CN103667469A - 一种基于万能碱基的dna测序方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种基于万能碱基的DNA测序方法。本发明利用万能碱基构建四种带有不同的荧光基团的n聚核苷酸；然后利用万能碱基构成的n聚核苷酸和DNA连接酶对DNA模板链进行测序延伸反应；测序延伸反应结束后，读取荧光信息，再用RNA酶切除带有荧光基团的万能碱基；多次循环测序反应，直至得到DNA模板的完整序列。本发明无需要构建4n的寡聚核苷酸库，方法简单可靠，成本优势明显；本方法适用于短片段DNA的大规模实验室测序和基于循环芯片测序技术的高通量DNA测序。

Description

一种基于万能碱基的DNA测序方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于万能碱基的DNA测序方法。
背景技术
DNA序列被称之为生命密码。有效而准确地获取这些密码，是生命科学研究的基本信息获得手段和赖以发展的根本基础。英国生化学家Sanger在20世纪70年代中期发明的双脱氧链末端终止法测序技术是目前应用最广泛的测序技术。Sanger测序法的原理是利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
针对基因组测序，目前发展了多种方法，从最先开始的基于Sanger测序法的凝胶电泳测定技术包括后来改进的毛细管电泳测序技术，到非凝胶电泳测序技术的DNA杂交测序(SBH,sequencing by hybridization)和合成测序法（SBS，sequencing by synthesis）。2005年前后，高通量测序技术进入市场，彻底改变了测序的规模化进程。高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照一个参比基因组(reference genome)，高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序。
目前，代表世界合成测序发展水平的主流测序仪器包括Illumina测序仪、Roche454测序仪、AB SOLiD测序仪和HeliScope测序仪。所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略—循环芯片测序法（cyclic-array sequencing）。所述循环芯片测序法为：首先将基因组DNA随机分割成小片段DNA分子，然后在这些小片段DNA分子的末端连接上普通的接头，最后用这些小片段DNA分子制成芯片；每一个芯片簇（colony）中都含有一个小片段DNA分子的许多个拷贝；许多这样的簇集合在一起就形成了芯片，这样一次测序反应就可以同时对众多的簇进行测序；然后与Sanger法类似，通过对每一个延伸反应产物末端荧光颜色进行识别来读取出DNA序列；重复上述步骤就能获得完整的序列。上述方法有一个共同点，真正的测序反应本身和传统测序法一样，是由重复的聚合酶或连接酶酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成。
万能碱基(Universal Bases)是一类重要的化合物，它可以没有选择性地与所有的天然基地配对,所产生的DNA双链与完全天然碱基组成的DNA双链具有相似的稳定性。20世纪90年代以来，一些化合物作为万能碱基进行了研究，包括硝基吡咯类化合物、唑甲酰胺类化合物、芳香***类化合物。万能碱基在PCR引物和微阵列探针中已经得到了实际应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于万能碱基的DNA测序方法。
为实现上述发明目的，本发明技术方案为：
一种基于万能碱基的DNA测序方法，包括如下步骤：
（1）利用万能碱基构建如式I所示n聚核苷酸，其中N为天然碱基A、T、G、或C，U为万能碱基，F为荧光基团，n大于3；当N分别为不同的天然碱基时，得到四种n聚核苷酸；
所述四种n聚核苷酸分别带有不同的荧光基团；所述四种n聚核苷酸的万能碱基为3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、3-甲酰胺基-5-硝基吲哚、或4-硝基-1-氢咪唑；
Figure BDA0000426566480000031
（2）将结合有引物的DNA微阵列浸入到DNA连接酶缓冲液中，加入连接试验混合液，所述连接试验混合液中含有上述四种n聚核苷酸和DNA连接酶，于45～50℃孵育30～60分钟；
（3）将经步骤（2）处理过的DNA微阵列用洗液清洗，以除去未反应的寡核苷酸，将清洗后的微阵列用空气吹干，读取DNA微阵列的荧光数据，得到碱基序列信息；
（4）待荧光数据读取结束后，将DNA微阵列置在切割缓冲液中，加入RNA酶，于37℃孵育30～60分钟；
（5）将经步骤（4）处理过的DNA微阵列用洗液清洗，清洗后的DNA微阵列用空气吹干；
（6）重复上述步骤（2）～（5），直至得到待测DNA的完整序列。
上述方案中，所述荧光基团为Cy3、Cy5、Fluorescein、Alexa594、Atto488、Oregon Green488、或其他可标记DNA的荧光基团。
上述方案中，所述DNA连接酶为T4连接酶和\或T3连接酶。
上述方案中，所述洗液清洗为利用四种洗液依次清洗，所述四种洗液分别为：洗液1：0.2%SDS/1×SSC；洗液2：1×SSC；洗液3：0.1×SSC；洗液4：超纯水。
上述方案中，所述切割缓冲液为：10mM Tris，5mM EDTA，2mM DTT，pH7.0。
上述方案中，所述连接试验混合液为：8μl1×DNA连接酶缓冲液，18pmolβ-珠蛋白模板（β-globin template），0.8μl50%PEG4000，0.8μl(400U=6Weiss U)DNA连接酶，0.8μl(10U)多聚核苷酸激酶(ThermoFisher)，四种荧光标记的10聚3-硝基吡咯核苷酸各50pmol。
本发明中，万能碱基选自3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、3-甲酰胺基-5-硝基吲哚、或4-硝基-1-氢咪唑，其结构式如下：
Figure BDA0000426566480000041
本发明中，利用万能碱基构建四种n聚核苷酸，其制备方法参照国际专利申请WO2004/018493中所述的制备方法。
本发明的有益效果：
（1）本发明无需构建4n的寡聚核苷酸数据库，四种万能碱基构建的寡聚核苷酸既能实现循环测序，在降低测序成本方面具有明显优势；同时避免了繁琐的实验步骤，降低构建寡聚核苷酸数据库失败的风险；
（2）本发明只需要很常见的生化试剂，并且避免了为进行下一步的延伸而去除去标记的核苷酸及反应引物所需的复杂的特殊化学试剂；本发明无需使用链终止子ddNTP，降低成本，并且减少了掺入的误差；
（3）本发明是一种可靠并且简单廉价的方法，适用于短片段DNA的大规模实验室测序和基于循环芯片测序技术的高通量DNA测序。
附图说明
图1为实施例1中四次循环测序得到的产物的聚丙酰胺凝胶电泳图，图中泳道1为第一次测序结果，泳道2为第二次测序结果，泳道3为第三次测序结果，泳道4为第四次测序结果。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。
实施例1
本实施例中，所述10聚3-硝基吡咯寡核苷酸是以3-硝基吡咯作为万能碱基按照国际专利申请WO2004/018493中所述制备方法制备的。并用Atto488标记含A链，Cy3标记含G链，Cy5标记含C链，Oregon Green488标记含T链，得到四种荧光标记的10聚核苷酸。
一种基于万能碱基的DNA测序方法，包括如下步骤：
（1）选取一条18聚核苷酸（3'-TACCATTCTGCTTTTATT-5'amino），其5'端修饰着氨基，通过点样的办法在有醛基修饰的基片上固定18聚核苷酸微阵列，氨基与醛基结合后，用清洗缓冲液（0.3XSSC/0.1%吐温）洗去未结合的寡聚核苷酸，采用氢氧化钠（2%,w/v)变性的办法去除未固定的DNA链，得到单一的模板链，将修饰保护的引物与固定的DNA模板链杂交，并确保模板链的3'端突出5～6个碱基以上。
（2）将上述微阵列浸入10μL T4连接酶缓冲液中，所述缓冲液为：50mMTris–HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，25ug/ml BSA，pH7.5；在37℃条件下培育1h。
（3）再加入连接试验混合液，所述连接试验混合液为：8μl1×T4连接酶缓冲液，18pmolβ-珠蛋白模板（β-globin template），0.8μl50%PEG4000，0.8μl(400U=6Weiss U)T4DNA连接酶，0.8μl(10U)T4多聚核苷酸激酶(ThermoFisher)，四种荧光标记的10聚3-硝基吡咯核苷酸各50pmol；在46℃条件下培育1h。
（4）将经步骤（3）处理过得微阵列用四种60℃的洗液依次清洗，洗液1：0.2%SDS/1×SSC；洗液2：1×SSC；洗液3：0.1×SSC；洗液4：超纯水。
（5）将清洗后的基片用空气吹干，室温下用4种颜色扫描，读取该次延伸中荧光数据，得到碱基序列信息；接着将微阵列置于12μl切割缓冲液中，加入2μl RiboShredder RNase Blend，37℃培育1h，用RNA酶切除掉延伸的荧光标记的万能寡聚核苷酸片断；所述切割缓冲液为：10mM Tris，pH7.0，5mM EDTA，2mM DTT。
（6）将经步骤（5）处理的基片用四种60℃的洗液依次清洗，洗液1：0.2%SDS/1×SSC；洗液2：1×SSC；洗液3：0.1×SSC；洗液4：超纯水。
（7）重复上述步骤（2）～（6），在连接酶的作用下，填充DNA模板链的下一个互补位置，进行下一步延伸，直至得到待测DNA的完整序列。
图1为本实施例的四次循环测序得到的产物的聚丙酰胺凝胶电泳图，从图1的电泳条带结果可以看出，1～4泳道分别为完成1、2、3、4次循环的DNA产物电泳图，每完成一次测序循环得到的DNA产物，会依次增加一个碱基，DNA产物分子量相应增加，泳道1～4的DNA分子量呈现梯度增加。图1表明3-硝基吡咯寡聚核苷酸在连接酶作用下可以有效实现DNA测序。
实施例2
本实施例中，所述10聚5-硝基吲哚寡核苷酸是以5-硝基吲哚作为万能碱基、按照国际专利申请WO2004/018493中所述制备方法制备的、并用四种不同的市售荧光团（Molecular Probes Inc.)标记得到10聚核苷酸。
本实施例一种基于万能碱基的DNA测序方法，其步骤与实施例1大致相同，不同之处为：
a.采用Atto488标记含A链，Cy3标记含G链，Cy5标记含C链，OregonGreen488标记含T链，得到四种荧光标记的10聚5-硝基吲哚核苷酸进行测序反应；
b.步骤（3）所述连接试验混合液中含有的是T3DNA连接酶，培育条件为：20℃培育45分钟；所述T3连接酶缓冲液为：50mM Tris-HCl,300mM NaCl,0.5mM ATP,1mM DTT,pH8.0；
c.步骤（5）的培育条件为：37℃，培育45分钟。
本实施例的四次循环测序得到的DNA产物的聚丙酰胺凝胶电泳图与实施例的图1无显著区别，说明10聚5-硝基吲哚寡核苷酸在连接酶作用下可以有效实现DNA测序。
实施例3
本实施例中，所述10聚3-甲酰胺基-5-硝基吲哚寡核苷酸是以3-甲酰胺基-5-硝基吲哚作为万能碱基、按照国际专利申请WO2004/018493中所述制备方法制备的、并用四种不同的市售荧光团（Molecular Probes Inc.)标记得到10聚核苷酸。
本实施例一种基于万能碱基的DNA测序方法，其步骤与实施例1大致相同，不同之处为：
a.采用Alexa594标记含A链，Cy3标记含G链，Cy5标记含C链，OregonGreen488标记含T链，得到四种荧光标记的10聚3-甲酰胺基-5-硝基吲哚核苷酸进行测序反应；
b.步骤（3）连接试验混合液中含有的是T4连接酶和T3连接酶，培育条件为：32℃，培育30分钟；所述缓冲液为：50mM Tris–HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，25ug/ml BSA，pH7.5；
c.步骤（5）培育条件为：37℃，培育30分钟。
本实施例的四次循环测序得到的DNA产物的聚丙酰胺凝胶电泳图与实施例的图1无显著区别，说明10聚3-甲酰胺基-5-硝基吲哚寡核苷酸在连接酶作用下可以有效实现DNA测序。
实施例4
本实施例中，所述10聚4-硝基1-氢咪唑寡核苷酸是以4-硝基1-氢咪唑作为万能碱基、按照国际专利申请WO2004/018493中所述制备方法制备的、并用四种不同的市售荧光团（Molecular Probes Inc.)标记得到10聚核苷酸。
本实施例一种基于万能碱基的DNA测序方法，其步骤与实施例1大致相同，不同之处为：使用Alexa594标记含A链，Cy3标记含G链，Cy5标记含C链，Oregon Green488标记含T链，得到四种荧光标记的10聚4-硝基1-氢咪唑核苷酸进行测序反应。
本实施例的四次循环测序得到的DNA产物的聚丙酰胺凝胶电泳图与实施例的图1无显著区别，说明10聚4-硝基1-氢咪唑寡核苷酸在连接酶作用下可以有效实现DNA测序。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）利用万能碱基构建如式I所示n聚核苷酸，其中N为天然碱基A、T、G、或C，U为万能碱基，F为荧光基团，n大于3；当N分别为不同的天然碱基时，得到四种n聚核苷酸；
所述四种n聚核苷酸分别带有不同的荧光基团；所述四种n聚核苷酸的万能碱基为3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、3-甲酰胺基-5-硝基吲哚、或4-硝基-1-氢咪唑；
Figure FDA0000426566470000011
（2）将结合有引物的DNA微阵列浸入到DNA连接酶缓冲液中，加入连接试验混合液，所述连接试验混合液中含有上述四种n聚核苷酸和DNA连接酶，于45～50℃孵育30～60分钟；
（3）将经步骤（2）处理过的DNA微阵列用洗液清洗，以除去未反应的寡核苷酸，将清洗后的微阵列用空气吹干，读取DNA微阵列的荧光数据，得到碱基序列信息；
（4）待荧光数据读取结束后，将DNA微阵列置在切割缓冲液中，加入RNA酶，于37℃孵育30～60分钟；
（5）将经步骤（4）处理过的DNA微阵列用洗液清洗，清洗后的DNA微阵列用空气吹干；
（6）重复上述步骤（2）～（5），直至得到待测DNA的完整序列。
2.根据权利要1所述基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，所述荧光基团为Cy3、Cy5、Fluorescein、Alexa594、Atto488、或Oregon Green488。
3.根据权利要1所述基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，所述DNA连接酶为T4连接酶和\或T3连接酶。
4.根据权利要1所述基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，所述洗液清洗为利用四种洗液依次清洗，所述四种洗液分别为：洗液1：0.2%SDS/1×SSC；洗液2：1×SSC；洗液3：0.1×SSC；洗液4：超纯水。
5.根据权利要1所述基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，所述切割缓冲液为：10mM Tris，5mM EDTA，2mM DTT，pH7.0。
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