔3min从其中一组新生菌液中离心分离出一组新生菌体，停止转录反应，并从新生菌体中提取出大肠杆菌的新生rRNA，得到若干组新生rRNA；
(6)依次将若干组新生rRNA分别与浓度均为0.15μM的第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再置于荧光检测设备(市售产品)进行荧光检测，得到若干组新生rRNA的荧光强度值；
(7)根据若干组新生rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。
实施例9
该实施例还提供了一种采用上述试剂盒检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，所述的方法为大肠杆菌体内转录检测方法，其包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌菌株接菌于无菌LB培养基(市售产品)中进行培养，得到大肠杆菌菌液；其中，大肠杆菌菌株与LB培养基的体积比为1:110，另外，大肠杆菌菌株为37℃过夜培养的大肠杆菌SQ171菌株。
(2)将大肠杆菌菌液培养至对数生长期OD值为0.7时，往大肠杆菌菌液中添加利福平，继续置于37℃条件下进行培养30min；其中，利福平在大肠杆菌菌液中的质量浓度为50μg/mL。
(3)在6℃的温度条件下，将上述培养的大肠杆菌菌液以4000rpm的转速进行离心处理，去除上层清液，得到沉淀的菌体；
(4)将菌体溶解于若干组新鲜的无菌LB培养基中，并置于37℃条件下进行培养，得到若干组新生菌液；
(5)每隔8min从其中一组新生菌液中离心分离出一组新生菌体，停止转录反应，并从新生菌体中提取出大肠杆菌的新生rRNA，得到若干组新生rRNA；
(6)依次将若干组新生rRNA分别与浓度均为0.15μM的第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再置于荧光检测设备(市售产品)进行荧光检测，得到若干组新生rRNA的荧光强度值；
(7)根据若干组新生rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。
实施例10
该实施例还提供了一种采用上述试剂盒检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，所述的方法为大肠杆菌体内转录检测方法，其包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌菌株接菌于无菌LB培养基(市售产品)中进行培养，得到大肠杆菌菌液；其中，大肠杆菌菌株与LB培养基的体积比为1:100，另外，大肠杆菌菌株为37℃过夜培养的大肠杆菌SQ171菌株。
(2)将大肠杆菌菌液培养至对数生长期OD值为0.7时，往大肠杆菌菌液中添加利福平，继续置于37℃条件下进行培养30min；其中，利福平在大肠杆菌菌液中的质量浓度为40μg/mL。
(3)在4℃的温度条件下，将上述培养的大肠杆菌菌液以4000rpm的转速进行离心处理，去除上层清液，得到沉淀的菌体；
(4)将菌体溶解于若干组新鲜的无菌LB培养基中，并置于37℃条件下进行培养，得到若干组新生菌液；
(5)每隔5min从其中一组新生菌液中离心分离出一组新生菌体，停止转录反应，并从新生菌体中提取出大肠杆菌的新生rRNA，得到若干组新生rRNA；
(6)依次将若干组新生rRNA分别与浓度均为0.15μM的第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再置于荧光检测设备(市售产品)进行荧光检测，得到若干组新生rRNA的荧光强度值；
(7)根据若干组新生rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。
实施例11
该实施例还提供了一种采用上述试剂盒检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，所述的方法为大肠杆菌体外转录检测方法，其包括以下步骤：
S1、将大肠杆菌rRNA模板与反应液进行混合，得到混合液；然后，将混合液平均分成若干组，并置于37℃下进行转录反应，得到若干组反应物；其中，反应液包括Tris-HCl(pH＝7.5)、KCl、MgCl2、Triton X-100、ATP、GTP、CTP、UTP、RNase抑制剂和RNA聚合酶全酶，另外，混合液中：大肠杆菌rRNA模板的质量浓度为1μg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为30μM，KCl的摩尔浓度为140μM，MgCl2的摩尔浓度为8μM，Triton X-100的质量百分比浓度为0.01％，ATP的质量浓度为0.4μg/mL，GTP的质量浓度为0.4μg/mL，CTP的质量浓度为0.4μg/mL，UTP的质量浓度为0.4μg/mL，RNase抑制剂的酶活力为30U/μL，RNA聚合酶全酶的酶活力为1U/μL。
S2、每隔3min往其中一组反应物中添加沉淀剂，并将其置于-25℃的低温条件下进行沉淀处理至少1小时，停止转录反应，得到若干组转录产物；其中，沉淀剂包括醋酸钠、乙醇和tRNA，醋酸钠为3M醋酸钠溶液，其添加的体积为反应物体积的1/10，乙醇为无水乙醇，其添加的体积为反应物体积的3倍，tRNA的添加量为1μL。
S3、分别将若干组转录产物在4℃的温度下，以15000rpm的转速进行离心处理，并以此对沉淀进行水洗风干后，得到若干组rRNA沉淀颗粒；
S4、依次将若干组rRNA沉淀颗粒溶解于20μL无菌水中，并分别与浓度均为0.15μM的第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再进行荧光检测，得到若干组rRNA的荧光强度值；
S5、根据若干组rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。
实施例12
该实施例还提供了一种采用上述试剂盒检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，所述的方法为大肠杆菌体外转录检测方法，其包括以下步骤：
S1、将大肠杆菌rRNA模板与反应液进行混合，得到混合液；然后，将混合液平均分成若干组，并置于37℃下进行转录反应，得到若干组反应物；其中，反应液包括Tris-HCl(pH＝7.5)、KCl、MgCl2、Triton X-100、ATP、GTP、CTP、UTP、RNase抑制剂和RNA聚合酶全酶，另外，混合液中：大肠杆菌rRNA模板的质量浓度为2μg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为40μM，KCl的摩尔浓度为160μM，MgCl2的摩尔浓度为12μM，Triton X-100的质量百分比浓度为0.03％，ATP的质量浓度为0.6μg/mL，GTP的质量浓度为0.6μg/mL，CTP的质量浓度为0.6μg/mL，UTP的质量浓度为0.6μg/mL，RNase抑制剂的酶活力为50U/μL，RNA聚合酶全酶的酶活力为3U/μL。
S2、每隔8min往其中一组反应物中添加沉淀剂，并将其置于-15℃的低温条件下进行沉淀处理至少1小时，停止转录反应，得到若干组转录产物；其中，沉淀剂包括醋酸钠、乙醇和tRNA，醋酸钠为3M醋酸钠溶液，其添加的体积为反应物体积的1/10，乙醇为无水乙醇，其添加的体积为反应物体积的3倍，tRNA的添加量为1μL。
S3、分别将若干组转录产物在4℃的温度下，以15000rpm的转速进行离心处理，并以此对沉淀进行水洗风干后，得到若干组rRNA沉淀颗粒；
S4、依次将若干组rRNA沉淀颗粒溶解于20μL无菌水中，并分别与浓度均为0.15μM的第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再进行荧光检测，得到若干组rRNA的荧光强度值；
S5、根据若干组rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。
实施例13
该实施例还提供了一种采用上述试剂盒检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，所述的方法为大肠杆菌体外转录检测方法，其包括以下步骤：
S1、将大肠杆菌rRNA模板与反应液进行混合，得到混合液；然后，将混合液平均分成若干组，并置于37℃下进行转录反应，得到若干组反应物；其中，反应液包括Tris-HCl(pH＝7.5)、KCl、MgCl2、Triton X-100、ATP、GTP、CTP、UTP、RNase抑制剂和RNA聚合酶全酶，另外，混合液中：大肠杆菌rRNA模板的质量浓度为1.5μg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为35μM，KCl的摩尔浓度为150μM，MgCl2的摩尔浓度为10μM，Triton X-100的质量百分比浓度为0.02％，ATP的质量浓度为0.5μg/mL，GTP的质量浓度为0.5μg/mL，CTP的质量浓度为0.5μg/mL，UTP的质量浓度为0.5μg/mL，RNase抑制剂的酶活力为40U/μL，RNA聚合酶全酶的酶活力为2U/μL。
S2、每隔5min往其中一组反应物中添加沉淀剂，并将其置于-20℃的低温条件下进行沉淀处理至少1小时，停止转录反应，得到若干组转录产物；其中，沉淀剂包括醋酸钠、乙醇和tRNA，醋酸钠为3M醋酸钠溶液，其添加的体积为反应物体积的1/10，乙醇为无水乙醇，其添加的体积为反应物体积的3倍，tRNA的添加量为1μL。
S3、分别将若干组转录产物在4℃的温度下，以15000rpm的转速进行离心处理，并以此对沉淀进行水洗风干后，得到若干组rRNA沉淀颗粒；
S4、依次将若干组rRNA沉淀颗粒溶解于20μL无菌水中，并分别与浓度均为0.15μM的第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再进行荧光检测，得到若干组rRNA的荧光强度值；
S5、根据若干组rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。
需要说明的是，上述涉及的试剂和检测仪器均为市售产品，其具体成分和型号在这边就不作赘述了。
综上所述，本发明实施例提供的检测方法可以对大肠杆菌rRNA的转录速度以及转录产物的量进行精确的检测，其检测灵敏度可以达到0.5mg；相比于其他RNA转录速率检测方法来说，本发明实施例利用分子信标的检测方法造价低廉，操作简单，可以被广泛的应用。另外，本发明实施例提供的各个分子信标无毒无害，对环境无污染。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
                         序列表
<110>  吉林农业大学
<120>  一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的试剂盒及方法
<160>  6
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  40
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
ccgcgctctg agccatgatc aaactcttca atttgcgcgg                        40
<210>  2
<211>  37
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
ccgcgcatct cggttgattt cttttcctcg ggcgcgg                           37
<210>  3
<211>  37
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
ccgcgcggtt aagcctcacg gttcattagt agcgcgg                           37
<210>  4
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  4
aaattgaaga gtttgatcat ggctcaga                                     28
<210>  5
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  5
ccgaggaaaa gaaatcaacc gagat                                        25
<210>  6
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  6
tactaatgaa ccgtgaggct taacc                                        25

Claims (7)

1.一种采用试剂盒检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的方法包括大肠杆菌体内转录检测方法或大肠杆菌体外转录检测方法；
所述的试剂盒包括第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标；所述第一分子信标的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示，所述第二分子信标的核苷酸序列如序列表SEQID No:2所示，所述第三分子信标的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示；
所述的大肠杆菌体内转录检测方法包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌菌株接菌于LB培养基中进行培养，得到大肠杆菌菌液；
(2)将大肠杆菌菌液培养至对数生长期后，再往大肠杆菌菌液中添加利福平，继续进行培养；
(3)将上述培养的大肠杆菌菌液进行离心处理，得到沉淀的菌体；
(4)将菌体溶解于若干组LB培养基中进行培养，得到若干组新生菌液；
(5)每隔3-8min从其中一组新生菌液中离心分离出一组新生菌体，停止转录反应，并从新生菌体中提取出大肠杆菌的新生rRNA，得到若干组新生rRNA；
(6)依次将若干组新生rRNA分别与第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再进行荧光检测，得到若干组新生rRNA的荧光强度值；
(7)根据若干组新生rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小；
所述的大肠杆菌体外转录检测方法包括以下步骤：
S1、将大肠杆菌rRNA模板与反应液进行混合，得到混合液；然后，将混合液平均分成若干组进行转录反应，得到若干组反应物；
S2、每隔3-8min往其中一组反应物中添加沉淀剂，并将其置于低温条件下进行沉淀处理，停止转录反应，得到若干组转录产物；
S3、分别将若干组转录产物进行离心处理，得到若干组rRNA沉淀颗粒；
S4、依次将若干组rRNA沉淀颗粒分别与第一分子信标、第二分子信标和第三分子信标进行混合后，再进行荧光检测，得到若干组rRNA的荧光强度值；
S5、根据若干组rRNA的荧光强度值，判断大肠杆菌rRNA转录速率的大小。
2.根据权利要求1所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，大肠杆菌菌株与LB培养基的体积比为1:(90-110)。
3.根据权利要求1所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，利福平在大肠杆菌菌液中的质量浓度为30-50μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，离心处理的温度为2-6℃。
5.根据权利要求1所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤S1中，反应液包括Tris-HCl、KCl、MgCl2、Triton X-100、ATP、GTP、CTP、UTP、RNase抑制剂和RNA聚合酶全酶；所述的步骤S2中，沉淀剂包括醋酸钠、乙醇和tRNA。
6.根据权利要求5所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤S1中，混合液中：大肠杆菌rRNA模板的质量浓度为1-2μg/mL，Tris-HCl的摩尔浓度为30-40μM，KCl的摩尔浓度为140-160μM，MgCl2的摩尔浓度为8-12μM，Triton X-100的质量百分比浓度为0.01％-0.03％，ATP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，GTP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，CTP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，UTP的质量浓度为0.4-0.6μg/mL，RNase抑制剂的酶活力为30-50U/μL，RNA聚合酶全酶的酶活力为1-3U/μL。
7.根据权利要求5所述的一种检测大肠杆菌rRNA转录速率的方法，其特征在于，所述的步骤S2中，沉淀处理的温度为-25℃～-15℃。
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