CN110551797B - 基于t5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法，属于生物检测技术领域，所述方法包括：基因组DNA的提取、RPA反应、连接反应、外切反应、RCA反应及氧化还原反应。本发明基于T5外切酶和T4DNA连接酶建立了一种新的目视检测F.proliferatum的方法，通过将RPA产物一条链的两端连接成环从而将RPA和RCA偶联起来，目标序列经两轮扩增，检测限达到0.05pg，具有高灵敏度，本发明的方法具有无需标记，操作简单，不需要复杂的仪器，适用性高的优点。

Description

基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法。

背景技术

层出镰刀菌属于李瑟组镰刀菌，会导致茎和穗腐烂，造成农作物的减产和品质下降。在层出镰刀菌侵染过程中会产生真菌毒素，对人和牲畜的健康造成威胁。已建立基于PCR的层出镰刀菌检测用于保障作物品质产量和食品安全。然而，该方法需要PCR仪，操作熟练的技术人员，以及纯净的基因组作为模板，该检测方法的进行离不开实验室。因此，仍旧迫切需要建立简单灵敏的检测方法用于鉴定农作物及其加工产物中的层出镰刀菌存在。

由于生物传感器具有快速，高灵敏度和选择性，及低成本等优点，逐渐成为引人注目的技术，已经应用于多种生物组分的鉴定。在不同类型的生物传感器中，为了提高灵敏度，信号放大步骤是必须的。对于基因组DNA的检测，dsDNA通常是经过PCR或等温扩增如环介导的等温扩增(LAMP)或RPA获得。LAMP 需要四条或更多的引物，反应温度高于60℃，且获得的产物为大小不等的双链片段，它不能进行后续的克隆或测序，这些都限制了LAMP的应用。

滚环复制(RCA)是最常用的信号扩增方法之一，广泛应用于miRNA、单核苷酸突变、病原和癌细胞及其标志物检测等。然而，该扩增方法的缺点之一是当反应体系里有多于两个探针时会有高背景，这就降低了结果的可靠性。为了降低信噪比，许多RCA相关的策略中，无关DNA探针的3′-端被封闭。然而，封闭反应不是100％完全，未被封闭的DNA探针将会产生背景值。T5外切酶能够从5′→3′方向降解所有的单链或双链及带缺口的DNA。由于环状DNA不会被降解，而线状DNA能快速完全地降解为单核苷酸，该酶的这一特征可用来在 RCA相关的检测方法中降低背景值。

重组酶聚合酶扩增***包括三种蛋白，分别是重组酶，单链结合蛋白以及聚合酶。重组酶与引物结合，扫描DNA模板。当发现同源序列时，引物和模板上的目标序列杂交，形成D环结构，单链结合蛋白结合其互补链。在聚合酶作用下，引物开始延伸。新生成的链成为新一轮扩增的模板。重组酶和单链结合蛋白的存在使RPA避开了PCR中的变性步骤。在RPA***中仅需要两条引物，比 PCR引物略长。目前，使用Twist公司的试剂盒，用PCR引物通常也能进行有效扩增。该扩增一般在30分钟内完成，产物纯化后能够进行克隆和测序。与PCR 和LAMP对模板的高纯度要求相比，RPA***能够用未纯化的模板进行有效扩增，这对于现场检测来说是一个优势。

G-四链体是一条富含G的DNA或RNA序列，由链内4条平行的或反平行的片段杂交构成，相邻4条链中各有3个相邻的鸟苷，通过氢键构成三个平行平面，G-四链体脱氧核酶具有类似过氧化氢酶活性。由于它简单、经济、易于改造和获得等优点，已经广泛应用到一系列无标记生物传感器中。为了提高灵敏度，该检测方法已经与一些信号放大步骤比如链置换扩增或滚环复制等偶联。以带有 G-quadruplex的反式互补序列的环为模板，RCA产生大分子量的带有 G-quadruplex的重复单位的单链DNA，多于8个G-quadruplex可构建为多重 G-quadruplex，它比单独8个G-四链体脱氧核酶具有更高的过氧化氢酶活性。

发明内容

针对以上检测方法中存在的技术问题，本发明提供一种没有背景值，灵敏度高、特异性强的基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法。

本发明的技术方案为：一种基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法，包括以下步骤：

(1)基因组DNA的提取：取玉米粉作为待测样本，以5倍体积的缓冲液悬浮，得到悬浮液，采用煮沸冷却法将悬浮液内的基因组DNA从细胞壁中释放出来，得到粗提液；

(2)RPA反应：取1μL粗提液作为RPA反应的模板以及2.5μL Mg(Ac₎₂加入到RPA反应体系中，通过引物primer-F和primer-R进行RPA反应，获得 RPA产物；

(3)连接反应：将50ng RPA产物和一定量的probe 1混匀进行杂交反应，得到杂交产物；加入5U T4 DNA连接酶催化所述杂交产物发生连接反应，从而获得连接产物；

(4)外切反应：在50μL 1×NEB buffer 4中加入10μL所述连接产物和 10U T5外切酶，室温下经行外切反应，得到外切产物，并以PCR纯化试剂盒纯化，得到纯化后的外切产物；

(5)RCA反应：在20μL 1×phi29DNA聚合酶缓冲液中加入1μL纯化后的外切产物，1μL probe 3和10U phi29 DNA聚合酶，在30℃下经行RCA 反应5-25min，得到RCA产物；

(6)氧化还原反应：在缓冲液中加入终浓度为0.6μM的Hemin，以及含有 RCA产物的终溶液，室温孵育，再加入终浓度均为2mM的ABTS^2-和H₂O₂继续孵育，直接观察终溶液颜色是否变化，显色为绿色的样品为阳性，不显色则样品为阴性。

进一步地，步骤(1)中所述煮沸冷却法的具体操作为：将所述悬浮液液沸水浴加热10min，冰上冷却并涡旋1min。

进一步地，步骤(2)中所述RPA反应体系包括：25μL 2×reaction buffer, 2μLdNTP(2.5mM each),5μL 10×basic E-mix,2.4μL primer-F(10μM), 2.4μL primer-R(10μM),2.5μl 20×core reaction mix,7.2μL H₂O。

进一步地，步骤(2)中所述RPA反应体系的反应条件为：在加热块中进行 RPA反应，42℃下反应20min，然后升高温度至85℃保持3min，灭活反应体系的酶和蛋白。

进一步地，步骤(2)中所述primer-F的基因序列如SEQ ID NO.1所示5′ -CCCAACCCGCCCTACCCCGGCCACCAGAGGATGTG-3′；所述primer-R的基因序列如SEQ ID NO.2所示5′-CAACACGAATCGCTTCCTGAC-3′。

进一步地，步骤(3)中所述probe 1的加入量为1μL。

进一步地，步骤(3)中所述杂交反应升温至95℃保持3min，然后自然冷却至室温，可节省连接时间，使二者快速的杂交。

进一步地，步骤(3)中所述probe 1的基因序列如SEQ ID NO.3所示5′ -GGGCGGGTTGGGTCAACACGAATCGC-3′。

进一步地，步骤(4)中所述外切反应时间为5min。

进一步地，步骤(5)中所述RCA反应时间为15min。

进一步地，步骤(5)所述probe 3的基因序列如SEQ ID NO.5所示5′ -TCCCAGACCCATCAGCCAGAGA-3′。

本发明的工作原理为：首先，通过煮沸冷却法F120的基因组从细胞壁中释放出来。第二，直接以粗提液中的F120的基因组为模板通过引物primer-F和 primer-R进行RPA反应，获得dsDNA。在合成引物时，G-quadruplex的反式互补序列加到primer-F的5′-端，从而生成的RPA产物末端即带有该序列。RPA产物一条链的5′-端和3′-端与probe 1杂交，在T4DNA连接酶催化下二者之间生成新的磷酸二酯，从而获得一个环状DNA。

溶液中所有线状DNA被T5外切酶以5′→3′方向降解为单核苷酸，只有环状DNA保持完整，它随后被用作模板在phi29 DNA polymerase和probe 3作用下进行RCA反应。在hemin作用下，RCA产物中的G-quadruplex序列组装成具有类似过氧化氢酶活性的脱氧核酶。当加入ABTS^2-和H₂O₂后，终溶液呈绿色。然而，如果没有F120，RPA反应扩增不到目标序列，所有的线状DNA将被T5 外切酶完全降解。没有环状ssDNA作为RCA的模板，终溶液中不会观察到特征绿色。

与现有技术相比本发明有益效果为：

(1)本发明基于T5外切酶和T4 DNA连接酶建立了一种新的目视检测F.proliferatum的方法，通过将RPA产物一条链的两端连接成环从而将RPA和RCA 偶联起来，目标序列经两轮扩增，检测限达到0.05pg，具有高灵敏度；

(2)本发明的RPA和RCA都是恒温反应，显示本发明的方法可应用于实验室外，且本发明的方法无需标记，非常简单，普通人员即可操作，也不需要复杂的仪器。

(3)本发明的方法可通过肉眼观察终溶液的颜色不同而得到阳性或阴性实验结果。

(4)本发明室温条件下5分钟内即可利用T5外切酶把链状DNA全部降解，这大大缩短了反应时间并提高了本实验的适用性。

(5)本发明的方法也适用于任何其它DNA检测，比如病毒、细菌、植物、动物等，只要替换成对目标序列特异的引物即可。

附图说明

图1A是RPA和RCA产物以2.5％琼脂糖凝胶电泳分析的结果图。其中，Line 1是以污染层出镰刀菌玉米粉基因组为模板进行RPA扩增；Line 2是空白对照，以未被F120污染的玉米粉DNA为模板进行RPA反应；Line 3,RPA product+ probe 1+T4 DNA连接酶+T5外切酶.Line 4,RPA product+probe 1+T4 DNA 连接酶+T5外切酶+phi29 DNA polymerase+probe3。

图1B是RPA和RCA产物在390-490nm处的比色检测结果图。其中，(a) 空白,(b)不存在层出镰刀菌，(c)存在层出镰刀菌；在紫外可见检测中带有相应编号的样品图片在该图右上角。

图2A是T5外切酶的反应温度和反应时间优化的凝胶电泳图；其中，1泳道为0.1μgRPA产物，2、3泳道分别为1μg dsDNA在37度或室温下被T5外切酶降解30分钟；泳道4-7分别是1μg dsDNA在室温下被T5外切酶分别降解5、 10、15、20分钟。

图2B是RPA体系中的聚合酶特性研究的凝胶电泳图；其中1泳道为 0.1μgRPA产物，2泳道RPA product+probe 1+T4 DNA连接酶+T5外切酶；3泳道RPA product+probe 2+T4DNA连接酶+T5外切酶；4泳道RPA product+probe 1+T4 DNA连接酶+T5外切酶+phi29 DNApolymerase+probe 3；5泳道RPA product+probe 2+T4 DNA连接酶+T5外切酶+phi29 DNApolymerase+probe 3。

图3A是对probe 1添加体积的优化实验对比图；F120基因组的用量为5pg。误差线是3次重复的标准偏差，下同。

图3B是对连接反应时间的优化实验对比图。

图3C是对RCA反应时间的优化实验对比图。

图4A是终溶液在390-490nm处具有不同数量F120基因组吸光度曲线；其中，图A中的箭头代表F120的量由低到高，DNA的量分别是0pg(a)，0.1pg (b)，0.5pg(c)，1pg(d)，5pg(e)，10pg(f)，0.1ng(g)，5ng(h)。***的图片是加入对应不同量F120基因组所获得的终溶液颜色。

图4B是吸光度和终溶液中F120基因组数量的负对数间的线性关系图。

图5是本发明方法的选择性检测结果图；其中，1为空白对照组；2为F. equisetiRD13(F216)组；3为F.culmorum 3.37dus Bomm(F109)组；4为 avenaceum borm(F112)；5为F.proliferatum DSM62267(F120)组；6为健康玉米粉的基因组与F120基因组的混合物。

图6是本发明方法的原理图。

具体实施方式

实施例1

(一)试剂和仪器

1.1试剂

ABTS和Hemin购于Sigma-Aldrich Co.,Ltd.(德国)；

GeneRuler 100bp Plus,T4 DNA连接酶,phi29 DNA聚合酶和dNTP购于 ThermoFisher Scientific Ltd.(德国)；

TwistDx/

Liquid Basic购于TwistDx^TM Limited(Cambridge,英国)；

T5外切酶购于New England Biolabs Ltd.(德国)；

Roti-Safe和电导率高于18MΩ的HPLC级水购于Carl Roth GmbH+Co. KG(德国)；

DNA提取试剂盒和PCR纯化试剂盒购于QIAGEN Company(德国)；

其它试剂均为分析纯。

1.2仪器

NanoDrop 2000(Thermo,USA)用于本实验的吸光度测量，在波长390nm到 490nm范围内检测终溶液的吸收光谱；

在加热块(HLC Biotech MHR11,Germany)中进行RPA反应；

电泳仪和水平电泳槽用于电泳检测实验过程中的目标序列；

Doc plus imaging system of Herolab GmbH(Germany)用于拍摄琼脂糖电泳的照片；

由手机摄像头拍摄装有终溶液的试管的照片。

(二)实验方法

2.1DNA的提取

以未被污染的玉米粉和被F120污染的玉米粉，以及生长于培养基上的F216,F109,和F112菌分别以5倍体积的缓冲液(10mM Tris-Cl,1mM EDTA(pH 8.0)) 悬浮，得到悬浮液；其中F.proliferatum DSM62267(F120),F.equiseti RD13(F216), F.culmorum3.37dus Bomm(F109),F.avenaceum borman(F112)菌株和F120污染的玉米粉均由Professor Petr Karlovsky赠予。无污染玉米粉购买于当地超市。

将1-5号悬浮液分别用沸水浴加热10min，冰上冷却并涡旋1min，基因组 DNA从细胞壁内释放出来，得到粗提液，取1μL粗体液的上清液作为RPA反应的模板，同时，以DNA提取试剂盒提取并纯化F120基因组，用于本实验的灵敏度和选择性检测。

2.2RPA反应

在50μL体系里进行RPA反应，包括25μL 2×reaction buffer,2μL dNTP(2.5mMeach),5μL 10×basic E-mix,2.4μL primer-F(10μM),2.4 μL primer-R(10μM),2.5μl 20×core reaction mix,7.2μL H2O.进行下步前吸打混匀。加入1μLF120的基因组的粗体液作为RPA反应的模板和2.5μL Mg(Ac)₂加入到对应试管盖上，并盖上盖，颠倒混匀，反应在同一时间开始。该反应在加热块上进行，在42℃下反应20min。然后升高温度至85℃保持3min，灭活反应体系的酶和蛋白，获得获得RPA产物(dsDNA)，

其中，所述primer-F的基因序列如SEQ ID NO.1所示5′ -CCCAACCCGCCCTACCCCGGCCACCAGAGGATGTG-3′；所述primer-R的基因序列如SEQ ID NO.2所示5′-CAACACGAATCGCTTCCTGAC-3′。

2.3连接反应

为了节省连接时间，将50ng RPA产物和1μL probe 1混匀，升温至95℃保持3min，然后自然冷却至室温，用于二者的快速杂交。向该混合物加入10μ L 1×T4 DNA连接酶缓冲液(40mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,0.5mM ATP,10 mM DTT,pH 7.8，37℃)，再加入5U T4 DNA连接酶开始反应，室温条件反应30分钟，在合成引物时，G-四链体的反式互补序列加到primer-F的5′-端，从而生成的RPA产物末端即带有该序列。RPA产物一条链的5′-端和3′-端与 probe 1杂交，在T4 DNA连接酶催化下二者之间生成新的磷酸二酯，从而获得一个环状DNA，即为连接产物。

2.4外切反应

向50μL 1×NEB buffer 4(50mM Potassium Acetate,20mM Tris-acetate,10 mMMagnesium Acetate,1mM DTT,pH 7.9)中加入10μL所述连接产物和10U T5外切酶，室温反应5min，反应体系的链状DNA均被T5外切酶按5′→3′方向降解为单核苷酸，得到外切产物，并以PCR纯化试剂盒纯化，得到纯化后的外切产物。

2.5RCA反应

在20μL 1×phi29 DNA聚合酶缓冲液(33mM Tris-acetate,10mM Mg-acetate,66mM K-acetate,0.1％(v/v)Tween 20,1mM DTT,pH 7.9a，37℃) 中加入1μL纯化后的外切产物，1μL probe 3和10U phi29 DNA聚合酶，在30℃下经行RCA反应5-25min，得到RCA产物。

2.6氧化还原反应

在缓冲液中(50mM Tris-HCl,150mM NH4Cl,pH 7.9)中加入Hemin(终浓度0.6μM)以及含有RCA产物的终溶液，室温孵育1小时。再加入终浓度均为2 mM的ABTS^2-和H₂O₂继续孵育30分钟，观察到终溶液呈特征性绿色，然后拍照。以NanoDrop 2000扫描其UV-Vis光谱。

本实施例的工作原理如图6所示，首先，通过煮沸冷却法F120的基因组从细胞壁中释放出来。其次，直接以粗提液中的F120的基因组为模板通过引物 primer-F和primer-R进行RPA反应，获得dsDNA。在合成引物时，G-quadruplex 的反式互补序列加到primer-F的5′-端，从而生成的RPA产物末端即带有该序列。 RPA产物一条链的5′-端和3′-端与probe 1杂交，在T4 DNA连接酶催化下二者之间生成新的磷酸二酯，从而获得一个环状DNA。

溶液中所有线状DNA被T5外切酶以5′→3′方向降解为单核苷酸，只有环状DNA保持完整，它随后被用作模板在phi29 DNA polymerase和probe 3作用下进行RCA反应。在hemin作用下，RCA产物中的G-quadruplex序列组装成具有类似过氧化氢酶活性的脱氧核酶。当加入ABTS^2-和H₂O₂后，终溶液呈绿色。然而，如果没有F120，RPA反应扩增不到目标序列，所有的线状DNA将被T5 外切酶完全降解。没有环状ssDNA作为RCA的模板，终溶液中不会观察到特征绿色。

实施例2

以2.5％的琼脂糖电泳检测基于RPA和RCA的双轮扩增的可行性。见图1A，粗提液中F120基因组不经纯化直接用作RPA反应的模板。泳道1，以primer 1 和primer 2进行RPA扩增，获得dsDNA产物。泳道2，空白对照，以未被F120 污染的玉米粉DNA为模板进行RPA反应。泳道3，RPA产物一条链的5′-端和 3′-端与probe 1杂交，在T4 DNA连接酶催化下，二者之间连接起来，获得一个环状DNA。它不能被T5外切酶降解，但溶液中其它链状DNA均被其完全降解。泳道4，在probe 3和phi29 DNA polymerase存在下进行RCA反应，观察到一条具有非常大分子量的条带，这与RCA扩增的高效性是一致的。上述结果显示基于RPA和RCA的双轮扩增测量是可行的。

实施例3

为了明确T5外切酶辅助的目视检测方法的可行性，终溶液特征绿色以紫外 -可见吸收(390–490nm)进行分析。见图1B，当溶液中仅存在hemin,ABTS^2-和 H₂O₂时，它在420nm附近没有光吸收(a)。当存在目标DNA时，在420nm附近观察到一个明显的吸收峰(c)。然而，当不存在目标DNA时，在420nm附近没有吸收峰(b)。类似于光吸收结果，在试管c中观察到了绿色，而试管a和试管 b中的溶液几乎是无色的。结果显示，T5外切酶辅助的目视检测F.proliferatum 的方法是可行的，结果能够在两小时内通过肉眼观察到。

实施例4

T5外切酶的反应时间和温度的优化实验：

根据T5外切酶说明书，在37℃下反应30min，T5外切酶能够从5′→3′方向完全降解链状dsDNA和ssDNA。本实施例为了提高反应适应性缩短反应时间，以dsDNA(1μg)为目标序列，对T5外切酶的反应温度和时间进行优化，反应后通过2.5％琼脂糖电泳检测。反应温度选择在37℃和室温，2支试管各加入1μg DNA，加入T5外切酶(10U)反应30min。见图2A，在第2和第3列没有条带，显示在37℃和室温条件下dsDNA完全被降解。类似的，4支试管各加入1μgdsDNA，加入T5外切酶(10U)室温条件下分别孵育5、10、15、20 分钟。结果显示第4-7列都无条带，说明T5外切酶能够在室温5分钟内完全降解1μg dsDNA。通常生物传感器中所用的核酸不高于纳克级，在这个实验中微克级的dsDNA在室温下能够快速完全地被降解，说明在常规生物传感***中，同样条件下它能彻底降解体系内的链状DNA。因此，T5外切酶在室温下反应5 分钟为最优条件。

实施例5

RPA体系中聚合酶性质：

T4 DNA连接酶催化DNA末端相邻5'-磷酸基和3'-羟基的磷酸二酯键的生成。连接反应对于模板DNA和待连接DNA片段末端碱基的配对是高度严格的，若是它们不能正确配对，则不能生成磷酸二酯键。

一些DNA聚合酶具有3′→5′外切酶活性，其PCR产物是平头的，比如 phusion DNA聚合酶。另有一些DNA聚合酶不具有3′→5′外切酶活性，其PCR 产物的3′-末端都多一个A，叫3′-dA悬垂，这一特征在分子生物学操作中常用于TA克隆。在RPA体系中聚合酶的特性没有出现在TwistDx/

Liquid Basic说明书上，不知道该酶是不是具有3′→5′外切酶活性。

为了顺利完成连接反应，设计了两条相似探针probe 1和probe 2用来区别 RPA产物是不是3′-dA悬垂，其中probe 1比probe 2多一个T，可用来和该悬垂 A配对。如果RPA产物存在3′-dA悬垂，RPA产物末端可与probe 1完全配对。

RPA产物的一条链的末端与probe 1或probe 2配对，然后被T4 DNA连接酶连接。加入T5外切酶降解溶液中所有链状DNA，从而得到单纯的环状ssDNA。结果见图2B，泳道1是RPA产物。泳道2和3中各有一个条带说明在probe 1 和probe 2存在下，都生成了环状单链DNA。这两个条带亮度相近，说明大概一半的RPA产物带有3′-dA，另一半产物是平末端。该结果进一步被RCA证实，在泳道4和5中都观察到有大分子量的DNA，显示环状ssDNA作为模板，在probe 3和phi29 DNA聚合酶存在下都进行了RCA反应。这些结果揭示在RPA 反应体系中至少存在两种聚合酶，一种没有3′→5′外切酶活性，获得的RPA 产物带有3′-dA悬垂。在T4连接酶存在下，probe 1与RPA产物一条链的5′- 和3′-末端杂交，T4 DNA连接酶连接该末端生成环DNA。RPA是带有和不带有 3′-dA悬垂的dsDNA的混合物，在后续分子生物学操作中，既可用于TA克隆也可用于平末端克隆。另一种聚合酶具有3′→5′外切酶活性，获得的RPA产物是平末端的。

其中，本实施例中的probe 1的基因序列如SEQ ID NO.3所示5′ -GGGCGGGTTGGGTCAACACGAATCGC-3′；probe 2的基因序列如SEQ ID NO.4所示5′-GGGCGGGTTGGGCAACACGAATCGC-3′；probe 3的基因序列如SEQ ID NO.5所示5′-TCCCAGACCCATCAGCCAGAGA-3′。

实施例6

对probe 1的优化实验：

Probe 1与RPA产物一条链的两端杂交，在一定量RPA产物的情况下，Probe 1的量越大与RPA杂交的量越大。见图3A，终溶液的吸光度随probe 1(1μM) 的体积从0.1μL到10μL而显著升高，在1μL probe 1时吸光度最大，加入更大量的probe1反而降低了吸光度值，原因可能是过量的probe 1分别与RPA 产物的两端分别杂交，从而降低了probe 1与RPA产物的两端同时杂交的概率，导致随后的连接率降低，从而吸光度降低。因此，1μL probe 1是最优体积，用于后续实验。

实施例7

连接反应时间的优化实验：

连接反应所用时间关系到环ssDNA的产量，进而影响终溶液的吸光度。见图3B，吸光度随反应时间的延长而升高，30min后吸光度几乎保持不变，所以 30min为最佳连接反应时间。

实施例7

RCA反应时间的优化实验：

RCA的反应时间决定G-四链体DNAzyme的产量，反应时间延长会有更多的G-四链体序列产生。见图3C，吸光度随RCA的反应时间从5min到25min 而升高，而15分钟后吸光度几乎持平。所以，15min的RCA反应时间为最优时间，并用于后续反应。

实施例8

为了研究该目视策略的分析性能，在最优条件下，通过终溶液的紫外可见吸收检测F120基因组的量。见图4A，随着F120基因组的量从0到5ng不断增加，吸光度逐渐升高。更大量的F120基因组为模板，RPA会产生更多的dsDNA。在 T4 DNA连接酶和T5外切酶作用下，RPA产物会有更多的环ssDNA生成。同样时间内经RCA反应会产生更多的G-四链体序列。进而获得更多的Hemin/G- 四链体DNAzymes，导致紫外可见光吸收的增加。

在F120基因组量为0.1pg-0.1ng时，吸光度和F120基因组数量的负对数间存在线性关系，见图4B，回归方程为A＝0.1661lgm+2.318，相关系数是0.9918。 A和m分别表示终溶液的吸光度和F120基因组的质量。根据空白响应和3倍标准差之和，计算获得检测限量为0.05pg，显示该策略能够高灵敏检测F120。

该策略的检测限比基于RPA或RCA的荧光、电化学和比色检测要低。并且该方法提供了简单且高灵敏检测层出镰刀菌污染的方法，肉眼即能通过颜色的不同区分阳性和阴性结果。

实施例9

对基于T5外切酶的目视策略的重现性进行了检测实验：

批内重现性以一天内以5pg F 120基因组DNA为模板，每两小时检测1次， 3次检测标准差为3.2％。批间重现性是以每次5pg F120基因组DNA为模板，分3天进行检测，3次检测标准差为2.9％，显示该策略具有良好的重现性。通过平行测定5组同样量的F120DNA检测本实验的稳定性，5次检测标准差为2.8％，显示其具有良好的稳定性。

实施例10

选择性实验

基于DNA的生物传感器的选择性很重要，因为体系中同时存在寄主的大量核酸以及来自其他生物的核酸。本体系中的Primer 1和primer 2对F.proliferatum 种群具有特异性。三种真菌包括F.equiseti RD13(F216),F.culmorum 3.37dus Bomm(F109),andF.avenaceum borm(F112)都属于镰刀菌，但不属于F. proliferatum。通过检测这三种真菌明确本方法的特异性。见图5，F.equiseti RD13 (2),F.culmorum 3.37dus Bomm(3),F.avenaceum borm(4)终溶液的吸光度和空白对照相近，而来自于F120的吸光度很大。另外，由健康玉米粉的基因组与F120 基因组的混合物产生的吸光度和F120的吸光度相近，说明该方法具有令人满意的选择性。

实施例11

基于T5外切酶的实际样品检测实验：

基于PCR的核酸检测方法是最基本可靠的检测方法，但是由于具有多个变温步骤，该方法离不开实验室。为了明确本发明方法进行实际样品检测的可行性，分别以本发明方法和PCR方法检测了4个阳性样品和26个大田采集样品。结果显示26个样品中有11个是带有F.proliferatum的，这两种检测方法的检测结果完全一致，说明我们的方法是可信的，可以应用于大田检测。

序列表

<110>临沂大学

<120>基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法

<130>无

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)-(24)

<223>根据实验要求而设计，作为RPA反应反应外引物primer-F

<400>1

CCCAACCCGCCCTACCCCGGCCACCAGAGGATGTG 35

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)-(19)

<223>根据实验要求而设计，作为RPA反应反应外引物primer-R

<400>2

CAACACGAATCGCTTCCTGAC 21

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)-(44)

<223>根据实验要求而设计，作为RT-LAMP反应内引物FIP-1

<400>3

CCCAACAGGGAGCAAAAGTTTTAGATTTCCCATCTGGGGTTAGT44

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)-(56)

<223>根据实验要求而设计，作为RT-LAMP反应内引物BIP-1

<400>4

TTAGCGTTTAGTTGTTTACTTGAGTCGTTTTTGGAGATCCAGATTTGTCCATGAAT56

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)-(22)

<223>根据实验要求而设计，环引物LB

<400>5

ATGGACTTGCTACTTCACACCT 22

Claims (6)

1.一种基于T5外切酶的双轮信号扩增目视检测层出镰刀菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)基因组DNA的提取：取玉米粉作为待测样本，以5倍体积的缓冲液悬浮，得到悬浮液，采用煮沸冷却法将悬浮液内的基因组DNA从细胞壁中释放出来，得到粗提液；

(2)RPA反应：取1μL粗提液作为RPA反应的模板以及2.5μL Mg(Ac₎₂加入到RPA反应体系中，通过引物primer-F和primer-R进行RPA反应，获得RPA产物；

(3)连接反应：将50ng RPA产物和一定量的probe 1混匀进行杂交反应，得到杂交产物；加入5U T4 DNA连接酶催化所述杂交产物发生连接反应，从而获得连接产物；

(4)外切反应：在50μL 1×NEB buffer 4中加入10μL所述连接产物和10U T5外切酶，室温下经行外切反应，得到外切产物，并以PCR纯化试剂盒纯化，得到纯化后的外切产物；

(5)RCA反应：在20μL 1×phi29DNA聚合酶缓冲液中加入1μL纯化后的外切产物，1μLprobe 3和10U phi29 DNA聚合酶，在30℃下经行RCA反应5-25min，得到RCA产物；

氧化还原反应：在缓冲液中加入终浓度为0.6μM的Hemin，以及含有RCA产物的终溶液，室温孵育，再加入终浓度均为2mM的ABTS^2-和H₂O₂继续孵育，直接观察终溶液颜色是否变化，显色为绿色的样品为阳性，不显色则样品为阴性；

步骤(2)中所述primer-F的基因序列如SEQ ID NO.1所示5′-CCCAACCCGCCCTACCCCGGCCACCAGAGGATGTG-3′；所述primer-R的基因序列如SEQ ID NO.2所示5′-CAACACGAATCGCTTCCTGAC-3′；

步骤(3)中所述probe 1的加入量为1μL；

步骤(3)中所述probe 1的基因序列如SEQ ID NO.3所示5′-GGGCGGGTTGGGTCAACACGAATCGC-3′；

步骤(5)所述probe 3的基因序列如SEQ ID NO.5所示5′-TCCCAGACCCATCAGCCAGAGA-3′。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述煮沸冷却法的具体操作为：将所述悬浮液沸水浴加热10min，冰上冷却并涡旋1min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述RPA反应体系包括：25μL 2×reaction buffer,2μL 2.5mM each dNTP,5μL 10×basic E-mix,2.4μL 10μM primer-F,2.4μL 10μM primer-R,2.5μl 20×core reaction mix,7.2μL H₂O。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述RPA反应体系的反应条件为：在42℃下反应20min，然后升高温度至85℃保持3min，灭活反应体系的酶和蛋白。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述外切反应时间为5min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述RCA反应时间为15min。

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