CN107789666A - 一种内壁微图案化小口径人造血管 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料技术领域,提供了一种内壁微图案化小口径人造血管。该小口径人造血管具有两层结构。外层为静电纺丝微纤维层,提高小口径人造血管的力学性能,保持其管状结构的稳定性。内层为具有微图案结构的涂覆层,利于内皮细胞的粘附、铺展和生长,并能够促进内皮细胞骨架伸长和引导内皮细胞取向生长,保证细胞功能的正常发挥。而目前的产品或者研究的小口径人造血管的力学性能较差,不能完全满足临床的要求,而且不能促进内皮细胞的取向生长和细胞功能的正常发挥。本发明的内壁微图案化小口径人造血管具有良好的力学性能和生物学性能,适用于损伤或病变小口径血管组织的修复和置换。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域,特别是涉及一种微图案化小口径人造血管。
背景技术
心血管疾病已成为威胁人类健康的第一杀手。许多心血管疾病的发生都与血管的狭窄或闭塞密切相关。血管的狭窄或闭塞阻碍血液的正常流动,导致组织因营养供应不足而损伤。常见的疾病有冠心病,脑血管疾病、外周动脉粥样硬化和深静脉血栓等等。血管重建是这类疾病治疗的一种重要方法,在临床外科中占据着十分重要的地位。截止到目前,仅美国每年就有超过500,000患者需要进行血管外科手术,其中绝大部分患者都需要合适的血管移植物。
目前,临床上应用的小口径血管移植物主要是自体血管,隐静脉和胸廓内动脉被公认为小口径血管移植物的黄金标准。尽管自体血管代表了小口径血管移植物的黄金标准,但是自体血管移植物的通畅率仍然不是很理想。在冠状动脉和股腘动脉搭桥手术中,自体隐静脉在移植10年后的远期通畅率仅为50%。而且,由于自体血管来源有限,且供区牺牲较大,其在临床上的应用也受到极大的限制。
人造血管被认为是一种可替代自体血管的血管移植物。与自体血管相比,人造血管具有来源丰富,取材方便等优点,其研究得到广泛的关注。涤纶和膨化聚四氟乙烯是目前使用最多的人造血管,这类聚合物人造血管在替代人体大中动脉方面已经成功应用于临床并取得了满意的效果。然而,这类聚合物材料制备的小口径(直径<6mm)人造血管在替换小口径血管方面几乎全部失败,其在移植入体内后极易发生急性栓塞和内膜增生等问题,研究表明膨化聚四氟乙烯人造血管用于冠状动脉搭桥手术,术后1年其通畅率仅为60%,远低于隐静脉95%的通畅率,术后2年膨化聚四氟乙烯人造血管的通畅率仅为32%,此时隐静脉的通畅率仍保持在90%以上。在膝上股腘动脉搭桥手术中,术后5年膨化聚四氟乙烯人造血管的通畅率为59%,远低于隐静脉78%的通畅率。而且,血管内皮细胞在上述聚合物人造血管内壁不易粘附、铺展、生长和增殖,其生物相容性还有待提高。
近年来,研制出能够避免急性血栓和内膜增生,拥有良好力学性能和生物学性能的小口径人造血管成为了国内外的一个研究热点。研究者使用丝素蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、去细胞基质等天然高分子材料制备小口径人造血管,这类小口径人造血管具有良好的生物相容性,但是力学测试结果表明它们的力学性能较差,不能满足临床上对小口径人造血管的力学性能要求。而合成高分子生物材料因为具有良好的力学性能和生物相容性而被广泛应用于制备小口径人造血管,研究者采用一种或多种合成高分子材料,或者联合天然高分子材料制备小口径人造血管,研究证明这类小口径人造血管具有良好的力学性能和生物相容性。然而,该类小口径人造血管也存在一定的问题,内皮细胞接种在这些小口径人造血管内壁表现为无规则杂乱生长,与天然血管内皮细胞沿着血液流动方向排列生长差异较大,内皮细胞功能受到抑制。
微图案技术的发展为生物材料表面改性提供了新的技术。材料表面的微图案结构可调控细胞与材料之间的相互作用,促进细胞的粘附、生长、增殖与分化,并能影响细胞的生长方向、细胞骨架的排列分布和细胞功能基因的表达。因此,依托微图案技术制备内壁微图案化的小口径人造血管有望解决上述问题。
发明内容
为解决现有技术制备的小口径人造血管力学性能较差和不能引导内皮细胞取向生长从而抑制内皮细胞功能的问题,本发明提供一种能够引导内皮细胞取向生长,且具有良好力学性能和生物相容性的内壁微图案化小口径人造血管。其技术解决方案为:
内壁微图案化小口径人造血管是由静电纺丝微纤维层和微图案涂覆层构成。其中,微图案涂覆层构成小口径人造血管的内层,静电纺丝微纤维层包裹微图案涂覆层,形成小口径人造血管的外层。首先,将微图案聚二甲基硅氧烷薄膜卷在金属轴上,金属轴预先均匀涂覆一层易溶于水的聚乙二醇,再将涂覆液涂覆在微图案聚二甲基硅氧烷薄膜表面,涂覆液干燥凝固后即可将微图案从聚二甲基硅氧烷薄膜上刻印到涂覆层,形成微图案涂覆层,涂覆液为丝素蛋白溶液与甘油的共混液,其中甘油能够起到改性丝素蛋白的作用,使得到的涂覆层更加柔韧。静电纺丝微纤维层由静电纺丝装置制备,纺丝液为丝素蛋白/聚乳酸己内酯共混的六氟异丙醇溶液,收集装置为高速旋转圆轴收集器。静电纺丝层作为外层结构,能够稳固小口径人造血管的管状结构,天然高分子材料丝素蛋白加入聚乳酸己内酯后能够显著增强静电纺丝微纤维层的力学性能,提高内壁微图案化小口径人造血管各方面的力学性能。
由于采用本发明的技术方案,本发明的小口径人造血管内壁具有微图案结构,能够引导内皮细胞的取向生长,可有效解决内皮细胞接种培养在小口径人造血管表面功能受到抑制等问题。同时,使用丝素蛋白和聚乳酸己内酯共混纺丝液综合了两种材料的性能,可有效解决小口径人造血管力学性能不足和生物相容性较差等问题。本发明的内壁微图案化小口径人造血管可广泛应用于生物医疗领域。
附图说明
图1为本发明实施例1制备微图案小口径人造血管的静电纺丝示意图;
图2为本发明实施列1制备的微图案小口径人造血管外观形貌图;
图3为本发明实施例1制备的微图案小口径人造血管截面放大500倍的扫描电镜图;
图4为本发明实施例1制备的微图案小口径人造血管内表面放大1000倍的扫描电镜图;
图5为本发明实施例3培养在微图案小口径人造血管内壁的内皮细胞免疫荧光染色图;
具体实施方式
具体结合实施例,对本发明做进一步的阐述。这些实施例仅用于说明本发明的特征和优点而不用于限制本发明的范围。
本发明提供了一种内壁微图案化小口径人造血管,具体实施步骤如下:
在玻璃片上均匀覆盖一层光刻胶,使用紫外光刻机在光刻胶表面制备微图案,得到微图案光刻胶,优选平行条纹微图案,条纹宽度和间距均为20μm~30μm,高度为2-5μm。
将聚二甲基硅氧烷均匀覆盖在上述微图案光刻胶表面,置于加热板上固化后将聚二甲基硅氧烷揭下,得到微图案聚二甲基硅氧烷薄膜,微图案聚二甲基硅氧烷薄膜厚度优选为10μm~50μm。
将熔融的聚乙二醇均匀涂覆在金属轴上,冷却凝固后将上述微图案聚二甲基硅氧烷薄膜卷在该金属轴表面,得到卷有微图案聚二甲基硅氧烷薄膜的金属轴,金属轴直径优选为1~6mm。
将家蚕生丝依次进行脱胶、溶解、透析,得到丝素蛋白水溶液。
将所述丝素蛋白水溶液用聚乙二醇进行浓缩,得到丝素蛋白浓溶液,丝素蛋白浓溶液优选为15%~25%。
将所述丝素蛋白水溶液进行冷冻干燥,获得再生丝素蛋白海绵;
将所述的丝素蛋白浓溶液与甘油混合,甘油与丝素蛋白浓溶液中丝素蛋白的质量比优选为0.5~2:1,充分振荡混匀后得到涂覆液,将涂覆液涂覆于上述卷有微图案聚二甲基硅氧烷薄膜的金属轴上,并匀速旋转金属轴保证涂覆液均匀覆盖微图案聚二甲基硅氧烷薄膜;
将所述覆盖有涂覆液的金属轴安装在静电纺丝高速旋转圆轴收集器上,以丝素蛋白和聚乳酸己内酯的六氟异丙醇溶液为纺丝液,纺丝液总浓度优选为6%~15%,更优选为9%~12%,其中丝素蛋白和聚乳酸己内酯的比例优选为0.5~3:1,更优选为2~3:1。利用静电纺丝技术在涂覆层外表面形成一层均匀的静电纺丝微纤维层,静电纺丝参数优选为:电压为10kV~20kV,纺丝液推注速度为0.5mL/h~2mL/h,针头与金属轴的接收距离为10cm~20cm,高速旋转圆轴收集器转速为500r/min~4000r/min,静电纺丝总时间为3h~5h。静电纺丝完成后将其浸泡于无水乙醇中,改性丝素蛋白,浸泡处理后取出上述金属轴,干燥后复浸泡于蒸馏水中,待金属轴表面的聚乙二醇完全溶解后,抽出金属轴,获得内壁附有聚二甲基硅氧烷薄膜的小口径人造血管,轻轻剥落聚二甲基硅氧烷薄膜,得到内壁微图案化小口径人造血管,微图案小口径人造血管壁厚优选为0.3mm~0.4mm,涂覆层厚度优选为0.02mm~0.05mm,静电纺丝层厚度优选为0.25mm~0.35mm。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明提供的内壁微图案化小口径人造血管进行详细描述。
实例1
1.使用匀胶机将AR-P 3250正性光刻胶均匀覆盖在玻璃片上,95℃固化后使用紫外光刻机制备出条纹宽度和间距均为20μm,深度为2μm的平行条纹微图案光刻胶;
2.使用匀胶机将聚二甲基硅氧烷均匀覆盖在上述微图案光刻胶表面,置于加热板上95℃固化2h,固化后使用镊子仔细揭下表面的薄膜,即得微图案聚二甲基硅氧烷薄膜;
3.将20g家蚕生丝在2L浓度为0.02mol/L的碳酸钠去离子水溶液中煮沸30min进行脱胶处理,将煮沸后的蚕丝用去离子水清洗6遍,拉松后置于37℃烘箱中干燥,得到脱胶蚕丝;
4.将脱胶蚕丝按27g:100mL的比例溶解于9.3mol/L溴化锂水溶液中,60℃烘箱中搅拌溶解4h得到丝素蛋白盐溶液;
5.将所述丝素蛋白盐溶液灌注于截留分子量为3.5kDa的透析袋内后浸泡于去离子水中,每隔2h更换去离子水,持续透析4天,得到丝素蛋白水溶液,将部分所得的丝素蛋白水溶液冷冻干燥获得再生丝素蛋白海绵,剩下的丝素蛋白水溶液用聚乙二醇浓缩,得到浓度为20%的丝素蛋白浓溶液;
6.将所述浓度为20%的丝素蛋白浓溶液与甘油按溶质质量比1:1共混,充分振荡混匀后离心去气泡;将所述的微图案聚二甲基硅氧烷薄膜平整地卷在涂有聚乙二醇的3mm金属轴上,然后将金属轴安装在高速旋转圆轴收集器上,在500r/min的转速下将丝素蛋白和甘油的共混液均匀涂覆在微图案聚二甲基硅氧烷薄膜表面,形成微图案涂覆层;
7.如图1所示为本实施例中制备微图案小口径人造血管的静电纺丝示意图,将所述的再生丝素蛋白海绵和聚乳酸己内酯按质量比3:1配置成总浓度为12%的六氟异丙醇纺丝液,在微图案涂覆层表面进行静电纺丝,静电纺丝过程中射泵推进速度设为1mL/L,电压设为15kV,针头与金属轴距离设为15cm,收集器的转速调为2000r/min,静电纺丝总时间为4h,静电纺丝完成后即在微图案涂覆层外表面形成静电纺丝微纤维层;将带有小口径人造血管的金属轴用无水乙醇处理30min改性丝素蛋白,浸泡后取出干燥,干燥后浸泡于去离子水,待金属轴表面的聚乙二醇完全溶解后,抽出金属轴,获得内壁附有聚二甲基硅氧烷薄膜的小口径人造血管;
8.将所述的内壁附有聚二甲基硅氧烷薄膜的小口径人造血管轻轻剥落聚二甲基硅氧烷薄膜,浸泡于去离子水中48h,去除微图案涂覆层中游离的甘油,干燥后即得内壁微图案化小口径人造血管。
如图2所示为本实施例制得的内壁微图案化小口径人造血管的外观形貌图,(A)图显示该小口径人造血管长度约为3.3cm,(B)图显示该小口径人造血管内径约为3.5mm。
如图3所示为本实施例制得的内壁微图案化小口径人造血管的截面扫面电镜图,由图可知,该小口径人造血管由内壁微图案涂覆层和外壁静电纺丝微纤维层构成。
如图4所示为本实施例制得的小口径人造血管内表面的扫面电镜图,由图可知,该小口径人造血管内壁的微图案为规整的平行条纹图案。
实施例2
1.将实施例1中制备的内壁微图案化小口径人造血管浸泡于磷酸盐缓冲液中,充分湿润,得到湿润的小口径人造血管;
2.将所述湿润的小口径人造血管剪为3cm长度的试验样品,使用日本岛津万能材料试验机进行轴向拉伸力学测试,选用量程为100N的载荷传感器,拉伸速率设为5mm/min;
3.将所述湿润的小口径人造血管剪为6mm长度的试验样品,使用上述材料试验机进行径向拉伸力学测试,选用量程为100N的载荷传感器,拉伸速率设为3mm/min;
4.将所述湿润的小口径人造血管剪为2cm长度的试验样品,使用上述材料试验机和6-0聚乙醇酸带针手术缝合线进行缝合强度力学测试,选用量程为100N的载荷传感器,拉伸速率设为3mm/min;
5.将所述湿润的小口径人造血管剪为3cm长度的试验样品,使用***压测试装置进行***压测试;
6.将力学试验数据保存整理,得出内壁微图案化小口径人造血管在湿态时的各项力学试验结果,其轴向拉伸强度为2.48MPa,断裂应变为33.06%,弹性模量11.61MPa;径向拉伸强度为2.70MPa,弹性模量为11.89MPa;缝合强度为1.86N;***压为470.82mmHg;满足临床上对小口径人造血管的力学性能要求。
实例3
1.将实例1中制备的内壁微图案化小口径人造血管剪为1cm长度的试验样品,浸泡于磷酸盐缓冲液中,使用高压灭菌锅进行灭菌处理,得到无菌试验样品;
2.将所述无菌试验样品和细胞接种所用器具置于超净台中,使用紫外灭菌0.5h以上,无菌试验样品移至入24孔板中,待无菌试验样品干燥后在试验样品内壁接种1x105个内皮细胞,接种完成后置于二氧化碳培养箱中培养2h使细胞粘附,然后加入0.8mL内皮细胞培养基,放入二氧化碳培养箱培养3天;
3.将培养后的小口径人造血管进行免疫荧光染色,使用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽对细胞骨架纤维状肌动蛋白进行染色,然后再使用4,6-联脒-2-苯基吲哚复染细胞核,置于激光共聚焦显微镜下拍照,评估内壁微图案化小口径人造血管的生物学性能。
如图5所示为本实施例中培养在微图案小口径人造血管内壁的内皮细胞免疫荧光染色图,由图可知,该小口径人造血管具有良好的生物相容性,内皮细胞在血管内壁生长状态良好,而且,内壁的微图案结构能够引导内皮细胞的取向生长,使内皮细胞沿着平行条纹生长,有助于内皮细胞功能的正常发挥。
由上述结果可知,本发明制备的内壁微图案小口径人造血管具有良好的力学性能,满足临床上对小口径人造血管的力学性能要求。同时,该小口径人造血管具有良好的生物相容性,内壁的微图案结构能够引导内皮细胞的取向生长,促进内皮细胞功能的正常发挥,适用于修复和替代损伤或病变的小口径血管。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,本发明并不限于上述实施方式,在不背离本发明的实质内容的情况下,本技术领域的普通技术人员还可以对本发明进行若干变形、修饰和改进,这些变形、修饰和改进也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种内壁微图案化小口径人造血管,其特征在于,静电纺丝微纤维层包裹微图案涂覆层形成的小口径人造血管。
2.根据权利要求1所述的内壁微图案化小口径人造血管,其特征在于,内径在1mm-6mm之间。
3.根据权利要求1所述的内壁微图案化小口径人造血管,其特征在于,内壁具有微图案结构,微图案为平行条纹、圆形凹槽或凸起、方形凹槽或凸起、三角形凹槽或凸起、同心圆环凸起或凹槽、螺旋凹槽或凸起及上述多种微图案的复合图形,且微图案精度可控,可达微米或纳米级。
4.根据权利要求书所述的内壁微图案化小口径人造血管,其内壁微图案涂覆层所用涂覆液的溶质可为丝素蛋白、壳聚糖、胶原、聚己内酯、聚氨酯、聚羟基乙酸(酯)、多聚乳酸、聚羟基丁酸、聚乙醇酸、聚对二氧环己酮及上述多聚物间的共聚物中的一种或者几种,溶剂可为水、甲酸、乙酸、氯仿、丙酮、六氟异丙醇、六氟丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺及上述两种或者两种以上以不同比例混合。
5.根据权利要求1所述的内壁微图案化小口径人造血管,其静电纺丝微纤维层通过静电纺丝技术制备,所用纺丝液的溶质为可降解的高分子材料(可选用下列之一或者下列两种或者两种以上的混合物):①天然高分子材料,包括丝素蛋白、壳聚糖、胶原、弹性蛋白、明胶蛋白②合成高分子材料,包括聚己内酯、聚氨酯、聚羟基乙酸(酯)、多聚乳酸、聚羟基丁酸、聚乙醇酸、聚对二氧环己酮及上述多聚物间的共聚物,溶剂为甲酸、乙酸、氯仿、丙酮、六氟异丙醇、六氟丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺及上述两种或者两种以上以不同比例混合。
6.根据权利要求1所述的内壁微图案化小口径人造血管,其特征在于,具有良好的力学性能,满足小口径人造血管体内移植的要求。
7.根据权利要求1所述的内壁微图案化小口径人造血管,其特征在于,具有良好的生物相容性,能够引导内皮细胞取向生长,可用于体外构建组织工程化人造血管。
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