CN110499361A - 一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用 - Google Patents

一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用，该方法利用待测核酸片段互补序列、引物、微球、核酸聚合酶、荧光标记ddNTP、核糖3'‑OH被保护的荧光标记dNTP、核糖3'‑OH被保护的dNTP、核糖3'‑OH去保护剂等，通过微球包被引物的单碱基延长，得到了一系列适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的末端碱基流式荧光测序微球，将这些测序微球进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。与现有测序法相比，本发明具有简洁、准确及数据易解读等显著优点。本发明所得测序微球能广泛用于基因检测、微生物检查、遗传学、外显子、单核苷酸多态性(SNP)、基因组学和蛋白质组学等核酸测序领域，尤其是在肿瘤伴随诊断领域有很好的应用。

Description

一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法，尤其涉及一种适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的末端碱基流式荧光测序微球的制备方法以及采用该末端碱基流式荧光测序微球检测核酸碱基序列的方法，属于基因测序技术领域。
背景技术
基因组携带了生命个体的全部遗传信息，基因测序不但能够加深对疾病尤其是恶性肿瘤的分子机制理解，而且在指导靶向给药方面也发挥着重要作用。人类基因组学计划完成后，基因测序技术的发展更加迅猛，在临床实践和基础研究中的应用更加广泛。目前，核酸测序法已发展至三代，从最初第一代以Sanger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005年以illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序（next-generation sequencing，NGS），到以SMRT、Nanopore法为代表的第三代测序，这些测序法虽然在不断地提高基因测序的效率和准确性，但仍然存在操作复杂、分辨率低及数据不易解读(如：基因结构重排和重复区域)等问题，制约了其大规模应用。
流式细胞技术是利用流式细胞仪对单个细胞或颗粒进行多参数、快速的定量分析的技术，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是先进的生物传感技术之一。已有常见适用于流式细胞仪的包被引物或探针的微球只能用于已知碱基突变靶点的识别，而不能用于碱基测序。因此发展一种适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的末端碱基流式荧光测序微球具有重大价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的末端碱基流式荧光测序微球的制备方法，该方法能够针对待测核酸序列得到合适的测序微球，该测序微球能够被流式细胞仪进行检测，进而准确识别待测核酸片段的碱基序列。
目前，基因检测在遗传学、产前诊断、及伴随诊断等医学领域中有重要的应用。例如：通过基因检测确定患者特定基因片段是否有突变以及突变位点，能够指导靶向给药，提高肿瘤的治疗效果。而现有流式细胞技术仅能对已知的基因突变靶点进行识别，而不能用于碱基测序。本发明提供了适用于流式细胞仪进行测序的测序微球的制备方法，利用该特定的方法制得的测序微球可用流式细胞仪检测，进而得到具体的核酸碱基序列，通过与野生型碱基序列的对比，可以解读基因突变的信息，对发病机理阐述、患病个体诊治都有重要意义。
本发明的技术方案如下：
一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)将待测核酸片段互补序列的单向引物包被在微球表面，形成引物包被的微球；
(2)将引物包被的微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液混合，得混合物，将该混合物分为两份，其中一份混合物中加入荧光标记的ddNTP（dideoxynucleosidetriphosphate，双脱氧核苷三磷酸）或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP（deoxynucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸），进行孵育，另一份的混合物中加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；
（3）取上一步加入核糖3'-OH被保护的dNTP进行孵育的微球，洗涤后加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；
（4）将上一步的微球洗涤，分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶和缓冲液混合，所得混合物中再加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶和缓冲液混合，所得混合物中再加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；
（5）不断重复上述（3）和（4）的步骤，测序待测核酸片段n个碱基共需连续制备n群微球，共得到加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的n群微球，这n群微球即为本发明所称的末端碱基流式荧光测序微球；
（6）如果利用上述步骤（5）的n群微球无法检测出所有的碱基，则需要替换步骤（2）和（4）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，重复步骤（2）-（5）继续制备微球，共得到4×n或3×n或2×n群微球，步骤（5）和（6）中得到的4×n、3×n、2×n或n群即为本发明所称的末端碱基流式荧光测序微球，利用这些微球能够实现待测核酸片段的测序。
进一步的，上述方法中，所述n为待测核酸片段的碱基个数。
进一步的，上述方法中，步骤（2）和（4）中加入的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的种类为3种或4种时，才能理论上利用所得测序微球得到待测核酸片段的所有碱基序列，当加入3种时，相应的3种碱基均会出现检测结果，如果没有结果显示，即表示该碱基为这3种以外的碱基。根据步骤（2）和（4）中加入的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的种类的不同，最终所得的末端碱基流式荧光测序微球的群数也不同，所述群的意思是每次所得的微球并非一个，而是多个，因此称之为群。根据荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的加入方式的不同，最终所得的末端碱基流式荧光测序微球的群数可以为n群、2n群、3n群或4n群。
进一步的，本发明以待测核酸片段互补序列为模板，在核酸聚合酶催化下，一份微球通过加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP而使微球包被引物末端延长单个荧光标记碱基，该份微球保留用于碱基测序，另一份微球通过加入核糖3'-OH被保护的dNTP而使微球包被引物末端延长单个非荧光标记碱基。微球包被引物末端延长单个非荧光标记碱基后，通过加入核糖3'-OH去保护剂而使微球包被引物延长链末端核酸核糖3'-OH去保护，然后将该份微球分成两份，一份继续加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，另一份继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP后，微球包被引物末端延长单个荧光标记碱基，所得微球保留用于测序，加入核糖3'-OH被保护的dNTP后，微球包被引物末端再次延长单个非荧光标记碱基。将加入核糖3'-OH被保护的dNTP孵育的微球再次加入核糖3'-OH去保护剂去保护，然后再次分为两份，按照上述相同的步骤分别加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP和核糖3'-OH被保护的dNTP，以此类推，不断重复上述操作，直至得到测序n个碱基所需的所有测序微球。本发明选择加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育得到的n群微球为末端碱基流式荧光测序微球，这些测序微球可被流式细胞仪检测而用于识别待测核酸片段碱基序列。
进一步的，上述制备方法中，所述微球为流式细胞技术所用的微球，例如聚苯乙烯微球，该微球可以通过市场购买得到。本发明所用微球可以是尺寸均一或者尺度编码的微球，也可以是不含荧光或者荧光编码的微球。微球的直径可以在0.5-50μm范围内选择，优选为1-10μm。
进一步的，本发明微球为经过下述一种或多种方式进行修饰的微球：经羧基、氨基、羟基、酰肼基、醛基、氯甲基、环氧乙烷、抗体、核酸适配体、链霉亲和素、多聚胸苷酸(polythymidylic acid，poly T)、多聚腺苷酸(polyadenylic acid，poly A)、多聚鸟苷酸(polyguanylic acid，poly G)、多聚胞苷酸(polycytidylic acid，poly C)、多聚尿苷酸(polyuridylic acid，poly U)和甲基化CpG结合结构域(MBD)蛋白中的至少一种进行修饰。微球修饰的目的是在微球表面引入可以与单向引物结合的基团，以便单向引物包被在微球表面。一般使用最广泛的是经过羧基进行修饰的微球，即羧基化微球。微球的修饰可以通过现有技术中报道的方法进行，也可以直接购买修饰的微球。
进一步的，上述制备方法中，所述的待测核酸片段为a）单链脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)片段、b）变性的双链DNA片段和c）单链与双链DNA片段混合物中的至少一种，本发明所指的待测核酸片段指的是特定所需的某一片段，例如人类全基因组序列已经公开，其他动物或微生物的全基因组序列也有相关的报道，如果想要检测已知全基因组序列的人类、动物、微生物特定的某一段序列，那该段想要检测的序列即为待测核酸片段。针对该要检测的核酸片段的互补序列，设计单向引物。
进一步的，上述制备方法中，所述单向引物是指以待测核酸片段互补序列为模板、在聚合酶催化下，能够在末端延长碱基的引物。单向引物因为要包被到微球表面，所以要对其进行修饰，以便单向引物上形成能够与微球上的修饰基团进行结合的基团。因此，本发明所用的单向引物是经过氨基、羧基、地高辛、生物素、poly A、poly G、poly C、poly T、polyU和甲基中的至少一种进行修饰的单向引物。修饰后的微球与修饰后的单向引物彼此之间要保证能够进行结合，以便单向引物能够包被到微球表面，所述包被指的就是微球上的修饰基团与单向引物上的修饰基团进行结合的过程，例如微球上修饰了羧基，单向引物上修饰了氨基。单向引物的设计和修饰可以送至相应的引物设计公司完成，例如上海生工公司。
进一步的，上述制备方法中，所述的核酸聚合酶为DNA依赖的DNA聚合酶，包括TaqDNA聚合酶、Klenow片段、测序酶（Sequenase）。
进一步的，上述制备方法中，所述的ddNTP为双脱氧腺苷三磷酸(dideoxyadenosine triphosphate，ddATP)、双脱氧鸟苷三磷酸(dideoxyguanosinetriphosphate，ddGTP)、双脱氧胞苷三磷酸(dideoxycytidine triphosphate，ddCTP)、双脱氧尿苷三磷酸(dideoxyuridine triphosphate ddUTP)、双脱氧胸苷三磷酸(dideoxythymidine triphosphate，ddTTP)之一或者它们两种或者两种以上的组合，双脱氧尿苷三磷酸(dideoxyuridine triphosphate，ddUTP)和双脱氧胸苷三磷酸(dideoxythymidine triphosphate，ddTTP)不同时出现。
进一步的，上述制备方法中，所述的dNTP为脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate，dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate，dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate，dCTP)、脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate，dUTP)、脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate，dTTP)之一或者它们两种或两种以上的组合，脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate，dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate，dTTP)不同时出现。
进一步的，上述制备方法中，所述荧光标记的ddNTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP中，将ddNTP和核糖3'-OH被保护的dNTP进行荧光标记，以便在后续测序过程中使用，在本发明中，ddNTP和核糖3'-OH被保护的dNTP可以采用下述任意一种或多种的荧光物质进行标记：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、菁染料Cy5(cyanine 5)、德克萨斯红(Texas Red)、菁染料Cy3(cyanine 3)、菁染料Cy7(cyanine 7)、羟基荧光素(FAM)、萤光黄(lucifer yellow)、菁染料Cy5.5(cyanine 5.5)、罗丹明110(rhodamine 110，R110)、ROX、罗丹明6G(rhodamine 6G，R6G)、TAMRA。
进一步的，上述制备方法中，所述荧光标记的ddNTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP、核糖3'-OH被保护的dNTP可以从市场中购买得到，也可以参考«保护基化学»(武钦佩、李善茂編著，化学工业出版社，北京，2007)、«Bioconjugate Techniques»(secondedition,Greg T.Hermanson，Elsevier press,2008)中记载的方法自行制备。
进一步的，上述制备方法中，所述缓冲液基本组成成分为Tris-HCl(pH7-7.5)、MgCl2、NaCl。
进一步的，上述步骤（2）、（4）、（5）中，加入不同的成分配成孵育体系，然后控制合适的条件进行孵育。孵育可以在24孔板孔、24孔滤板孔、96孔板孔、96孔滤板孔、384孔板孔、384孔滤板孔、离心管、EP管等容器中进行，每次孵育所用的容器可以相同，也可以不同。每次孵育时，孵育体系的总体积均为10μl-10ml，优选为10μl-50μl。孵育体系指的是每次孵育时将所需的各种成分混合形成的混合物。每次孵育时，孵育体系中微球的终浓度均为5×102个/ml至2.5×108个/ml，核酸聚合酶的终浓度均为0.2-240 units/ml，每种荧光标记的ddNTP的终浓度均为0.02-200μmol/L，每种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的终浓度均为0.02-200μmol/L, 每种核糖3'-OH被保护的dNTP的终浓度均为0.02-200μmol/L。荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP、荧光标记的ddTTP/ddUTP(ddTTP/dUTP的意思是ddTTP或ddUTP，下同)、荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP中的任意一种或几种，荧光标记的ddATP、荧光标记的ddTTP/ddUTP、荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP中的任意一种（如果加入的话）的终浓度均为0.02-200μmol/L。核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP中的任意一种或几种，核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP中的任意一种（如果加入的话）的终浓度均为0.02-200μmol/L。核糖3'-OH被保护的dNTP为:核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP（dTTP/dUTP的意思是dTTP或dUTP，下同）、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP的混合物，核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP中的任意一种的终浓度均为0.02-200μmol/L。
进一步的，上述步骤（2）、（4）、（5）中，每次孵育的温度均为0-100℃，优选为37-45℃，每次孵育的时间均为10s-60min，优选为50-100s。
进一步的，上述步骤（3）中，将孵育后的微球加入核糖3'-OH去保护剂，对核糖3'-OH进行去保护。所述核糖3'-OH去保护剂可以从市场中购买。核糖3'-OH去保护剂的终浓度为0.1-10mol/L。
进一步的，上述步骤（2）和（4）中，将微球分为两份，其中一份微球中加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，另一份微球中加入核糖3'-OH被保护的dNTP。本发明上述方法根据待测核酸片段的碱基数目，不断的重复步骤（3）和（4）可以得到与待测核酸片段的碱基数目相同的群数的测序微球，例如待测核酸片段的碱基数目为n个时，重复步骤（3）和（4）得到n群测序微球，对这n群测序微球用流式细胞仪进行检测，微球群的顺序对应碱基排列顺序，由此可以得到待测核酸片段的碱基序列。当步骤（2）和（4）中加入3-4种荧光分别标记的ddATP、ddTTP/ddUTP、ddGTP、ddCTP或/和核糖3'-OH被保护的dATP、dTTP/dUTP、dGTP、dCTP时，仅制备n群测序微球并对其进行测序，就可以得到待测片段的碱基序列，例如待测序列为单链DNA时，当同时加入3-4种荧光分别标记的ddATP、ddTTP/ddUTP、ddGTP、ddCTP时，制备n群微球经过检测就能得到该核酸片段的碱基序列,加入4种荧光标记的ddNTP时，可以同时检测出4种碱基，加入三种荧光标记的ddNTP时，仅能同时检测出3种碱基，但没有结果显示的即为第4种碱基，因此加入3种荧光标记的ddNTP也能通过n群微球一次性检测出核酸片段的碱基序列。而当步骤（2）和（4）中加入1-2种荧光分别标记的ddATP、ddTTP/ddUTP、ddGTP、ddCTP或/和核糖3'-OH被保护的dATP、dTTP/dUTP、dGTP、dCTP时，那仅n群测序微球就不能得到整个待测核酸片段的碱基序列，需要再进行步骤（6），即替换荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，重复步骤（2）-（5），得到4×n、3×n或2×n群的测序微球，以保证所有位点的所有可能的碱基都能检测出来。在本发明某一具体实施方式中，仅加入2种荧光分别标记的ddNTP或2种荧光分别标记的核糖3'-OH被保护的dNTP时，得到的n群测序微球只能检测这两种特定的碱基，因此为了得到全部的碱基序列，需要替换荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的的dNTP，再重复实验，得到检测另两种碱基的n群测序微球，这些微球结合起来才能得到全部的碱基序列。
进一步的，上述步骤（6）中，测序重复的次数取决于每次加入的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP种类的多少，每次加入的种类多，重复的次数就少一些，每次加入的少，重复的次数就多一些。当仅制备n群测序微球，一次性检测所有可能的碱基时，对流式细胞仪的配置要求较高，为了降低成本，使本发明方法适合于现有的流式细胞仪，优选制备2n群的测序微球。采用上述方法制备2n群微球时，先在步骤（2）和（4）中加入任意两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，得到n群微球，然后将步骤（2）和（4）中的两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP替换为另两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，重复步骤（2）-（5），得到n群微球，共得2n群微球。2n群微球与3n、4n群微球相比，操作简便，与n群微球相比，对于流式细胞仪的配置要求低，测序成本低。每次加入的两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP可以随意组合，例如可以先加入荧光标记的ddTTP/ddUTP和ddATP得到n群微球，再将它们替换成荧光标记的ddGTP和ddCTP得到n群微球；也可以先加入荧光标记的ddTTP/ddUTP和ddGTP得到n群微球，再将它们替换成荧光标记的ddATP和ddCTP得到n群微球；也可以先加入荧光标记的ddTTP/ddUTP和ddCTP得到n群微球，再将它们替换成荧光标记的ddATP和ddGTP得到n群微球等等。
进一步的，本发明提供了一种末端碱基流式荧光测序微球的具体制备方法，包括以下步骤：
(1)将待测核酸片段互补序列的单向引物包被在微球表面，得引物包被微球；
(2)容器Ⅰ、Ⅱ中均加入引物包被微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液，容器Ⅰ中继续加入荧光标记的ddNTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP之一或他们的组合，容器Ⅱ中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育（优选的，每容器中液体终体积为10μl至10ml，混匀，0℃至100℃孵育10秒至60分钟）；
(3)洗涤容器Ⅱ中微球，再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)留存部分微球在容器Ⅱ中，其余微球从容器Ⅱ中移至容器Ⅲ中；
(5)洗涤微球，容器Ⅱ和容器Ⅲ均再加入核酸聚合酶、缓冲液，容器Ⅱ中继续加入荧光标记的ddNTP、核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP之一或组合，容器Ⅲ中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育（优选的每容器中液体终体积为10μl至10ml，混匀，0℃至100℃孵育10秒至60分钟）；
(6)不断重复类似(3)至(5)操作，测序核酸片段n个碱基共需连续制备n个容器的微球；
(7)如果利用该n个容器的微球无法检测出所有的碱基，则需要替换步骤（2）和（5）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，重复步骤（2）-（6），共得到4×n或3×n或2×n个容器的微球，所有这些容器中的微球即为本发明所称的末端碱基流式荧光测序微球。
进一步的，本发明还提供了一种优选的末端碱基流式荧光测序微球的具体制备方法，包括以下步骤：
(1)将待测核酸片段互补序列的单向引物包被在微球表面，形成引物包被的微球；
(2)容器Ⅰ、Ⅱ中均加入步骤（1）得到的引物包被微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液，容器Ⅰ中继续加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，所得测序微球记为A1；容器Ⅱ中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP和荧光标记的ddTTP/ddUTP(ddTTP或ddUTP，下同)，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，0℃至100℃孵育10秒至60分钟；
（3）洗涤容器Ⅱ中微球后，再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
（4）留存部分微球在容器Ⅱ中，其余微球从容器Ⅱ中移至容器Ⅲ中；洗涤微球，容器Ⅱ和容器Ⅲ均再加入核酸聚合酶、缓冲液，容器Ⅱ中继续加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，所得测序微球记为A2；容器Ⅲ中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP和荧光标记的ddTTP/ddUTP，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，0℃至100℃孵育10秒至60分钟；
（5）不断重复类似（3）和（4）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为An，其中n为待测核酸片段的碱基数目；
（6）容器①、②中均加入步骤（1）得到的引物包被微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液，容器①中继续加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，所得测序微球记为B1；容器②中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，0℃至100℃孵育10秒至60分钟；
（7）洗涤容器②中微球后，再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
（8）留存部分微球在容器②中，其余微球从容器②中移至容器③中；洗涤微球，容器②和容器③中均再加入核酸聚合酶、缓冲液，容器②中继续加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，所得测序微球记为B2；容器③中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；优选的，每容器中反应终体积为10μl至10ml，混匀，0℃至100℃孵育10秒至60分钟；
（9）不断重复类似（7）和（8）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为Bn，其中n为待测核酸片段的碱基个数，A1-An和B1-Bn这些微球统称为测序微球。
进一步的，本发明还提供了一种更为优选的末端碱基流式荧光测序微球的具体制备方法，包括以下步骤：
(1)将待测核酸片段互补序列的氨基修饰的单向引物包被在直径1μm至10μm的羧基化聚苯乙烯微球表面；
(2)利用全自动移液工作站，96孔滤板孔Ⅰ(H1)、孔Ⅱ(H2)中均加入引物包被微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液，孔Ⅰ(H1)中继续加入荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP，孔Ⅱ(H2)中继续加入核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dUTP/dTTP、核糖3'-OH被保护的dGTP、核糖3'-OH被保护的dCTP，孔Ⅰ(H1)、孔Ⅱ(H2)中反应总体积为10μl-50μl，两孔均混匀、37℃孵育60秒，其中孔Ⅰ(H1)中孵育后所得测序微球记为A1(图1A)；
(3)抽滤洗涤孔Ⅱ(H2)中微球，再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀(图1B)；
(4)留存部分微球在孔Ⅱ(H2)中，其余微球从孔Ⅱ中移至孔Ⅲ(H3)中(图1C)；
(5)抽滤洗涤微球，孔Ⅱ(H2)和孔Ⅲ(H3)均再加入核酸聚合酶、缓冲液，孔Ⅱ(H2)中继续加入荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP，孔Ⅲ(H3)中继续加入核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dUTP/ddTTP、核糖3'-OH被保护的dGTP、核糖3'-OH被保护的dCTP，孔Ⅱ(H2)、孔Ⅲ(H3)反应总体积为10μl-50μl，两孔均混匀、37℃孵育60秒，其中孔Ⅱ(H2)中孵育后所得测序微球记为A2(图1D)；
(6)不断重复类似(3)至(5)操作，共得到n群加入荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为An，其中n为待测核酸片段的碱基个数；
(7)将上述(2)、(5)中“荧光标记的ddATP、荧光标记的ddUTP/ddTTP”，更换为“荧光标记的ddGTP、荧光标记的ddCTP”，重复类似(2)至(6)的操作，共得到n群加入荧光标记的ddGTP、荧光标记的ddCTP进行孵育的测序微球，第一群测序微球记为B1,最后一群测序微球记为Bn，其中n为待测核酸片段的碱基个数；上述步骤(6)中制得的A1-An群微球用于测序待测核酸片段中的胸腺嘧啶(T)以及腺嘌呤(A)，步骤(7)中制得的B1-Bn群微球用于测序待测核酸片段中的胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)。
进一步的，本发明还提供了一种核酸片段的测序方法，该方法是：先按照上述末端碱基流式荧光测序微球的制备方法制得末端碱基流式荧光测序微球，将测序微球采用流式细胞仪进行检测，得到待测核酸片段的碱基序列。所得测序微球为n群、或2n群、或3n群、或4n群，保证能检测出该核酸片段每个位点的正确碱基，在检测时，测序微球的制备顺序对应碱基排列顺序，将检测结果进行整合，即可得到该核酸片段的整个碱基序列。
进一步的，上述测序方法中，所述核酸片段可以为前面提到的单链DNA片段、或变性的双链DNA片段、或单链与双链DNA片段混合物中的至少一种。该核酸片段可以是任意生物的核酸片段，可以是人体的、也可以是动物体的、也可以是微生物的。只要是知道了其野生的碱基序列，就可以采用本发明方法来进行测序。本发明方法简洁、结果准确、数据易解读，通过与野生核酸片段对比可以快速判断是否存在碱基突变，在基因检测、疾病筛查、基因指导靶向给药、单核苷酸多态性等领域有很好的应用前景。
进一步的，上述测序方法中，通过选择编码微球和控制测序微球的制备过程可以并行检测得多个核酸片段序列。
本发明通过微球包被引物的单碱基延长，建立了一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法，该用该方法得到的测序微球经流式细胞仪检测可以得到待测核酸片段的碱基序列。与现有测序法相比，利用本发明的末端碱基流式荧光测序微球进行核酸靶向测序具有简洁、准确及易解读等显著优点。本发明所得测序微球适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列，能广泛用于基因检测、微生物检查、遗传学、外显子、单核苷酸多态性(SNP)、基因组学和蛋白质组学等核酸测序领域，在疾病筛查、基因指导靶向给药，尤其是在肿瘤伴随诊断领域有很好的应用前景。
附图说明
图1是基于96孔滤板的末端碱基流式荧光测序微球制备流程图。A. 孔Ⅰ(H1)中，以待测核酸片段互补序列为模板，在核酸聚合酶催化下，微球包被引物末端延长单个荧光标记碱基；孔Ⅱ(H2)中，以待测核酸片段互补序列为模板，在核酸聚合酶催化下，微球包被引物末端延长单个碱基; B.孔Ⅱ(H2)中加入核糖3'-OH去保护剂，微球包被引物延长链末端核酸核糖3'-OH去保护；C. 留存部分微球在孔Ⅱ(H2)中，其余微球从孔Ⅱ中移至孔Ⅲ(H3)中；D. 孔Ⅱ(H2)中，以待测核酸片段互补序列为模板，在核酸聚合酶催化下，微球包被引物末端延长单个荧光标记碱基；孔Ⅲ(H3)中，以待测核酸片段互补序列为模板，在核酸聚合酶催化下，微球包被引物末端延长单个碱基。
图2是靶向测序表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因T790M核酸片段(野生型和突变型质粒DNA片段的混合物)第67位的流式直方图，样本测序起始第67位的等位碱基为胸腺嘧啶(T)(图2A)、胞嘧啶(C)(图2B)。
图3是EGFR基因T790M核酸片段的Sanger测序图，其中图3A为野生型T790M核酸片段Sanger测序图；图3B为突变型T790M核酸片段Sanger测序图。
图4是并行靶向测序EGFR基因exon 21 L858R核酸片段(野生型质粒DNA片段)、exon 18 G719X核酸片段(野生型和突变型质粒DNA片段的混合物)的混合样本起始第1个碱基测序的流式点图，其中图4 (i)为胸腺嘧啶(T)的检测结果，图4 (ii)为腺嘌呤(A)的检测结果，图4 (iii)为胞嘧啶(C) 的检测结果，图4 (iv)为鸟嘌呤(G)的检测结果；从结果看，exon 21 L858R起始第1位的碱基为胸腺嘧啶(T)，exon 18 G719X起始第1位的等位碱基为腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)。
具体实施方式
下面给出了本发明的具体实施例，这是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例中使用的功能化聚苯乙烯微球购自美国Spherotech, Inc.，菁染料Cy3标记ddATP、菁染料Cy3标记ddGTP、菁染料Cy5标记ddGTP、FITC标记ddUTP、FITC标记ddCTP购自美国PE公司，核糖3'-OH被保护的dNTP、核糖3'-OH去保护剂购自山东信力科生物科技有限公司，DNA聚合酶Sequenase、DNA聚合酶klenow片段为ThermoFisher Scientific公司产品。
如无特别说明，下述不对称PCR产物、单向引物按照现有技术中报道的PCR扩增方法获取或者委托相应的设计公司完成。
实施例1、靶向测序EGFR基因T790M核酸片段的末端碱基流式荧光测序微球的制备
(1)从NCBI Genebank上查到EGFR基因T790M片段的碱基序列，根据该序列的互补序列设计单向引物，并进行氨基修饰，经氨基修饰的单向引物为：5’GGAAGCCTACGTGATGG CCA3’，将该氨基修饰单向引物包被在直径7μm的羧基化聚苯乙烯微球表面；
(2)96孔滤板孔Ⅰ、Ⅱ均加入DNA聚合酶Sequenase、T790M片段（野生型/突变型质粒DNA片段的混合物）不对称PCR产物、缓冲液，孔Ⅰ中继续加入4000个引物包被微球、0.5μM菁染料Cy3标记ddATP、0.5μM FITC标记ddUTP，孔Ⅱ中继续加入4×105个引物包被微球、10μM核糖3'-OH被保护的dATP、10μM核糖3'-OH被保护的dUTP、10μM核糖3'-OH被保护的dGTP、10μM核糖3'-OH被保护的dCTP，每孔终体积10μl-50μl，混匀，37℃孵育60秒；
(3)抽滤洗涤孔Ⅱ中微球，再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)孔Ⅱ中留存含4000个微球的微球液，其余微球液移至孔Ⅲ中；
(5)抽滤洗涤孔Ⅱ和孔Ⅲ中微球，孔Ⅱ和孔Ⅲ均再加入DNA聚合酶Sequenase、缓冲液，孔Ⅱ中继续加入0.5μM菁染料Cy3标记ddATP、0.5μM FITC标记ddUTP，孔Ⅲ中继续加入10μM核糖3'-OH被保护的dATP、10μM核糖3'-OH被保护的dUTP、10μM核糖3'-OH被保护的dGTP、10μM核糖3'-OH被保护的dCTP，每孔终体积10μl-50μl，混匀，37℃孵育60秒；
(6)按照步骤(3)至(5)的操作，将孔Ⅲ中微球洗涤、加核糖3'-OH去保护剂、重分为两孔，孔Ⅲ加0.5μM菁染料Cy3标记ddATP、0.5μM FITC标记ddUTP, 孔Ⅳ加10μM核糖3'-OH被保护的dATP、10μM核糖3'-OH被保护的dUTP、10μM核糖3'-OH被保护的dGTP、10μM核糖3'-OH被保护的dCTP，按（3）-（5）的步骤重复操作，连续制备76孔微球；
(7)将上述(2)、(5)、(6)中的“0.5μM菁染料Cy3标记ddATP、0.5μM FITC标记ddUTP”，更换为“0.5μM菁染料Cy3标记ddGTP、0.5μM FITC标记ddCTP”，按照步骤（2）-（6）的流程重复类似操作，连续制备76孔微球。
因为DNA片段中不含有尿嘧啶(U)，所以当检测结果显示为尿嘧啶时该碱基即为胸腺嘧啶(T)。上述(6)中制得的76孔微球用于测序T790M片段中的胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)，上述(7)中制得76孔微球用于测序T790M片段中的胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)。
将步骤（6）制备的76孔微球和步骤（7）制备的76孔微球洗涤，分别上样流式细胞仪进行检测，将所有检查结果进行整合，得到T790M核酸片段的测序结果为：GCGTG GACAACCCCC ACGTG TGCCG CCTGC TGGGC ATCTG CCTCA CCTCC ACCGT GCAGC TCATC AC(C→T,T790M)GCA GCTCA T。第67位的检测结果如图2所示，从图中可以看出，第67位的碱基同时出现C和T的结果，说明该核酸片段中同时存在野生型和突变型。该检测结果与样本Sanger测序法一致，从图3A中可以看出，野生型T790M质粒DNA片段的靶点碱基为C(条形框内)；从图3B中可以看出，突变型T790M质粒DNA片段的靶点碱基为T(条形框内)。
实施例2、靶向测序EGFR基因T790M核酸片段的末端碱基流式荧光测序微球的制备
(1)从NCBI Genebank上查到EGFR基因T790M的碱基序列，根据该序列的互补序列设计单向引物，并进行地高辛修饰，经地高辛修饰的单向引物为：5’GGAAGCCTACGTGATGG CCA3’，将该地高辛修饰的单向引物包被在直径5μm的地高辛抗体修饰的聚苯乙烯微球表面；
(2)96孔滤板孔Ⅰ、Ⅱ均加入DNA聚合酶Sequenase、T790M片段(野生型和突变型质粒DNA片段的混合物)不对称PCR产物、缓冲液，孔Ⅰ中继续加入4000个引物包被微球、2μM菁染料Cy3标记ddATP、2μM FITC标记ddUTP、2μM菁染料Cy5标记ddGTP，孔Ⅱ中继续加入4×105个引物包被微球、20μM核糖3'-OH被保护的dATP、20μM核糖3'-OH被保护的dUTP、20μM核糖3'-OH被保护的dGTP、20μM核糖3'-OH被保护的dCTP，每孔终体积10μl-50μl，混匀，37℃孵育60秒；
(3)抽滤洗涤孔Ⅱ中微球，再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)孔Ⅱ中留存含4000个微球的微球液，其余微球液移至孔Ⅲ中；
(5)抽滤洗涤孔Ⅱ和孔Ⅲ中微球，孔Ⅱ和孔Ⅲ均再加入DNA聚合酶Sequenase、缓冲液，孔Ⅱ中继续加入2μM菁染料Cy3标记ddATP、2μM FITC标记ddUTP、2μM菁染料Cy5标记ddGTP，孔Ⅲ中继续加入20μM核糖3'-OH被保护的dATP、20μM核糖3'-OH被保护的dUTP、20μM核糖3'-OH被保护的dGTP、20μM核糖3'-OH被保护的dCTP，每孔终体积10μl-50μl，混匀，37℃孵育60秒；
(6)按照步骤(3)至(5)的操作，将孔Ⅲ中微球洗涤、加核糖3'-OH去保护剂、重分为两孔，孔Ⅲ中加2μM菁染料Cy3标记ddATP、2μM FITC标记ddUTP、2μM菁染料Cy5标记ddGTP，孔Ⅳ中加20μM核糖3'-OH被保护的dATP、20μM核糖3'-OH被保护的dUTP、20μM核糖3'-OH被保护的dGTP、20μM核糖3'-OH被保护的dCTP，按此步骤（3）-（5）的步骤重复操作，连续制备76孔微球；
将步骤（6）制备的76孔微球洗涤，上样流式细胞仪进行检测即可一次性得到检测结果，当碱基为胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)时，会有荧光信号出现，当无荧光信号时即表示该碱基为胞嘧啶(C)。经数据分析，得到T790M核酸片段的测序结果为：GCGTG GACAACCCCC ACGTG TGCCG CCTGC TGGGC ATCTG CCTCA CCTCC ACCGT GCAGC TCATC AC(C→T,T790M)GCA GCTCA T，第67位的碱基同时出现C和T的结果，说明该核酸片段中同时存在野生型和突变型。
该EGFR基因T790M核酸片段样本Sanger法测序结果与本发明测序结果一致。
实施例3、并行检测EGFR基因exon 21 L858R、exon 18 G719X点突变的末端碱基流式荧光测序微球的制备
(1)从NCBI Genebank上查到EGFR基因包含exon 21 L858R、exon 18 G719X靶点的碱基序列，根据序列的互补序列分别设计单向引物，并在单向引物末端进行生物素修饰，经生物素修饰的exon 21 L858R单向引物为：5’TGTCAAGATCACAGATTTTGGGC3’；经生物素修饰的exon 18 G719X单向引物为：5’CTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTG3’，将生物素修饰的单向引物分别包被在直径约3μm的PE-Cy5编码的链霉亲和素修饰的两群聚苯乙烯微球表面；
(2)96孔滤板孔Ⅰ、Ⅱ均加入DNA聚合酶klenow片段、exon 21 L858R片段(野生型质粒DNA片段)与exon 18 G719X片段(野生型/突变型质粒DNA片段的混合物)的混合样本的多重不对称PCR产物、缓冲液，孔Ⅰ中继续加入2000个exon 21 L858R引物包被微球、2000个exon18 G719X引物包被微球、5μM菁染料Cy3标记ddATP、5μM FITC标记ddUTP，孔Ⅱ中继续加入20000个exon 21 L858R引物包被微球、20000个exon 18 G719X引物包被微球、5μM核糖3'-OH被保护的dATP、5μM核糖3'-OH被保护的dUTP、5μM核糖3'-OH被保护的dGTP、5μM核糖3'-OH被保护的dCTP，每孔终体积10μl-50μl，混匀，37℃孵育15分钟；
(3)抽滤洗涤孔Ⅱ中微球，再加入核糖3'-OH去保护剂，混匀；
(4)孔Ⅱ中留存含2000个微球的微球液，其余微球液移至孔Ⅲ中；
(5)抽滤洗涤孔Ⅱ和孔Ⅲ中微球，孔Ⅱ和孔Ⅲ均再加入DNA聚合酶klenow片段、缓冲液，孔Ⅱ中继续加入5μM菁染料Cy3标记ddATP、5μM FITC标记ddUTP，孔Ⅲ中继续加入5μM核糖3'-OH被保护的dATP、5μM核糖3'-OH被保护的dUTP、5μM核糖3'-OH被保护的dGTP、5μM核糖3'-OH被保护的dCTP，每孔终体积10μl-50μl，混匀，37℃孵育15分钟；
(6)按照步骤(3)至(5)的操作，将孔Ⅲ中微球洗涤、加核糖3'-OH去保护剂、重分为两孔，孔Ⅲ加5μM菁染料Cy3标记ddATP、5μM FITC标记ddUTP，孔Ⅳ加5μM核糖3'-OH被保护的dATP、5μM核糖3'-OH被保护的dUTP、5μM核糖3'-OH被保护的dGTP、5μM核糖3'-OH被保护的dCTP，按此步骤（3）-（5）的步骤重复操作，连续制备10孔微球；
(7)将上述(2)、(5)、(6)中的“5μM菁染料Cy3标记ddATP、5μM FITC标记ddUTP”，更换为“5μM菁染料Cy3标记ddGTP、5μM FITC标记ddCTP”，按照步骤（2）-（6）的流程重复类似操作，连续制备10孔微球。
上述(6)中制得的10孔微球用于并行测序exon 21 L858R、exon 18 G719X片段中的胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)，上述(7)中制得10孔微球用于并行测序exon 21 L858R、exon18 G719X突变片段中的胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)。
将步骤（6）制备的10孔微球和步骤（7）制备的10孔微球洗涤，分别上样流式细胞仪进行检测，将所有检查结果进行整合，得到exon 21 L858R核酸片段的测序结果为：TGGCCAAACT；exon 18 G719X核酸片段的测序结果为：G(G→A,G719X)GCTC CGGTG。第一位碱基的检测结果如图4所示，exon 21 L858R核酸片段的起始第一位碱基为T，不存在突变；而exon 18 G719X片段的起始第一位碱基同时出现G和A，说明该核酸片段中同时存在野生型和突变型。
该EGFR基因核酸片段样本Sanger测序法结果与本发明测序结果一致。

Claims (10)

1.一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)将待测核酸片段互补序列的单向引物包被在微球表面，形成引物包被的微球；
(2)将引物包被的微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液混合，得混合物，将该混合物分为两份，其中一份混合物中加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，另一份的混合物中加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；
（3）取上一步加入核糖3'-OH被保护的dNTP进行孵育的微球，洗涤后加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；
（4）将上一步的微球洗涤，分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶和缓冲液混合，所得混合物中再加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶和缓冲液混合，所得混合物中再加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；
（5）重复上述（3）和（4）的步骤，测序待测核酸片段n个碱基共需连续制备n群微球，共得到加入荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的n群微球；
（6）如果利用上述步骤（5）的n群微球无法检测出所有的碱基，则替换步骤（2）和（4）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，重复步骤（2）-（5）继续制备微球，共得到4×n或3×n或2×n群微球，步骤（5）和（6）中得到的4×n、3×n、2×n或n群微球即为能够实现待测核酸片段测序的末端碱基流式荧光测序微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP、ddGTP、ddCTP和ddUTP/ddTTP中的至少一种；
优选的，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、dGTP、dCTP和dUTP/dTTP中的至少一种；
优选的，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、dTTP/dUTP、dGTP和dCTP的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：所述荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP被下述任意一种或多种的荧光物质进行标记：异硫氰酸荧光素、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor700、菁染料Cy5、德克萨斯红、菁染料Cy3、菁染料Cy7、羟基荧光素、萤光黄、菁染料Cy5.5、罗丹明110、ROX、罗丹明6G、TAMRA。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：步骤（2）和（4）中加入任意两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，得到n群微球，然后将步骤（2）和（4）中的两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP替换为另两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，重复步骤（2）-（5），得到n群微球，共得2n群微球。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)将待测核酸片段互补序列的单向引物包被在微球表面，形成引物包被的微球；
(2)容器Ⅰ、Ⅱ中均加入步骤（1）得到的引物包被微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液，容器Ⅰ中继续加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，所得测序微球记为A1；容器Ⅱ中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP和荧光标记的ddTTP/ddUTP，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；
（3）洗涤容器Ⅱ中微球后，再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；
（4）留存部分微球在容器Ⅱ中，其余微球从容器Ⅱ中移至容器Ⅲ中；洗涤微球，容器Ⅱ和容器Ⅲ均再加入核酸聚合酶、缓冲液，容器Ⅱ中继续加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，所得测序微球记为A2；容器Ⅲ中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP和荧光标记的ddTTP/ddUTP，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dTTP/dUTP，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；
（5）不断重复类似（3）和（4）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为An，其中n为待测核酸片段的碱基数目；
（6）容器①、②中均加入步骤（1）得到的引物包被微球、核酸聚合酶、待测核酸片段互补序列和缓冲液，容器①中继续加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，所得测序微球记为B1；容器②中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；
（7）洗涤容器②中微球后，再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；
（8）留存部分微球在容器②中，其余微球从容器②中移至容器③中；洗涤微球，容器②和容器③中均再加入核酸聚合酶、缓冲液，容器②中继续加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，所得测序微球记为B2；容器③中继续加入核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddGTP和荧光标记的ddCTP，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dGTP和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dCTP，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；
（9）不断重复类似（7）和（8）的步骤，共得到n群加入荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP进行孵育的测序微球，最后一群测序微球记为Bn，其中n为待测核酸片段的碱基个数，A1-An和B1-Bn这些微球即为末端碱基流式荧光测序微球。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征是：所述微球为尺寸均一的微球、尺度编码的微球、不含荧光的微球或荧光编码的微球；
优选的，微球的直径为0.5-50μm ，更优选为1-10μm；
优选的，所述微球为经羧基、氨基、羟基、酰肼基、醛基、氯甲基、环氧乙烷、抗体、核酸适配体、链霉亲和素、poly T、poly A、poly G、poly C、poly U和甲基化CpG结合结构域蛋白中的至少一种进行修饰的微球，更优选为羧基化微球。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征是：所述待测核酸片段为单链DNA片段、变性的双链DNA片段以及单链与双链DNA片段混合物中的至少一种；
优选的，所述核酸聚合酶为DNA依赖的DNA聚合酶；
优选的，所述单向引物是经氨基、羧基、地高辛、生物素、poly A、poly G、poly C、polyT、poly U和甲基中的至少一种进行修饰的单向引物，更优选为经氨基修饰的单向引物。
8.根据权利要求1、2或5所述的制备方法，其特征是：每次孵育时，孵育体系中微球的终浓度均为5×102个/ml-2.5×108个/ml，核酸聚合酶的终浓度均为0.2-240 units/ml，每种荧光标记的ddNTP的终浓度均为0.02-200μmol/L，每种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP的终浓度均为0.02-200μmol/L，每种核糖3'-OH被保护的dNTP的终浓度均为0.02-200μmol/L。
9.根据权利要求1或8所述的制备方法，其特征是：孵育在下述容器中进行：24孔板孔、24孔滤板孔、96孔板孔、96孔滤板孔、384孔板孔、384孔滤板孔、离心管或EP管，每次孵育所用的容器相同或者不同；
优选的，每次孵育的温度均为0-100℃，更优选为37-45℃；
优选的，每次孵育的时间均为10s-60min，更优选为50-100s；
优选的，每次孵育时，孵育体系的总体积均为10μl-10ml，更优选为10μl-50μl。
10.一种核酸片段的测序方法，其特征是：按照权利要求1-9中任一项所述的末端碱基流式荧光测序微球的制备方法制得所需的测序微球，将测序微球采用流式细胞仪进行检测，得到待测核酸片段的碱基序列。
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